Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר כיצד חרוזי פיצוי מבוססי פורפירין עבור ציטומטריית זרימה מוכנים על ידי התגובה של חרוזי פוליסטירן פונקציונליים אמין עם TCPP פורפירין ומגיב צימוד אמיד EDC. הליך סינון משמש כדי להפחית את תוצרי הלוואי של החלקיקים.

Abstract

ציטומטריית זרימה יכולה לאפיין ולכמת במהירות אוכלוסיות תאים מגוונות בהתבסס על מדידות פלואורסצנטיות. התאים מוכתמים תחילה בריאגנטים פלואורסצנטיים אחד או יותר, כאשר כל אחד מהם מתפקד עם מולקולה פלואורסצנטית אחרת (פלואורופור) הנקשרת לתאים באופן סלקטיבי בהתבסס על המאפיינים הפנוטיפיים שלהם, כגון ביטוי אנטיגן בפני השטח של התא. את עוצמת הפלואורסצנטיות מכל מגיב הקשור לתאים ניתן למדוד על ציטומטר הזרימה באמצעות ערוצים המזהים טווח מוגדר של אורכי גל. כאשר משתמשים בפלואורופורים מרובים, האור מפלואורופורים בודדים גולש לעתים קרובות לתעלות גילוי לא רצויות, מה שדורש תיקון לנתוני עוצמת הפלואורסצנטיות בתהליך שנקרא פיצוי.

חלקיקי בקרת פיצוי, בדרך כלל חרוזי פולימר הקשורים לפלואורופור יחיד, נדרשים עבור כל פלואורופור המשמש בניסוי תיוג תאים. נתונים מחלקיקי פיצוי מציטומטר הזרימה משמשים ליישום תיקון למדידות עוצמת הפלואורסצנטיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה וטיהור של חרוזי פיצוי פוליסטירן המתפקדים באופן קוולנטי עם מגיב פלואורסצנטי מזו-טטרה (4-קרבוקסיפניל) פורפין (TCPP) ויישומם בפיצוי ציטומטריית זרימה. בעבודה זו, חרוזי פוליסטירן פונקציונליים של אמין טופלו באמצעות TCPP ומגיב צימוד אמיד EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) ב- pH 6 ובטמפרטורת החדר במשך 16 שעות עם תסיסה. חרוזי TCPP בודדו על ידי צנטריפוגה והושעו מחדש במאגר pH 7 לאחסון. חלקיקים הקשורים ל-TCPP נצפו כתוצר לוואי. ניתן להפחית את מספר החלקיקים הללו באמצעות פרוטוקול סינון אופציונלי. חרוזי TCPP שהתקבלו שימשו בהצלחה על ציטומטר זרימה לפיצוי בניסויים עם תאי כיח אנושיים שסומנו עם פלואורופורים מרובים. חרוזי TCPP הוכחו כיציבים לאחר אחסון במקרר במשך 300 יום.

Introduction

פורפירינים היו בעלי עניין במשך שנים רבות בתחום הביו-רפואי בשל תכונותיהם הפלואורסצנטיות וממוקדות הגידול 1,2,3. יישומים טיפוליים כגון טיפול פוטודינמי (PDT) וטיפול סונודינמי (SDT) כרוכים במתן סיסטמי של פורפירין לחולה סרטן, הצטברות התרופה בגידול וחשיפה מקומית של הגידול לאור לייזר באורך גל מסוים או אולטרסאונד. החשיפה לאור לייזר או אולטרסאונד מובילה ליצירת מיני חמצן תגובתי על ידי הפורפירין ולאחר מכן למוות תאי 4,5. באבחון פוטודינמי (PDD), פורפירין פלואורסצנטי משמש להבדיל בין תאים סרטניים לתאים נורמליים6. בהקשר זה, פרוטופורפירין IX, פורפירין פלואורסצנטי טבעי המצטבר בגידולים עם הזרקה מערכתית או מקומית של קודמו, חומצה 5-אמינולבולינית (5-ALA), משמש לזיהוי גידולי סטרומה במערכת העיכול, סרטן שלפוחית השתן וסרטן המוח 7,8. לאחרונה, טיפול 5-ALA נחקר כגישה לאיתור מחלה שיורית מינימלית במיאלומה נפוצה9. המעבדה שלנו השתמשה בטטראריל פורפירין TCPP (5,10,15,20-טטרקיס-(4-קרבוקסיפניל)-21,23 H-פורפין) בשל יכולתו להכתים באופן סלקטיבי תאי סרטן ריאה ותאים הקשורים לסרטן בדגימות כיח אנושיות, תכונה שנוצלה בבדיקות אבחון ציטומטריות מבוססות שקופיות וזרימה10.

