Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В протоколе описывается, как компенсационные шарики на основе порфирина для проточной цитометрии получают реакцией аминофункционализированных полистирольных шариков с порфирином TCPP и амидным связывающим реагентом EDC. Процедура фильтрации используется для уменьшения количества побочных продуктов твердых частиц.
Проточная цитометрия может быстро охарактеризовать и количественно оценить различные клеточные популяции на основе измерений флуоресценции. Клетки сначала окрашивают одним или несколькими флуоресцентными реагентами, каждый из которых функционализируется другой флуоресцентной молекулой (флуорофором), которая избирательно связывается с клетками на основе их фенотипических характеристик, таких как экспрессия антигена на поверхности клетки. Интенсивность флуоресценции от каждого реагента, связанного с клетками, может быть измерена на проточном цитометре с использованием каналов, которые обнаруживают заданный диапазон длин волн. При использовании нескольких флуорофоров свет от отдельных флуорофоров часто перетекает в нежелательные каналы обнаружения, что требует коррекции данных об интенсивности флуоресценции в процессе, называемом компенсацией.
Компенсационные контрольные частицы, обычно полимерные шарики, связанные с одним флуорофором, необходимы для каждого флуорофора, используемого в эксперименте по маркировке клеток. Данные компенсационных частиц из проточного цитометра используются для внесения поправок в измерения интенсивности флуоресценции. В этом протоколе описывается приготовление и очистка полистирольных компенсационных шариков, ковалентно функционализированных флуоресцентным реагентом мезотетра(4-карбоксифенил)порфин (TCPP), и их применение для компенсации проточной цитометрии. В этой работе аминофункционализированные полистирольные шарики обрабатывали TCPP и амидным связывающим реагентом EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид) при рН 6 и при комнатной температуре в течение 16 ч с перемешиванием. Гранулы TCPP выделяли центрифугированием и ресуспендировали в буфере pH 7 для хранения. В качестве побочного продукта наблюдались частицы, связанные с TCPP. Количество этих частиц может быть уменьшено с помощью дополнительного протокола фильтрации. Полученные гранулы TCPP были успешно использованы на проточном цитометре для компенсации в экспериментах с клетками мокроты человека, меченными несколькими флуорофорами. Бусины TCPP оказались стабильными после хранения в холодильнике в течение 300 дней.
Порфирины уже много лет представляют интерес в области биомедицины из-за их флуоресцентных и опухолевых свойств 1,2,3. Терапевтические применения, такие как фотодинамическая терапия (ФДТ) и сонодинамическая терапия (СДТ), влекут за собой системное введение порфирина больному раком, накопление препарата в опухоли и локализованное воздействие на опухоль лазерным светом определенной длины волны или ультразвуком. Воздействие лазерного излучения или ультразвука приводит к образованию порфирином активных форм кислорода и последующей гибели клеток 4,5
Все процедуры необходимо проводить с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.
1. Приготовление исходного раствора TCPP, 1,0 мг / мл
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть подготовлено ежемесячно.
Этот протокол для маркировки бусин TCPP является относительно быстрым и эффективным. На рисунке 1 показан репрезентативный результат процесса маркировки шариков TCPP, определенный с помощью проточной цитометрии. На рисунке 1A показан стандартизированный п?.......
Несмотря на многочисленные применения порфиринов в диагностике и терапии рака2, существует ограниченная литература об их потенциальном использовании в качестве проточного цитометрического реагента для идентификации раковых и нераковых клеточных популяций в первичных ?.......
Все авторы являются сотрудниками компании bioAffinity Technologies.
Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Родригеса за помощь в подготовке фигуры и Precision Pathology Services (Сан-Антонио, Техас) за использование проточного цитометра Navios EX.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Centrifuge | with appropriate rotor | ||
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
Serological pipettes, disposable - 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
Serological pipettes, disposable - 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены