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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole décrit comment les billes de compensation à base de porphyrine pour la cytométrie en flux sont préparées par la réaction de billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines avec le TCPP de porphyrine et le réactif de couplage amide EDC. Une procédure de filtration est utilisée pour réduire les sous-produits particulaires.

Résumé

La cytométrie en flux peut rapidement caractériser et quantifier diverses populations cellulaires en fonction des mesures de fluorescence. Les cellules sont d’abord colorées avec un ou plusieurs réactifs fluorescents, chacun fonctionnalisé avec une molécule fluorescente différente (fluorophore) qui se lie sélectivement aux cellules en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques, telles que l’expression de l’antigène de surface cellulaire. L’intensité de fluorescence de chaque réactif lié aux cellules peut être mesurée sur le cytomètre en flux à l’aide de canaux qui détectent une gamme spécifiée de longueurs d’onde. Lorsque plusieurs fluorophores sont utilisés, la lumière des fluorophores individuels déborde souvent dans des canaux de détection indésirables, ce qui nécessite une correction des données d’intensité de fluorescence dans un processus appelé compensation.

Des particules de contrôle de compensation, généralement des billes de polymère liées à un seul fluorophore, sont nécessaires pour chaque fluorophore utilisé dans une expérience de marquage cellulaire. Les données des particules de compensation du cytomètre en flux sont utilisées pour appliquer une correction aux mesures d’intensité de fluorescence. Ce protocole décrit la préparation et la purification de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par covalence avec le réactif fluorescent méso-tétra(4-carboxyphényl) porphine (TCPP) et leur application dans la compensation de cytométrie en flux. Dans ce travail, des billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine ont été traitées avec du TCPP et le réactif de couplage amide EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N′-éthylcarbodiimide) à pH 6 et à température ambiante pendant 16 h avec agitation. Les billes TCPP ont été isolées par centrifugation et remises en suspension dans un tampon de pH 7 pour le stockage. Les particules liées au TCPP ont été observées comme sous-produit. Le nombre de ces particules pourrait être réduit à l’aide d’un protocole de filtration facultatif. Les billes TCPP résultantes ont été utilisées avec succès sur un cytomètre en flux pour la compensation dans des expériences avec des cellules d’expectorations humaines marquées avec plusieurs fluorophores. Les billes du RRCT se sont avérées stables après avoir été conservées au réfrigérateur pendant 300 jours.

Introduction

Les porphyrines intéressent depuis de nombreuses années le domaine biomédical en raison de leur fluorescence et de leurs propriétés de ciblage tumoral 1,2,3. Les applications thérapeutiques telles que la thérapie photodynamique (PDT) et la thérapie sonodynamique (SDT) impliquent l’administration systémique d’une porphyrine à un patient cancéreux, l’accumulation du médicament dans la tumeur et l’exposition localisée de la tumeur à une lumière laser d’une longueur d’onde spécifique ou à des ultrasons. L’exposition à la lumière laser ou aux ultrasons conduit à la génération d’espèces réactives de l’oxygène par la porphyrine et à la mort cellulaire subséquente 4,5. Dans le diagnostic photodynamique (TED), la fluorescence de la porphyrine est utilisée pour distinguer les cellules cancéreuses des cellules normales6. Dans ce contexte, la protoporphyrine IX, une porphyrine fluorescente naturelle qui s’accumule dans les tumeurs lors de l’injection systémique ou locale de son précurseur, l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), est utilisée pour identifier les tumeurs stromales gastro-intestinales, le cancer de la vessie et le cancer du cerveau 7,8. Plus récemment, le traitement au 5-ALA a été exploré comme approche pour détecter une maladie résiduelle minimale dans le myélome multiple9. Notre laboratoire utilise la tétraarylporphyrine TCPP (5,10,15,20-tétrakis-(4-carboxyphényl)-21,23 H-porphine) pour sa capacité à colorer sélectivement les cellules cancéreuses du poumon et les cellules associées au cancer dans des échantillons d’expectorations humaines, une propriété qui a été exploitée dans les tests diagnostiques à base de lames et de cytométrie en flux10.

Certaines porphyrines sont bifonctionnelles en ce sens qu’elles peuvent être utilisées comme agents thérapeutiques et diagnostiques 2,11. Dans la recherche biomédicale, ces porphyrines bifonctionnelles sont utilisées pour évaluer comment leur capacité à cibler sélectivement et à tuer les cellules cancéreuses est fonction de leur structure ainsi que la façon dont elle est affectée par la présence d’autres composés 12,13,14,15,16. L’absorption cellulaire des porphyrines et leur cytotoxicité peuvent être mesurées sur une plate-forme cytométrique en flux de manière à haut débit. Les spectres d’absorption et d’émission des porphyrines fluorescentes sont complexes, mais la plupart des plateformes cytométriques en flux sont équipées pour les identifier correctement. Le spectre d’absorption des porphyrines fluorescentes est caractérisé par une forte bande d’absorption comprise entre 380 et 500 nm, connue sous le nom de bande Soret. Deux à quatre bandes d’absorption plus faibles sont généralement observées dans la gamme 500-750 nm (bandes Q)17. Un laser bleu de 488 nm, présent dans la plupart des cytomètres en flux, ou un laser violet (405 nm) peut générer une lumière de la longueur d’onde appropriée pour exciter les porphyrines. Les spectres d’émission des porphyrines affichent généralement des pics compris entre 600 et 800 nm18, ce qui entraîne très peu de chevauchement spectral avec l’isothiocyanate de fluorescéine ou les fluorophores de phycoérythrine (PE), mais un chevauchement considérable avec d’autres fluorophores souvent utilisés, tels que l’allophycocyanine (APC), ainsi que des fluorophores en tandem, tels que PE-Cy5 et autres. Par conséquent, lors de l’utilisation de porphyrines dans des essais de cytométrie en flux multicolore, les contrôles monofluorophores sont essentiels pour corriger adéquatement le débordement de la fluorescence dans des canaux autres que celui désigné pour mesurer la fluorescence de la porphyrine.

Idéalement, les témoins monofluorophores utilisés pour calculer la matrice de débordement pour un panel de fluorophores (également appelés « témoins de compensation ») devraient être constitués du même type de cellule que l’échantillon. Cependant, l’utilisation de l’échantillon à cette fin n’est pas optimale s’il y a très peu d’échantillon au départ ou si la population cible au sein de l’échantillon est très petite (par exemple, si l’on veut examiner une maladie résiduelle minimale ou des cellules cancéreuses aux premiers stades de la maladie). Une alternative utile aux cellules est les billes couplées avec le même fluorophore qui est utilisé pour analyser l’échantillon. Beaucoup de ces perles sont disponibles dans le commerce; Ces billes sont soit prémarquées avec le fluorophore désiré (billes spécifiques du fluorophore prémarquées)19,20, soit un anticorps marqué par fluorescence peut y être attaché (billes de capture d’anticorps)20,21. Bien que des billes de compensation commerciales soient disponibles pour de nombreux fluorophores, de telles billes ne sont pas disponibles pour les porphyrines, malgré leur utilisation croissante dans la recherche fondamentale et clinique.

En plus de la préservation des échantillons et des populations positives par rapport aux populations négatives de taille appropriée, les autres avantages de l’utilisation de billes comme contrôles compensatoires sont la facilité de préparation, la faible fluorescence de fond et l’excellente stabilité dans le temps22. L’inconvénient potentiel de l’utilisation de billes comme contrôle de compensation est que le spectre d’émission de l’anticorps fluorescent capturé sur les billes peut différer de celui du même anticorps utilisé pour marquer les cellules. Cela peut être d’une importance particulière lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral20. Par conséquent, le développement de billes en tant que contrôle de compensation doit être effectué sur le cytomètre en flux qui sera utilisé pour le test pour lequel les billes sont développées. De plus, le développement des billes doit inclure une comparaison avec des cellules marquées avec le même réactif de coloration fluorescente.

Ici, nous décrivons la préparation de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par amine TCPP, dont l’intensité médiane de fluorescence dans le canal de détection était comparable à celle des cellules marquées TCPP dans les expectorations, et leur utilisation comme contrôles de compensation pour la cytométrie en flux. L’autofluorescence des billes équivalentes non fonctionnalisées était suffisamment faible pour être utilisée comme témoins de compensation de fluorescence négative. De plus, ces billes ont démontré une stabilité en stockage pendant près de 1 an.

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Protocole

Toutes les procédures doivent être effectuées à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation de la solution mère du TCPP, 1,0 mg/mL

NOTE: Cela peut être préparé mensuellement.

  1. À l’aide d’une balance analytique, d’une spatule et d’un papier de pesée, peser de 49,0 à 50,9 mg de RRCT. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme. Mettez de côté la quantité mesurée de TCPP à l’abri de la lumière.
    REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.
  2. Déterminer les quantités requises d’eau purifiée et d’isopropanol (IPA) à partir du tableau 1 en fonction de la quantité de TCPP pesée à l’étape 1.1 . Ajouter l’eau purifiée et l’isopropanol à un bécher en verre de 100 ml et couvrir de parafilm pour protéger de l’évaporation.
  3. Déterminer la quantité requise de bicarbonate de sodium à partir du tableau 1 en fonction de la quantité de RRCT pesée à l’étape 1.1 .
  4. À l’aide de la balance analytique, de la spatule et du papier de pesée, peser la quantité requise de bicarbonate de sodium déterminée à l’étape 1.3. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme.
    REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.
  5. Ajouter le bicarbonate de sodium dans le bécher de 100 mL contenant de l’eau purifiée et de l’isopropanol. Couvrir la solution avec du parafilm pour protéger de l’évaporation.
  6. Placer la solution de l’étape 1.5 sur une plaque d’agitation et remuer jusqu’à dissolution (environ 10 min)
  7. Mesurer le pH pour s’assurer que la solution contenant du bicarbonate de sodium de l’étape 1.6 a un pH compris entre 9 et 10.
  8. Ajouter lentement le TCPP pesé à l’étape 1.1 à la solution de l’étape 1.7 et continuer à agiter jusqu’à dissolution (~30 min). Protéger de la lumière pendant cette étape.
  9. Conserver dans un contenant en verre ou en polypropylène à température ambiante et à l’abri de la lumière.

2. Préparation de l’acide 2-(N-morpholino)-éthanesulfonique (MES) et de la solution tampon de sel hémisodique, 0,1 M, pH 6,0-6,2 (« tampon MES »)

NOTE: Celui-ci doit être préparé le jour de l’utilisation et conservé à température ambiante.

  1. Pesez 2,50 g de sel hémisodique MES et ajoutez-le dans une bouteille en plastique de 150 mL.
  2. Ajouter 121 mL d’eau purifiée et dissoudre par agitation manuelle jusqu’à ce qu’aucun solide ne soit visible.
  3. Mesurer le pH du tampon MES pour s’assurer qu’il se situe entre 6 et 6,2.
  4. Conserver à température ambiante pour une utilisation le jour même.

3. N-(3-Diméthlyaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) en poudre

  1. Sortez la poudre EDC du congélateur et laissez-la reposer à température ambiante jusqu’à utilisation à l’étape 5.

4. Combinaison de billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine avec une solution TCPP

  1. Ajouter 4,3 mL de la solution tampon MES 0,1 M préparée à l’étape 2 dans un tube en polypropylène de 15 mL.
  2. Vortex la suspension de billes de polystyrène fonctionnalisée à l’amine (10 μm, 2,5 % p/v) pendant 60 s à vitesse maximale.
  3. Ajouter 288 μL de cette suspension de billes fraîchement vortex au tampon MES à partir de l’étape 4.1.
  4. Vortex la solution MES/bille pendant 15 s à vitesse maximale.
  5. Vortex la solution TCPP à 1 mg/mL préparée à l’étape 1 pendant 60 s à vitesse maximale.
  6. Ajouter 1,20 mL de cette solution mère TCPP fraîchement vortée à la suspension MES/talon de l’étape 4.4.
  7. Vortex la suspension MES/perle/TCPP pendant 15 s à la vitesse maximale.
  8. Couvrir le tube avec du papier d’aluminium pendant la préparation de la solution EDC.

5. Préparation de solution mère d’hydrocholoride (HCl) de N-(3-diméthlyaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC)

REMARQUE : La solution EDC est périssable et doit être utilisée immédiatement après sa préparation.

  1. Ajouter 20,0 mL d’eau purifiée dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  2. Peser 200 mg de HCl EDC à partir de l’étape 3 et l’ajouter à l’eau (étape 5.1).
  3. Vortex l’EDC HCL pendant 15 s à vitesse maximale pour générer une solution claire.

6. Préparation de la solution de travail HCl/MES d’EDC

REMARQUE : La solution HCl/MES d’EDC est périssable et doit être utilisée immédiatement après sa préparation.

  1. Ajouter 54,0 mL de solution tampon MES (préparée à l’étape 2) dans une bouteille de plastique de 150 mL.
  2. Ajouter 6,0 mL de la solution mère de HCl EDC (préparée à l’étape 5) à la solution tampon MES et mélanger en agitant pendant 10 s.

7. Étiquetage des billes avec le RRCT

  1. Ajouter 4,5 mL de solution de travail EDC (à partir de l’étape 6) au tube en polypropylène de 15 ml contenant les billes et le TCPP dans le tampon MES (étape 4.7).
  2. Placer le tube dans un rotateur inverseur à 35 tr/min pendant 16 h à température ambiante et à l’abri de la lumière.
  3. Centrifuger le tube à température ambiante pendant 10 min à 1 000 × g.
  4. Aspirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 0,8 mL de solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks.
  5. Transférer la solution de billes dans un flacon de polypropylène ambré à l’aide d’une pipette de 1 mL et conserver à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
    REMARQUE: Les perles sont stables pendant au moins 3 mois à ce stade.

8. Contrôle de la qualité (CQ) des billes du RRCT par cytométrie en flux

REMARQUE : Le CQ devrait être axé sur la question de savoir si l’intensité médiane de fluorescence (ICM) des billes du TCPP est suffisamment brillante pour l’utilisation prévue et la quantité de particules générées par la procédure. Voir la section des résultats représentatifs pour plus de détails.

  1. Étiquetez un tube en polystyrène de 5 ml comme « billes TCPP négatives ».
    REMARQUE: Les billes négatives sont différentes des perles fonctionnalisées aux amines utilisées pour l’étiquetage. Voir le tableau des matériaux.
  2. Étiquetez un autre tube comme « perles TCPP positives ».
  3. Étiquetez un autre tube comme « Perles arc-en-ciel ».
  4. Aliquote 300 μL d’HBSS glacé dans les tubes étiquetés avec « billes TCPP négatives » et « billes TCPP positives ».
  5. Ajoutez 500 μL de HBSS glacé dans le tube étiqueté « Perles arc-en-ciel ».
  6. Vortex brièvement la suspension de billes de polystyrène non fonctionnalisée (non étiquetée) à vitesse maximale (2-3 s) et ajoutez-en 10 μL dans le tube étiqueté « perles négatives TCPP ».
  7. Vortex la suspension de billes marquée TCPP (finalisée à l’étape 7.5) brièvement à la vitesse maximale, et ajoutez-en 3 μL dans le tube « Perles positives TCPP ».
  8. Faites un vortex de la suspension de perles arc-en-ciel brièvement à vitesse maximale et ajoutez-en deux gouttes dans le tube « Perles arc-en-ciel ».
  9. Gardez tous les tubes sur de la glace, couverts et protégés de la lumière.
  10. Initier les procédures de démarrage quotidiennes appropriées du cytomètre en flux et effectuer un contrôle qualité pour vérifier l’alignement optimal des fluides et du laser.
    NOTE: Pour cette partie du protocole, il est supposé que l’opérateur est formé à l’utilisation du cytomètre en flux disponible, y compris les procédures de normalisation de la diffusion de la lumière et de l’intensité de fluorescence, ainsi que les principes de base du calcul de la matrice de compensation correcte.
  11. Exécutez les perles Rainbow et les perles TCPP sans modifier les paramètres de tension entre les différentes exécutions.
    1. Courez et collectez 10 000 événements des perles arc-en-ciel.
    2. Effectuez un rinçage à l’eau et recueillez 10 000 occurrences de billes TCPP négatives.
    3. Effectuez un rinçage à l’eau et recueillez 10 000 occurrences de billes TCPP-positives.
    4. Effectuer un rinçage à l’eau de 1 min.
      REMARQUE : Il est important d’effectuer un rinçage à l’eau après avoir utilisé les billes du RRCT. Si le TCPP n’est pas rincé à partir des lignes du cytomètre, il est possible que le TCPP résiduel puisse marquer les cellules dans le tube suivant à acquérir.
    5. Effectuez les protocoles de nettoyage et d’arrêt appropriés spécifiques aux instructions du fabricant pour le cytomètre.
      REMARQUE : Pour des résultats représentatifs, voir la figure 1.

9. Filtration des billes

REMARQUE : Si le CQ des billes par cytométrie en flux (étape 8) montre une forte proportion de particules (70 % ou plus), envisagez de filtrer la suspension du cordon en utilisant le protocole ci-dessous (Figure 2).

  1. Ajouter 3,20 mL de HBSS glacé à 0,8 mL de la suspension de billes de TCPP finalisée à l’étape 7.5 (créant une dilution quintuple).
  2. Vortex la suspension de billes diluées à vitesse maximale pendant 15 s.
  3. Retirez le piston d’une seringue jetable de 5 mL.
  4. Installez la seringue avec un filtre à embout en fibre de verre (5 μm, 13 mm de diamètre).
  5. Ajouter 4 mL de HBSS à la seringue.
  6. Ajouter 0,5 mL de la suspension de billes diluées vortex (étape 9.2).
  7. Utilisez le piston pour filtrer la suspension à travers la seringue/filtre à environ 2 gouttes/s.
  8. Lavez les billes en aspirant 5 ml d’HBSS frais dans la seringue à travers le filtre à environ 2 gouttes/s.
  9. Poussez à nouveau le HBSS dans le conteneur à déchets à environ 2 gouttes/s.
  10. Pour retirer les billes du filtre, aspirez 5 ml supplémentaires d’HBSS frais dans la seringue à travers le filtre.
  11. Retirez délicatement le filtre de la seringue.
  12. Éjecter la suspension du cordon de la seringue dans un tube centrifuge conique de 50 mL.
  13. Replacez le filtre sur la seringue et répétez les étapes 9.10-9.12 quatre fois de plus. Jetez ensuite le filtre et la seringue.
  14. Répétez les étapes 9.2 à 9.13 jusqu’à ce que toutes les perles de l’étape 9.1 aient été filtrées. Utilisez une seringue neuve et filtrez à chaque fois.
  15. Centrifuger les suspensions filtrées de billes pendant 10 min à 1 000 × g à température ambiante.
  16. Aspirer le surnageant de chaque tube de 50 ml et remettre doucement les billes en suspension en les combinant dans 0,5 mL de HBSS frais.
  17. Transférer les billes à l’aide d’une micropipette p1 000 dans un nouveau flacon d’ambre, de verre ou de polypropylène et conserver à 4 °C.
  18. Répétez l’étape 8 pour déterminer si la proportion de particules liées au TCPP dans la suspension filtrée du cordon a diminué. Pour des résultats représentatifs, voir la figure 3.

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Résultats

Ce protocole pour l’étiquetage TCPP des billes est relativement rapide et efficace. La figure 1 montre un résultat représentatif du processus d’étiquetage des billes du TCPP, déterminé par cytométrie en flux. La figure 1A montre le profil normalisé des perles arc-en-ciel, tel qu’il a été détecté dans le canal approprié pour détecter le TCPP. Ces billes servent de CQ pour la normalisation des tensions laser pour la détection du TCPP par le cy...

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Discussion

Malgré les nombreuses applications des porphyrines dans le diagnostic et la thérapeutique du cancer2, il existe peu de littérature sur leur utilisation potentielle comme réactif cytométrique en flux pour l’identification des populations de cellules cancéreuses par rapport aux populations de cellules non cancéreuses dans les tissus humains primaires24,25,26. Nos recherches sur l’analyse cytomét...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs sont des employés de bioAffinity Technologies.

Remerciements

Nous tenons à remercier David Rodriguez pour son aide dans la préparation des figures et Precision Pathology Services (San Antonio, TX) pour l’utilisation de son cytomètre en flux Navios EX.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

Références

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