Perles modifiées par la porphyrine utilisées comme témoins de compensation en cytométrie en flux

Résumé

Le protocole décrit comment les billes de compensation à base de porphyrine pour la cytométrie en flux sont préparées par la réaction de billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines avec le TCPP de porphyrine et le réactif de couplage amide EDC. Une procédure de filtration est utilisée pour réduire les sous-produits particulaires.

Résumé

La cytométrie en flux peut rapidement caractériser et quantifier diverses populations cellulaires en fonction des mesures de fluorescence. Les cellules sont d’abord colorées avec un ou plusieurs réactifs fluorescents, chacun fonctionnalisé avec une molécule fluorescente différente (fluorophore) qui se lie sélectivement aux cellules en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques, telles que l’expression de l’antigène de surface cellulaire. L’intensité de fluorescence de chaque réactif lié aux cellules peut être mesurée sur le cytomètre en flux à l’aide de canaux qui détectent une gamme spécifiée de longueurs d’onde. Lorsque plusieurs fluorophores sont utilisés, la lumière des fluorophores individuels déborde souvent dans des canaux de détection indésirables, ce qui nécessite une correction des données d’intensité de fluorescence dans un processus appelé compensation.

Des particules de contrôle de compensation, généralement des billes de polymère liées à un seul fluorophore, sont nécessaires pour chaque fluorophore utilisé dans une expérience de marquage cellulaire. Les données des particules de compensation du cytomètre en flux sont utilisées pour appliquer une correction aux mesures d’intensité de fluorescence. Ce protocole décrit la préparation et la purification de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par covalence avec le réactif fluorescent méso-tétra(4-carboxyphényl) porphine (TCPP) et leur application dans la compensation de cytométrie en flux. Dans ce travail, des billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine ont été traitées avec du TCPP et le réactif de couplage amide EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N′-éthylcarbodiimide) à pH 6 et à température ambiante pendant 16 h avec agitation. Les billes TCPP ont été isolées par centrifugation et remises en suspension dans un tampon de pH 7 pour le stockage. Les particules liées au TCPP ont été observées comme sous-produit. Le nombre de ces particules pourrait être réduit à l’aide d’un protocole de filtration facultatif. Les billes TCPP résultantes ont été utilisées avec succès sur un cytomètre en flux pour la compensation dans des expériences avec des cellules d’expectorations humaines marquées avec plusieurs fluorophores. Les billes du RRCT se sont avérées stables après avoir été conservées au réfrigérateur pendant 300 jours.

Introduction

Les porphyrines intéressent depuis de nombreuses années le domaine biomédical en raison de leur fluorescence et de leurs propriétés de ciblage tumoral ^1,2,3. Les applications thérapeutiques telles que la thérapie photodynamique (PDT) et la thérapie sonodynamique (SDT) impliquent l’administration systémique d’une porphyrine à un patient cancéreux, l’accumulation du médicament dans la tumeur et l’exposition localisée de la tumeur à une lumière laser d’une longueur d’onde spécifique ou à des ultrasons. L’exposition à la lumière laser ou aux ultrasons conduit à la génération d’es....

Protocole

Toutes les procédures doivent être effectuées à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation de la solution mère du TCPP, 1,0 mg/mL

NOTE: Cela peut être préparé mensuellement.

1. À l’aide d’une balance analytique, d’une spatule et d’un papier de pesée, peser de 49,0 à 50,9 mg de RRCT. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme. Mettez de côté la quantité mesurée de TCPP à l’abri de la lumière.
   REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.
2. Déterminer les quantités requises d’eau purifiée et d’isopropanol (IPA) à partir ....

Discussion

Malgré les nombreuses applications des porphyrines dans le diagnostic et la thérapeutique du cancer², il existe peu de littérature sur leur utilisation potentielle comme réactif cytométrique en flux pour l’identification des populations de cellules cancéreuses par rapport aux populations de cellules non cancéreuses dans les tissus humains primaires^24,25,26. Nos recherches sur l’analyse cytomét.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365