חלק מהפורפירינים הם דו-תפקודיים בכך שהם יכולים לשמש כסוכנים טיפוליים ואבחוניים 2,11. במחקר ביו-רפואי, פורפירינים דו-תפקודיים כאלה משמשים כדי להעריך כיצד יכולתם להתמקד באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים היא פונקציה של המבנה שלהם, כמו גם כיצד הוא מושפע מנוכחותן של תרכובות אחרות 12,13,14,15,16. ניתן למדוד הן את ספיגת התאים של פורפירינים והן את ציטוטוקסיות שלהם על פלטפורמה ציטומטרית של זרימה באופן בתפוקה גבוהה. ספקטרום הספיגה והפליטה של פורפירינים פלואורסצנטיים הוא מורכב, אך רוב הפלטפורמות הציטומטריות של הזרימה מצוידות כדי לזהות אותן נכון. ספקטרום הספיגה של פורפירינים פלואורסצנטיים מאופיין ברצועת ספיגה חזקה בתחום 380-500 ננומטר, המכונה רצועת סורט. שתיים עד ארבע רצועות ספיגה חלשות יותר נצפות בדרך כלל בתחום התדרים 500-750 ננומטר (Q)17. לייזר כחול של 488 ננומטר, שנמצא ברוב הציטומטרים של זרימה, או לייזר סגול (405 ננומטר) יכולים להפיק אור באורך הגל המתאים כדי לעורר פורפירינים. ספקטרום הפליטה של פורפירינים מציג בדרך כלל שיאים בטווח של 600-800 ננומטר18, מה שמביא לחפיפה ספקטרלית מועטה מאוד עם פלואורוסצאין איזותיוציאנט או פיקואריתרין (PE) פלואורופורים, אך חפיפה ניכרת עם פלואורופורים אחרים הנמצאים בשימוש לעתים קרובות, כגון אלופיקוציאנין (APC), כמו גם פלואורופורים טנדם, כגון PE-Cy5 ואחרים. לכן, בעת שימוש בפורפירינים במבחני ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, בקרות פלואורופור יחיד חיוניות כדי לתקן כראוי את זליגת הפלואורסצנטיות בתעלות אחרות מזו המיועדת למדוד את הפלואורסצנטיות של הפורפירין.

באופן אידיאלי, פקדי הפלואורופורים היחידים המשמשים לחישוב מטריצת הזליגה עבור פאנל של פלואורופורים (הנקראים גם "בקרות פיצוי") צריכים להיות מורכבים מאותם סוגי תאים כמו הדגימה. עם זאת, שימוש במדגם למטרה זו אינו אופטימלי אם יש מדגם קטן מאוד מלכתחילה או אם אוכלוסיית היעד בתוך המדגם קטנה מאוד (למשל, אם רוצים להסתכל על מחלה שיורית מינימלית או תאים סרטניים בשלבים המוקדמים של המחלה). חלופה שימושית לתאים היא חרוזים יחד עם אותו פלואורופור המשמש לניתוח הדגימה. חרוזים רבים כאלה זמינים מסחרית; חרוזים אלה מסומנים מראש עם הפלואורופור הרצוי (חרוזים ספציפיים לפלואורופור מסומנים מראש)19,20, או שניתן להצמיד להם נוגדן מסומן פלואורסצנטית (חרוזי לכידת נוגדנים)20,21. בעוד חרוזי פיצוי מסחריים זמינים עבור פלואורופורים רבים, חרוזים כאלה אינם זמינים עבור פורפירינים, למרות השימוש הגובר בהם במחקר בסיסי וקליני.

בנוסף לשימור הדגימות ולגודל מתאים של אוכלוסיות חיוביות לעומת שליליות, היתרונות האחרים של שימוש בחרוזים כבקרות פיצוי הם קלות ההכנה, פלואורסצנטיות רקע נמוכה ויציבות מעולה לאורך זמן22. החיסרון הפוטנציאלי של שימוש בחרוזים כבקרת פיצוי הוא שספקטרום הפליטה של הנוגדן הפלואורסצנטי שנלכד על חרוזים עשוי להיות שונה מזה של אותו נוגדן המשמש לסימון התאים. זה עשוי להיות בעל חשיבות ספציפית בעת שימוש בציטומטר זרימה ספקטרלית20. לכן, פיתוח חרוזים כבקרת פיצוי צריך להתבצע על ציטומטר הזרימה שישמש לבדיקה שעבורה מפותחים החרוזים. יתר על כן, התפתחות החרוזים צריכה לכלול השוואה עם תאים המסומנים באותו מגיב צביעה פלואורסצנטי.

כאן, אנו מתארים את ההכנה של חרוזי פיצוי פוליסטירן פונקציונליים TCPP, שעוצמת הפלואורסצנטיות החציונית שלהם בתעלת הגילוי הייתה דומה לזו של תאים המסומנים ב- TCPP בכיח, והשימוש בהם כבקרות פיצוי עבור ציטומטריית זרימה. האוטופלואורסצנטיות של חרוזים שווי ערך, לא פונקציונליים, הייתה נמוכה מספיק לשימוש בהם כבקרות פיצוי פלואורסצנטיות שליליות. בנוסף, חרוזים אלה הפגינו יציבות באחסון במשך כמעט שנה.

Protocol

כל ההליכים צריכים להיעשות באמצעות ציוד מגן אישי מתאים.

1. הכנת תמיסת מלאי TCPP, 1.0 מ"ג / מ"ל

הערה: ניתן להכין זאת אחת לחודש.

  1. בעזרת איזון אנליטי, מרית ונייר שקילה, שוקלים 49.0-50.9 מ"ג TCPP. עיגלו את המשקולת ל-1/10 מיליגרם. הניחו בצד את הכמות הנמדדת של TCPP המוגנת מפני אור.
    הערה: השתמש באקדח סטטי אם קריאת המשקל אינה יציבה.
  2. קבע את הכמויות הנדרשות של מים מטוהרים ואיזופרופנול (IPA) מטבלה 1 בהתבסס על כמות TCPP שנשקלה בשלב 1.1. הוסיפו את המים המטוהרים והאיזופרופנול לכוס זכוכית בנפח 100 מ"ל, וכסו בפרפילם כדי להגן מפני אידוי.
  3. קבע את הכמות הנדרשת של סודיום ביקרבונט מטבלה 1 בהתבסס על כמות TCPP שנשקלה בשלב 1.1.
  4. באמצעות האיזון האנליטי, המרית ונייר השקילה, לשקול את הכמות הנדרשת של סודיום ביקרבונט שנקבעה בשלב 1.3. עיגלו את המשקולת ל-1/10 מיליגרם.
    הערה: השתמש באקדח סטטי אם קריאת המשקל אינה יציבה.
  5. הוסף את סודיום ביקרבונט לכוס 100 מ"ל המכילה מים מטוהרים ואיזופרופנול. כסו את התמיסה בפרפילם כדי להגן מפני אידוי.
  6. מניחים את התמיסה משלב 1.5 על צלחת ערבוב, ומערבבים עד להמסה (כ-10 דקות)
  7. למדוד את ה- pH כדי להבטיח כי תמיסה המכילה סודיום ביקרבונט משלב 1.6 יש pH בין 9 ל 10.
  8. הוסיפו באיטיות את TCPP במשקל שלב 1.1 לתמיסה משלב 1.7, והמשיכו לערבב עד להמסה (~30 דקות). יש להגן מפני אור במהלך שלב זה.
  9. יש לאחסן במיכל זכוכית או פוליפרופילן בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור.

2. הכנת 2-(N -morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) ותמיסת חיץ מלח המיסודיום, 0.1 M, pH 6.0-6.2 ("מאגר MES")

הערה: יש להכין אותו ביום השימוש ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.

  1. שקלו 2.50 גרם מלח המיסודיום MES, והוסיפו אותו לבקבוק פלסטיק של 150 מ"ל.
  2. מוסיפים 121 מ"ל מים מטוהרים, וממיסים על ידי ניעור ידני עד שלא נראה מוצק.
  3. מדוד את ה- pH של מאגר MES כדי לוודא שהוא בין 6 ל- 6.2.
  4. יש לשמור בטמפרטורת החדר לשימוש באותו היום.

3. אבקת N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC)

  1. הוציאו את אבקת ה-EDC מהמקפיא והניחו לה לשבת בטמפרטורת החדר עד לשימוש בשלב 5.

4. שילוב חרוזי פוליסטירן פונקציונליים עם תמיסת TCPP

  1. הוסף 4.3 מ"ל של תמיסת חיץ MES 0.1 M שהוכנה בשלב 2 לצינור פוליפרופילן 15 מ"ל.
  2. מערבול את מתלה חרוזי הפוליסטירן המתפקד על ידי אמין (10 מיקרומטר, 2.5% w/v) למשך 60 שניות במהירות מרבית.
  3. הוסף 288 μL של מתלה חרוזים טרי זה למאגר MES משלב 4.1.
  4. מערבול את פתרון MES/חרוז למשך 15 שניות במהירות מרבית.
  5. מערבול את פתרון TCPP 1 מ"ג/מ"ל שהוכן בשלב 1 עבור 60 שניות במהירות מרבית.
  6. הוסף 1.20 מ"ל של פתרון מניות TCPP טרי זה להשעיית MES/חרוזים משלב 4.4.
  7. סובב את מתלי MES/חרוז/TCPP למשך 15 שניות במהירות מרבית.
  8. מכסים את הצינור בנייר כסף בזמן שתמיסת EDC מוכנה.

5. הכנת תמיסת מלאי N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrocholoride (HCl)

הערה: תמיסת EDC מתכלה ויש להשתמש בה מיד לאחר ההכנה.

  1. הוסף 20.0 מ"ל מים מטוהרים לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
  2. שקלו 200 מ"ג של EDC HCl משלב 3, והוסיפו אותו למים (שלב 5.1).
  3. מערבול את EDC HCL במשך 15 שניות במהירות מקסימלית כדי ליצור פתרון ברור.

6. הכנת פתרון העבודה EDC HCl/MES

הערה: תמיסת EDC HCl/MES מתכלה ויש להשתמש בה מיד לאחר ההכנה.

  1. הוסף 54.0 מ"ל של תמיסת חיץ MES (שהוכנה בשלב 2) לבקבוק פלסטיק של 150 מ"ל.
  2. הוסף 6.0 מ"ל של תמיסת מלאי EDC HCl (שהוכנה בשלב 5) לתמיסת מאגר MES, וערבב על-ידי ניעור במשך 10 שניות.

7. תיוג החרוזים עם TCPP

  1. הוסף 4.5 מ"ל של פתרון עבודה EDC (משלב 6) לצינור פוליפרופילן 15 מ"ל המכיל את החרוזים ו- TCPP במאגר MES (שלב 4.7).
  2. הניחו את הצינור במסובב הפוך במהירות 35 סל"ד למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר ומוגנים מפני אור.
  3. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם.
  4. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את החרוזים ב-0.8 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS).
  5. מעבירים את תמיסת החרוזים לבקבוקון פוליפרופילן ענברי עם פיפטה של 1 מ"ל, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
    הערה: החרוזים יציבים לפחות 3 חודשים בשלב זה.

8. בדיקת איכות (QC) של חרוזי TCPP לפי ציטומטריית זרימה

הערה: ה- QC צריך להיות מרוכז בשאלה אם עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) של חרוזי TCPP בהירה מספיק לשימוש המיועד שלהם וכמות החלקיקים הנוצרים על ידי ההליך. עיין בסעיף התוצאות המייצגות לקבלת פרטים נוספים.

  1. תייגו צינור פוליסטירן אחד בנפח 5 מ"ל כ"חרוזים שליליים TCPP".
    הערה: החרוזים השליליים שונים מהחרוזים הפונקציונליים המשמשים לתיוג. ראה טבלת חומרים.
  2. תייגו צינור אחר כ"חרוזים חיוביים TCPP".
  3. תייגו צינור אחר כ"חרוזי קשת".
  4. Aliquot 300 μL של HBSS קר כקרח לתוך צינורות המסומנים עם "חרוזים שליליים TCPP" ו "חרוזים חיוביים TCPP".
  5. הוסיפו 500 μL של HBSS קר כקרח לצינור המסומן כ"חרוזי קשת".
  6. מערבלים את מתלה החרוזים הלא פונקציונלי מפוליסטירן (ללא תווית) לזמן קצר במהירות מרבית (2-3 שניות), ומוסיפים 10 מיקרוליטר ממנו לצינור המסומן "חרוזים שליליים TCPP".
  7. מערבלים את מתלה החרוזים המסומן ב-TCPP (מסתיים בשלב 7.5) לזמן קצר במהירות מרבית, ומוסיפים 3 μL ממנו לצינור "TCPP positive beads".
  8. מערבבים את מתלה חרוזי הקשת לזמן קצר במהירות מרבית, ומוסיפים שתי טיפות ממנו לצינור "חרוזי הקשת".
  9. יש לשמור את כל הצינורות על קרח, מכוסים ומוגנים מפני אור.
  10. התחל את הליכי ההפעלה היומיים המתאימים של ציטומטר הזרימה, ובצע QC כדי לוודא את יישור הנוזלים והלייזר האופטימליים.
    הערה: עבור חלק זה של הפרוטוקול, ההנחה היא כי המפעיל מאומן בשימוש בציטומטר הזרימה הזמין, כולל הליכי סטנדרטיזציה של פיזור האור ועוצמת הפלואורסצנטיות, כמו גם את העקרונות הבסיסיים של חישוב מטריצת הפיצוי הנכונה.
  11. הפעל את חרוזי הקשת ואת חרוזי TCPP מבלי לשנות את הגדרות המתח בין הריצות השונות.
    1. הפעל ואסוף 10,000 אירועים של חרוזי הקשת.
    2. בצע שטיפה במים, ואסוף 10,000 אירועים של חרוזים שליליים TCPP.
    3. בצעו שטיפה במים, ואספו 10,000 אירועים של חרוזים חיוביים ל-TCPP.
    4. יש לבצע שטיפה במים במשך דקה.
      הערה: חשוב לבצע שטיפה במים לאחר הפעלת חרוזי TCPP. אם TCPP אינו נשטף מהקווים בציטומטר, קיימת אפשרות ש- TCPP שיורי יכול לסמן תאים בצינור הבא שיירכש.
    5. בצע את פרוטוקולי הניקוי והכיבוי המתאימים הספציפיים להוראות היצרן עבור הציטומטר.
      הערה: לקבלת תוצאות מייצגות, ראה איור 1.

9. סינון חרוזים

הערה: אם ה-QC של החרוזים לפי ציטומטריית זרימה (שלב 8) מראה שיעור גבוה של חלקיקים (70% ומעלה), שקול לסנן את תרחיף החרוזים באמצעות הפרוטוקול שלהלן (איור 2).

  1. הוסף 3.20 מ"ל של HBSS קר כקרח ל- 0.8 מ"ל של מתלה חרוזי TCPP שהושלם בשלב 7.5 (יצירת דילול פי חמישה).
  2. מערבלים את מתלה החרוזים המדולל במהירות מרבית למשך 15 שניות.
  3. מוציאים את הבוכנה ממזרק חד פעמי של 5 מ"ל.
  4. התאימו את המזרק לפילטר קצה סיבי זכוכית (5 מיקרומטר, קוטר 13 מ"מ).
  5. הוסף 4 מ"ל של HBSS למזרק.
  6. הוסף 0.5 מ"ל של תרחיף חרוזים מדולל מערבול (שלב 9.2).
  7. השתמש בבוכנה כדי לסנן את המתלה דרך מערך המזרק/מסנן במהירות של כ-2 טיפות לשנייה.
  8. שטפו את החרוזים על ידי שאיבת 5 מ"ל HBSS טרי לתוך המזרק דרך הפילטר בערך 2 טיפות לשנייה.
  9. דחפו שוב את ה-HBSS החוצה לתוך מיכל האשפה במהירות של כ-2 טיפות לשנייה.
  10. כדי להסיר את החרוזים מהמסנן, ציירו עוד 5 מ"ל של HBSS טרי לתוך המזרק דרך המסנן.
  11. הסר בזהירות את המסנן מהמזרק.
  12. מוציאים את מתלה החרוזים מהמזרק לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.
  13. החזירו את הפילטר למזרק וחזרו על שלבים 9.10-9.12 ארבע פעמים נוספות. לאחר מכן השליכו את המסנן והמזרק.
  14. חזור על שלבים 9.2-9.13 עד שכל החרוזים משלב 9.1 יסוננו. השתמשו במזרק טרי וסננו בכל פעם.
  15. צנטריפוגו את מתלי החרוזים המסוננים למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם בטמפרטורת החדר.
  16. שאפו את הסופרנאטנט של כל צינור 50 מ"ל, והשעו מחדש בעדינות את החרוזים, ומשלבים אותם ב 0.5 מ"ל של HBSS טרי.
  17. מעבירים את החרוזים עם מיקרופיפטה p1,000 לבקבוקון ענבר, זכוכית או פוליפרופילן חדש, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.
  18. חזור על שלב 8 כדי לקבוע אם שיעור החלקיקים הקשורים ל- TCPP במתלה החרוזים המסונן פחת. לקבלת תוצאות מייצגות, ראה איור 3.

תוצאות

פרוטוקול זה לסימון TCPP של חרוזים הוא מהיר ויעיל יחסית. איור 1 מראה תוצאה מייצגת של תהליך תיוג חרוזי TCPP כפי שנקבע על-ידי ציטומטריית זרימה. איור 1A מראה את הפרופיל הסטנדרטי של חרוזי הקשת, כפי שהוא מזוהה בערוץ המתאים לזיהוי TCPP. חרוזים אלה משמשים כ-QC לסטנדרטיזציה ש?...

Discussion

למרות היישומים הרבים של פורפירינים באבחון סרטן וטיפולים2, קיימת ספרות מוגבלת על השימוש הפוטנציאלי שלהם כמגיב ציטומטרי זרימה לזיהוי אוכלוסיות תאים סרטניים לעומת לא סרטניים ברקמות אנושיות ראשוניות24,25,26. המחקר שלנו על ניתוח צ?...

Disclosures

כל הכותבים הם עובדים של bioAffinity Technologies.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לדיוויד רודריגז על הסיוע בהכנת הדמויות ושירותי הפתולוגיה המדויקת (סן אנטוניו, טקסס) על השימוש בציטומטר הזרימה Navios EX שלה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. . US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
  26. . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. . US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved