A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
טכניקה זו מתארת זרימת עבודה יעילה כדי להמחיש ולמדוד כמותית את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בתוך תאי HeLa באמצעות הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנטיות.
מיטוכונדריה הם אברונים דינמיים החיוניים להומאוסטזיס מטבולי על ידי שליטה בייצור האנרגיה באמצעות סינתזת ATP. כדי לתמוך בחילוף החומרים בתאים, מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריאליים שונים משתפים פעולה כדי לשמור על רשת מיטוכונדריאלית בריאה. מסלול אחד כזה הוא מיטופגיה, שבה קינאז 1 המושרה על ידי PTEN (PINK1) ופרקין פוספו-יוביקוויטינציה של מיטוכונדריה פגומה מסייעים לקיבוע אוטופגוזום ולאחר מכן לסילוק מהתא באמצעות איחוי ליזוזומים. מיטופגיה חשובה להומאוסטזיס תאי, ומוטציות בפרקין קשורות למחלת פרקינסון (PD). בשל ממצאים אלה, הושם דגש משמעותי על חקירת נזק ותחלופת מיטוכונדריה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים והדינמיקה של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. כאן, נעשה שימוש בהדמיה של תאים חיים כדי להמחיש את הרשת המיטוכונדריאלית של תאי HeLa, כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד לאחר טיפול בקרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), חומר לפירוק צימוד מיטוכונדריאלי. בנוסף, מוטציה הקשורה לפרקינסון של פרקין (ParkinT240R) המעכבת מיטופגיה תלוית פרקין באה לידי ביטוי כדי לקבוע כיצד ביטוי מוטנטי משפיע על הרשת המיטוכונדריאלית בהשוואה לתאים המבטאים פרקין מסוג פרא. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר זרימת עבודה פשוטה באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנטיות לכימות יעיל של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד.
הרשת המיטוכונדריאלית היא סדרה של אברונים מחוברים זה לזה הממלאים תפקיד מכריע בייצור אנרגיה1, חסינות מולדת2,3 ואיתות תאי 4,5. חוסר ויסות מיטוכונדריאלי נקשר למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון (PD)6,7. פרקינסון היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המשפיעה על נוירונים דופמינרגיים של החומר השחור המשפיעה על כמעט 10 מיליון אנשים ברחבי העולם8. מחלת פרקינסון נקשרה גנטית למיטופגיה, מסלול בקרת איכות מיטוכונדריאלי הנחוץ לשמירה על הומאוסטזיס תאי המסי....
1. הכנת דגימות ביולוגיות
הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות טכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית. רססו את פני הארון ואת כל החומרים באתנול 70%.
בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בכימות מבוסס פלואורסצנטיות כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה ואת רמות הסופראוקסיד של הרשת המיטוכונדריאלית לאחר טיפול CCCP (איור 1). תהליך עבודה זה השתמש בתאי HeLa, קו תאים אימורטלי שמקורו בסרטן צוואר הרחם. תאי HeLa משמשים באופן שגרתי לחקר ביולוגיה מיטוכונדרי.......
ניתן להשתמש בתהליך העבודה המתואר כאן כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בצורה חזקה וניתנת לשחזור באמצעות הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות30. ישנן מגבלות טכניות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים אלה. תאי HeLa הודבקו בווקטור YFP ריק, YFP-ParkinWT א.......
למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.
אנו מודים לחברי מעבדת אוונס על המשוב המתחשב שלהם על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכת על ידי מלגות דיוק וייטהד, חוקרי המדע והטכנולוגיה של דיוק ומלגת חנה גריי של המכון הרפואי הווארד יוז (HHMI). איור 1A נוצר באמצעות BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
Other | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved