A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه التقنية سير عمل فعال لتصور وقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق داخل خلايا هيلا باستخدام التصوير الحي القائم على التألق.

Abstract

الميتوكوندريا عضيات ديناميكية ضرورية للاتزان الداخلي الأيضي من خلال التحكم في إنتاج الطاقة عن طريق تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). لدعم التمثيل الغذائي الخلوي ، تتعاون آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا المختلفة للحفاظ على شبكة ميتوكوندريا صحية. أحد هذه المسارات هو الميتوفاجي ، حيث يسهل كيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) و Parkin phospho-ubiquitination للميتوكوندريا التالفة عزل البلعمة الذاتية والإزالة اللاحقة من الخلية عن طريق اندماج الليزوزوم. الميتوفاجي مهم للاتزان الخلوي ، وترتبط الطفرات في باركين بمرض باركنسون (PD). بسبب هذه النتائج ، كان هناك تركيز كبير على التحقيق في تلف الميتوكوندريا ودورانها لفهم الآليات الجزيئية وديناميكيات مراقبة جودة الميتوكوندريا. هنا ، تم استخدام تصوير الخلايا الحية لتصور شبكة الميتوكوندريا لخلايا HeLa ، لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بعد العلاج باستخدام سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) ، وهو عامل فك ارتباط الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، تم التعبير عن طفرة مرتبطة بمرض باركين (ParkinT240R) والتي تثبط الميتوفاجي المعتمد على باركين لتحديد كيفية تأثير التعبير الطافر على شبكة الميتوكوندريا مقارنة بالخلايا التي تعبر عن باركين من النوع البري. يصف البروتوكول الموضح هنا سير عمل بسيط باستخدام مناهج قائمة على التألق لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال.

Introduction

شبكة الميتوكوندريا عبارة عن سلسلة من العضيات المترابطة التي تلعب دورا حاسما في إنتاج الطاقة1 ، والمناعة الفطرية2,3 ، وإشارات الخلية 4,5. ارتبط عدم تنظيم الميتوكوندريا بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)6,7. PD هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يؤثر على الخلايا العصبية الدوبامينية للمادة السوداء التي تؤثر على ما يقرب من 10 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم8. تم ربط PD وراثيا ب mitophagy ، وهو مسار لمراقبة جودة الميتوكوندريا ضروري للحفا....

Protocol

1. تحضير العينات البيولوجية

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. رش سطح الخزانة وجميع المواد بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.

  1. زراعة خلايا هيلا ونقلها
    1. استزرع 30000 خلية هيلا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ومحلول L-glutamine بنسبة 1٪ (HeLa media ؛ انظر جدول المواد). ضع الخلايا على أطباق تصوير ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم (انظر Table of Materials) تحتوي على 2 مل من وسائط HeLa المسخنة مسبقا. الحفاظ على مزارع هيلا عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية26,27

النتائج

في هذا البروتوكول ، تم استخدام القياس الكمي القائم على التألق لقياس إمكانات الغشاء ومستويات الأكسيد الفائق لشبكة الميتوكوندريا بعد معالجة CCCP (الشكل 1). استخدم سير العمل هذا خلايا هيلا ، وهي خط خلوي خالد مشتق من سرطان عنق الرحم. تستخدم خلايا هيلا بشكل روتيني لدراسة بيولوجيا .......

Discussion

يمكن استخدام سير العمل الموضح هنا لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بقوة وقابلية التكرار باستخدام التصوير القائم على التألق30. هناك قيود فنية مهمة يجب مراعاتها عند تصميم هذه التجارب. تم نقل خلايا هيلا باستخدام ناقل YFP فارغ ، YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT2.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة يعلنونها.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر إيفانز على ملاحظاتهم المدروسة حول هذه المخطوطة. يتم دعم هذا العمل من قبل علماء ديوك وايتهيد ، وعلماء ديوك للعلوم والتكنولوجيا ، وزمالة هانا جراي في معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). تم عمل الشكل 1 أ باستخدام BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved