Гранулы, модифицированные порфирином, для использования в качестве компенсационного контроля в проточной цитометрии

Резюме

В протоколе описывается, как компенсационные шарики на основе порфирина для проточной цитометрии получают реакцией аминофункционализированных полистирольных шариков с порфирином TCPP и амидным связывающим реагентом EDC. Процедура фильтрации используется для уменьшения количества побочных продуктов твердых частиц.

Аннотация

Проточная цитометрия может быстро охарактеризовать и количественно оценить различные клеточные популяции на основе измерений флуоресценции. Клетки сначала окрашивают одним или несколькими флуоресцентными реагентами, каждый из которых функционализируется другой флуоресцентной молекулой (флуорофором), которая избирательно связывается с клетками на основе их фенотипических характеристик, таких как экспрессия антигена на поверхности клетки. Интенсивность флуоресценции от каждого реагента, связанного с клетками, может быть измерена на проточном цитометре с использованием каналов, которые обнаруживают заданный диапазон длин волн. При использовании нескольких флуорофоров свет от отдельных флуорофоров часто перетекает в нежелательные каналы обнаружения, что требует коррекции данных об интенсивности флуоресценции в процессе, называемом компенсацией.

Компенсационные контрольные частицы, обычно полимерные шарики, связанные с одним флуорофором, необходимы для каждого флуорофора, используемого в эксперименте по маркировке клеток. Данные компенсационных частиц из проточного цитометра используются для внесения поправок в измерения интенсивности флуоресценции. В этом протоколе описывается приготовление и очистка полистирольных компенсационных шариков, ковалентно функционализированных флуоресцентным реагентом мезотетра(4-карбоксифенил)порфин (TCPP), и их применение для компенсации проточной цитометрии. В этой работе аминофункционализированные полистирольные шарики обрабатывали TCPP и амидным связывающим реагентом EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид) при рН 6 и при комнатной температуре в течение 16 ч с перемешиванием. Гранулы TCPP выделяли центрифугированием и ресуспендировали в буфере pH 7 для хранения. В качестве побочного продукта наблюдались частицы, связанные с TCPP. Количество этих частиц может быть уменьшено с помощью дополнительного протокола фильтрации. Полученные гранулы TCPP были успешно использованы на проточном цитометре для компенсации в экспериментах с клетками мокроты человека, меченными несколькими флуорофорами. Бусины TCPP оказались стабильными после хранения в холодильнике в течение 300 дней.

Введение

Порфирины уже много лет представляют интерес в области биомедицины из-за их флуоресцентных и опухолевых свойств ^1,2,3. Терапевтические применения, такие как фотодинамическая терапия (ФДТ) и сонодинамическая терапия (СДТ), влекут за собой системное введение порфирина больному раком, накопление препарата в опухоли и локализованное воздействие на опухоль лазерным светом определенной длины волны или ультразвуком. Воздействие лазерного излучения или ультразвука приводит к образованию порфирином активных форм кислорода и последующей гибели клеток ^4,5

протокол

Все процедуры необходимо проводить с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.

1. Приготовление исходного раствора TCPP, 1,0 мг / мл

ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть подготовлено ежемесячно.

1. С помощью аналитических весов, шпателя и бумаги для взвешивания взвесьте 49,0-50,9 мг TCPP. Округлите вес до 1/10 миллиграмма. Отложите измеренное количество TCPP в сторону, защищенное от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте статический пистолет, если показания веса нестабильны.
2. Определите требуемые количества очищенной воды и изопропанола (IPA) из таблицы 1 на ....

Результаты

Этот протокол для маркировки бусин TCPP является относительно быстрым и эффективным. На рисунке 1 показан репрезентативный результат процесса маркировки шариков TCPP, определенный с помощью проточной цитометрии. На рисунке 1A показан стандартизированный п?.......

Обсуждение

Несмотря на многочисленные применения порфиринов в диагностике и терапии рака², существует ограниченная литература об их потенциальном использовании в качестве проточного цитометрического реагента для идентификации раковых и нераковых клеточных популяций в первичных ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365