Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

טכניקה זו מתארת זרימת עבודה יעילה כדי להמחיש ולמדוד כמותית את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בתוך תאי HeLa באמצעות הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנטיות.

Abstract

מיטוכונדריה הם אברונים דינמיים החיוניים להומאוסטזיס מטבולי על ידי שליטה בייצור האנרגיה באמצעות סינתזת ATP. כדי לתמוך בחילוף החומרים בתאים, מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריאליים שונים משתפים פעולה כדי לשמור על רשת מיטוכונדריאלית בריאה. מסלול אחד כזה הוא מיטופגיה, שבה קינאז 1 המושרה על ידי PTEN (PINK1) ופרקין פוספו-יוביקוויטינציה של מיטוכונדריה פגומה מסייעים לקיבוע אוטופגוזום ולאחר מכן לסילוק מהתא באמצעות איחוי ליזוזומים. מיטופגיה חשובה להומאוסטזיס תאי, ומוטציות בפרקין קשורות למחלת פרקינסון (PD). בשל ממצאים אלה, הושם דגש משמעותי על חקירת נזק ותחלופת מיטוכונדריה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים והדינמיקה של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. כאן, נעשה שימוש בהדמיה של תאים חיים כדי להמחיש את הרשת המיטוכונדריאלית של תאי HeLa, כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד לאחר טיפול בקרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), חומר לפירוק צימוד מיטוכונדריאלי. בנוסף, מוטציה הקשורה לפרקינסון של פרקין (ParkinT240R) המעכבת מיטופגיה תלוית פרקין באה לידי ביטוי כדי לקבוע כיצד ביטוי מוטנטי משפיע על הרשת המיטוכונדריאלית בהשוואה לתאים המבטאים פרקין מסוג פרא. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר זרימת עבודה פשוטה באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנטיות לכימות יעיל של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד.

Introduction

הרשת המיטוכונדריאלית היא סדרה של אברונים מחוברים זה לזה הממלאים תפקיד מכריע בייצור אנרגיה1, חסינות מולדת2,3 ואיתות תאי 4,5. חוסר ויסות מיטוכונדריאלי נקשר למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון (PD)6,7. פרקינסון היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המשפיעה על נוירונים דופמינרגיים של החומר השחור המשפיעה על כמעט 10 מיליון אנשים ברחבי העולם8. מחלת פרקינסון נקשרה גנטית למיטופגיה, מסלול בקרת איכות מיטוכונדריאלי הנחוץ לשמירה על הומאוסטזיס תאי המסיר באופן סלקטיבי מיטוכונדריהפגומה 9,10. מחקרים זיהו מספר מסלולי מיטופגיה בלתי תלויים, כולל תחום FUN14 המכיל מיטופגיה בתיווך 1 (FUNDC1), מיטופגיה בהנחיית Bcl-2 3 (BNIP3), מיטופגיה תלוית NIX, ומיטופגיה 1 המושרה על ידי PTEN (PINK1)/מיטופגיה מווסתת פרקין10,11. PINK1 (קינאז משוער) ופרקין (E3 יוביקוויטין ליגאז) פועלים יחד עם מיטוכונדריה פגומה של פוספו-יוביקוויטינאט, אשר מניעה את היווצרותם של אוטופגוזומים הבולעים את האברון הפגוע ומתמזגים עם ליזוזומים כדי ליזום פירוק 12,13,14,15,16. מוטציות בפרקין נקשרו לפנוטיפים הקשורים לפרקינסון כגון ניוון עצבי באמצעות אובדן נוירונים דופמינרגיים17,18.

כאן, מתואר פרוטוקול שבו תאי HeLa, תאים אימורטליים בשימוש שגרתי שמקורם בסרטן צוואר הרחם, משמשים לחקור את התפקיד של פרקין בשמירה על בריאות הרשת המיטוכונדריאלית. תאי HeLa מבטאים רמות זניחות של פרקין אנדוגני ולכן דורשים ביטוי אקסוגני של פרקין19. כדי לחקור את תפקידו של פרקין בבריאות הרשת המיטוכונדריאלית, תאי HeLa נגועים בפרקין מסוג פרא (ParkinWT), מוטנט פרקין (ParkinT240R), או וקטור בקרה ריק. פרקיןT240R היא מוטציה אוטוזומלית רצסיבית לפרקינסוניזם נעורים המשפיעה על פעילות ליגאז פרקין E3, ומפחיתה משמעותית את יעילות מסלול המיטופגיה20. תאי HeLa כפופים לריכוזים קלים (5 מיקרומטר) או חמורים (20 מיקרומטר) של קרבוניל ציאניד m-כלורופניל הידרזון (CCCP), חומר לפירוק צימוד מיטוכונדריאלי. טיפול בריכוזים חמורים של CCCP משמש באופן שגרתי להשראת מיטופגיה בתיווך פרקין בשורות תאים שונות, כגון HeLa ותאי COS-721,22,23.

לאחר הטיפול, הפרוטוקול משתמש בהדמיה חיה של הרשת המיטוכונדריאלית באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיים ממוקדים במיטוכונדריה הזמינים כיום. טטרמתילרודמין, אתיל אסטר, פרכלורט (TMRE) הוא צבע קטיוני המפליא בהתבסס על פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי24, ואילו מיטוסוקס הוא אינדיקטור סופראוקסיד מיטוכונדריאלי שבו עוצמת הפלואורסצנטיות היא פונקציה של ריכוז סופראוקסיד25. לבסוף, הפרוטוקול המתואר משתמש בכימות מבוסס פלואורסצנטיות ובזרימת עבודה פשוטה כדי לכמת ביעילות את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד עם טווח מינימלי להטיית המשתמש. למרות שפרוטוקול זה נועד לחקור את תפקוד המיטוכונדריה בתאי HeLa, ניתן להתאים אותו לקווי תאים נוספים ולסוגי תאים ראשוניים כדי לאפיין כמותית את בריאות הרשת המיטוכונדריאלית.

Protocol

1. הכנת דגימות ביולוגיות

הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות טכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית. רססו את פני הארון ואת כל החומרים באתנול 70%.

  1. תרבית תאי HeLa וטרנספקציה
    1. תרבית 30,000 תאי HeLa בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכילים 4.5 גרם / ליטר גלוקוז בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ותמיסת L-גלוטמין 1% (HeLa media; ראה טבלת חומרים). לוחים את התאים על צלחות הדמיה בעלות תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ (ראו Table of Materials) המכילות 2 מ"ל של מדיה HeLa שחוממה מראש. שמור על תרביות HeLa ב 5% CO2 ו 37 ° C26,27.
    2. יום לאחר הציפוי, בדקו את צלחות ההדמיה בקוטר 35 מ"מ באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהתאים נמצאים ~50%-60% במפגש. לאחר המפגש, העבירו את תאי HeLa עם וקטור ריק של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), YFP-ParkinWT או YFP-ParkinT240R (איור 1A).
    3. הכינו שתי תערובות נפרדות בצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות לכל טרנספקציה. מערבבים על ידי הקשה על הצינור או בעדינות למעלה ולמטה.
      1. בצינור 1, מערבבים 200 μL של מדיה מופחתת בסרום (ראו טבלת חומרים) עם 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד.
      2. בצינור 2, יש לערבב 200 μL של מדיה מופחתת בסרום עם 6 μL של מגיב טרנספקציה (ראה טבלת חומרים)28.
    4. לדגור על הצינורות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). מוסיפים את צינור 2 לצינור 1, מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ודגרים במשך 20 דקות ב-RT.
    5. הוסיפו את קומפלקסי הטרנספקציה לכלי ההדמיה הקיימים המכילים את תרביות תאי HeLa, ומבטיחים פיזור שווה על פני כל המנה. הניחו את צלחות ההדמיה באינקובטור של 5% CO2 ו-37°C למשך הלילה.
      הערה: יש לתייג כל מנה בפלסמיד המזוהם המתאים. עבור כל ניסוי, תייגו את שלוש צלחות YFP-ParkinWT (דימתיל סולפוקסיד [DMSO; ראו טבלת חומרים], 5 מיקרומטר CCCP ו-20 מיקרומטר CCCP). חזור על התיוג עם שלוש צלחות YFP-ParkinT240R ושלוש הצלחות הווקטוריות הריקות של YFP.
  2. הכנת CCCP וצבעים פלואורסצנטיים
    זהירות: צבעים פלואורסצנטיים הם לעתים קרובות רגישים לאור. אחסנו את הצבעים בחושך באמצעות רדיד אלומיניום או צינורות צנטריפוגות חומות כדי להפחית את החשיפה לאור.
    1. צור מלאי עבודה של 5 מ"מ של CCCP (ראה טבלת חומרים) על ידי המסת 5 מ"ג של CCCP ב- 4.89 מ"ל של DMSO. צור מלאי עבודה של 20 mM של CCCP על ידי המסת 5 מ"ג של CCCP ב 1.22 מ"ל של DMSO.
    2. לדלל 10 μL של 1 mM MitoTracker אדום עמוק (ראה טבלה של חומרים) תמיסת מלאי ב 390 μL של DMSO כדי ליצור מלאי עבודה של 25 מיקרומטר.
    3. המס 50 מיקרוגרם של MitoSOX Red25 (ראה טבלת חומרים) ב-13 מיקרוליטר של DMSO ליצירת מלאי עבודה של 5 מילימטר.
    4. יש להמיס 10 מ"ג של TMRE24 (ראו טבלת חומרים) ב-19.4 מ"ל של DMSO ליצירת תמיסת מלאי של 1 מילימטר. דללו את ה-TMRE על ידי הוספת 10 μL של 1 mM TMRE ל-990 μL של DMSO כדי ליצור מלאי עבודה של 10 מיקרומטר.

2. טיפול CCCP ותיוג מיטוכונדריאלי עם בדיקות פלואורסצנטיות בתאי HeLa

התראה: בצע את השלבים הבאים במהירות כדי להבטיח שתאי HeLa לא יהיו מחוץ לאינקובטור לתקופה ממושכת.

  1. יום לאחר הטרנספקציה, הוסף 2 μL של 5 או 20 mM CCCP (ריכוז סופי: 5 μM ו- 20 μM, בהתאמה) לכל צלחת ניסוי. עבור לוחות בקרה, הוסף 2 μL של DMSO. החזירו את הלוחות לאינקובטור של 5% CO2 ו-37°C למשך שעה וחצי (איור 1A).
    הערה: טיפול CCCP הוא בסך הכל 2 שעות. עם זאת, המיטוכונדריה מסומנים בבדיקות פלואורסצנטיות במהלך 30 הדקות האחרונות של טיפול CCCP.
  2. לאחר שעה וחצי, מוציאים את הצלחות מהאינקובטור ומוסיפים גשושיות פלורסנט לצלחות ההדמיה. החזירו את הצלחות לאינקובטור של 5%CO2 ו-37°C למשך 30 דקות (איור 1A).
    1. ניסוי TMRE: הוסף 2 μL של 25 μM MitoTracker (ריכוז סופי: 25 nM) ו-2 μL של 10 μM TMRE (ריכוז סופי: 10 nM).
    2. ניסוי MitoSOX: הוסף 2 μL של 25 μM MitoTracker (ריכוז סופי: 25 nM) ו 1 μL של 5 mM MitoSOX (ריכוז סופי: 2.5 μM).
  3. לאחר טיפול CCCP של שעתיים, הכינו את תאי HeLa לדימות (איור 1A,B).
    1. ניסוי TMRE: תאי HeLa מוכנים מיד לצילום; לוודא שה-TMRE נשאר במדיה של תרביות תאי HeLa.
    2. ניסוי MitoSOX: שטפו את התאים 3x עם 2 מ"ל של מדיה HeLa שחוממה מראש כדי להסיר צבע MitoSOX חופשי. הוסף 2 מ"ל של מדיה מחוממת מראש. תאי HeLa מוכנים כעת לצילום.
      הערה: שטפו את תאי HeLa במדיית HeLa טרייה שחוממה מראש המכילה את אותו ריכוז DMSO או CCCP כמו בתנאי הניסוי; אל תכלול את MitoSOX או MitoTracker.

3. הגדרת רכישת תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי

הערה: דמיינו את תאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ראו טבלת חומרים) המצויד במטרה לטבילה בשמן עם צמצם נומרי 63x/1.40 (NA) ותא סביבתי (ראו טבלת חומרים).

  1. בשעה 1 שעה לפני ההדמיה, הפעל את CO2 על ידי פתיחת שסתום המיכל. לחץ על לחצן מופעל כדי להפעיל את בקר הסביבה עבור המיקרוסקופ. השתמש בחצים למעלה ולמטה בלוח המגע כדי לכוונן את הטמפרטורה ל- 37° צלזיוס ואת ה- CO2 עד 5%. לחץ על הגדר בסיום.
    הערה: ודא שהדלתות לתא הסביבתי סגורות והמתן עד שהתנאים יתייצבו.
  2. הגדרות לייזר
    1. הפעל את לייזר האור הלבן (WLL) והגדר את עוצמת הלייזר ל- 85% ואת בקרת העירור לעוצמה מרבית. לחץ על הכרטיסיה רכישה, בחר הוסף לייזר, ובתיבת הדו-שיח שמופיעה, העבר את WLL למצב פועל. לחץ על לחצן הפעלת לייזר והזן 85%. לחץ על לחצן בקרת עירור ובחר עוצמה מרבית מהתפריט הנפתח (איור 2A).
    2. ניסוי TMRE: הגדר את ספקטרום העירור והפליטה עבור YFP, MitoTracker ו-TMRE.
      1. עבור YFP, הגדר את לייזר העירור ל- 514 ננומטר ואת חלון ספקטרום הפליטה ל- 524-545 ננומטר. בכרטיסיה רכישה, לחץ על לחצן הוסף הגדרה חדשה; לאחר מכן, לחץ על הוסף לייזר וגרור אותו אל הגדרה 1. לחץ פעמיים על קו העירור והזן 514 כאורך הגל בתיבת הדו-שיח. לחץ פעמיים על הגלאי המתאים והזן 524 עבור ההתחלה ו- 545 עבור אורך הגל הסופי.
      2. עבור MitoTracker אדום עמוק, הגדר את לייזר העירור ל- 641 ואת חלון ספקטרום הפליטה ל- 650-750 ננומטר. בכרטיסיה רכישה, לחץ על הוסף לייזר לחצן וגרור אותו אל הגדרה 1. לחץ פעמיים על קו העירור והזן 641 כאורך הגל בתיבת הדו-שיח. לחץ פעמיים על הגלאי המתאים והזן 650 עבור ההתחלה ו 750 עבור אורך הגל הסופי.
      3. עבור TMRE, הגדר את לייזר העירור ל- 555 ננומטר ואת חלון ספקטרום הפליטה ל- 557-643 ננומטר. בכרטיסיה רכישה, לחץ על לחצן הוסף הגדרה חדשה; לאחר מכן, לחץ על הוסף לייזר כפתור וגרור אותו לתוך הגדרה 2. לחץ פעמיים על קו העירור והזן 555 כאורך הגל בתיבת הדו-שיח. לחץ פעמיים על הגלאי המתאים והזן 557 עבור ההתחלה ו- 643 עבור אורך הגל הסופי.
    3. ניסוי MitoSOX: הגדר את ספקטרום העירור והפליטה עבור YFP, MitoTracker ו- MitoSOX (איור 2B).
      1. עבור YFP, הגדר את לייזר העירור ל- 507 ננומטר ואת חלון ספקטרום הפליטה ל- 517-540 ננומטר. בכרטיסיה רכישה, לחץ על לחצן הוסף הגדרה חדשה; לאחר מכן, לחץ על הוסף לייזר כפתור וגרור אותו אל הגדרה 1. לחץ פעמיים על קו העירור והזן 507 כאורך הגל בתיבת הדו-שיח. לחץ פעמיים על הגלאי המתאים והזן 517 עבור ההתחלה ו- 540 עבור אורך הגל הסופי.
      2. עבור MitoSOX, הגדר את לייזר העירור ל- 547 ננומטר ואת חלון ספקטרום הפליטה ל- 564-636 ננומטר. בכרטיסיה רכישה , לחץ על לחצן הוסף הגדרה חדשה ; לאחר מכן, לחץ על הוסף לייזר כפתור וגרור אותו לתוך הגדרה 2. לחץ פעמיים על קו העירור והזן 547 כאורך הגל בתיבת הדו-שיח. לחץ פעמיים על הגלאי המתאים והזן 564 עבור ההתחלה ו- 636 עבור אורך הגל הסופי.
      3. עבור MitoTracker אדום עמוק, הגדר את לייזר העירור ל- 641 ננומטר ואת חלון ספקטרום הפליטה ל- 652-742 ננומטר. בכרטיסיה רכישה, לחץ על לחצן הוסף הגדרה חדשה; לחץ על הוסף לייזר כפתור וגרור אותו לתוך הגדרה 3. לחץ פעמיים על קו העירור והזן 641 כאורך הגל בתיבת הדו-שיח. לחץ פעמיים על הגלאי המתאים והזן 652 עבור ההתחלה ו- 742 עבור אורך הגל הסופי.
  3. הגדרות רכישת תמונה (איור 2C)
    1. הגדר את התבנית ל- 1,024 x 1,024, את מהירות הסריקה ל- 600 הרץ ואת ממוצע הקו ל- 3.
      1. בחר בכרטיסייה רכישה ולחץ על הלחצן עיצוב . מהתפריט הנפתח, בחר 1,024 x 1,024. לחץ על מהירות כפתור ובחר 600 מהתפריט הנפתח. לאחר מכן, לחץ על קו ממוצע לחצן, ומהתפריט הנפתח, בחר 3.
      2. הפעל סריקה דו-כיוונית והגדר את גורם הפאזה והזום ל- 22.61 ו- 1.50, בהתאמה.
        1. בכרטיסיה רכישה, העבר את הלחצן הדו-כיווני למצב פועל. לחץ על הגדרת שלב X והגדר אותה ל- 22.61. לחץ על ההגדרה Zoom Factor והגדר אותה ל- 1.50.

4. רכישת תמונות

זהירות: הנסיין חייב לבצע שיפוט חזותי כדי לבחור את התאים בהתבסס על אות הפלואורסצנטיות YFP. הימנעו מפיקסלים רוויים יתר על המידה, מכיוון שהם יכולים להשפיע באופן משמעותי על כימות עוצמת הפלואורסצנטיות. השתמשו בטבלת בדיקת מידע מעל/מתחת המציינת את רוויית הפיקסלים כדי להימנע מקבלת תמונות רוויות.

  1. לחץ על הגדרת עניין ולחץ על Fast Live כדי לספק תצוגה מקדימה חיה של תמונת הפלואורסצנטיות.
  2. התאם את הרווח והעוצמה על ידי לחיצה כפולה על הגלאי המתאים. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, התאם את המחוון רווח באמצעות המחוון. כדי לשנות את העוצמה, לחץ פעמיים על קו העירור והשתמש בחצים למעלה ולמטה בחלון המוקפץ כדי לשנות את העוצמה. לחץ על עצור כדי לסיים את התצוגה המקדימה.
    1. ניסוי TMRE: דמיינו תחילה את לוח הבקרה של DMSO. כוונן את הרווח והעוצמה של אות TMRE (הגדרה 2) כך שעוצמת הרשת המיטוכונדריאלית תהיה מעט מתחת לרוויה; שמור על רווח ועוצמה קבועים עבור הניסוי. התאם את הרווח והעוצמה של MitoTracker ו- YFP (הגדרה 1) כך שהרשת המיטוכונדריאלית תהיה גלויה אך עמומה.
    2. ניסוי MitoSOX: דמיינו תחילה את לוח הבקרה של DMSO. כוונן את הרווח והעוצמה של אות MitoSOX (הגדרה 2) כך שהפלואורסצנטיות תהיה גלויה אך עמומה; שמור על רווח ועוצמה קבועים עבור הניסוי. התאם את הרווח והעוצמה של YFP (הגדרה 1) ו- MitoTracker (הגדרה 3) כך שהרשת המיטוכונדריאלית תהיה גלויה אך עמומה.
      הערה: רשום את העלייה והעוצמה של TMRE ו- MitoSOX, מכיוון שערכים אלה חייבים להישאר קבועים לאורך כל הניסוי. אותות הפלואורסצנטיות של YFP ו- MitoTracker אינם מכומתים בפרוטוקול זה. לכן, ניתן להתאים את הרווח והעוצמה לכל תמונה. זה היעיל ביותר לקבל את הגדרות הרווח והעוצמה שבהן התאים קלים לראות אך עדיין עמומים, כדי להבטיח שהתאים אינם חשופים לעוצמות לייזר מוגזמות הגורמות נזק לתאים או הלבנה.
  3. לאחר השלמת הגדרות ההגברה והעוצמה, לחץ על התחל כדי לקבל תמונה. לרכוש תמונות של 20 תאים לכל תנאי ניסוי (למשל, חמש תמונות עם ארבעה תאים בכל תמונה; איור 2D).

5. כימות עוצמת פלואורסצנטיות באמצעות ImageJ

הערה: קובצי הדמיה נשמרים כ- ".lif" ותואמים ל- ImageJ29. סוגי קבצים תואמים עם ImageJ מפורטים באתר האינטרנט שלהם. ייתכן שיהיה צורך להמיר את סוג הקובץ אם הוא אינו תואם.

  1. צור ושמור אזור עניין (ROI).
    1. ב- ImageJ, לחץ על קובץ | חדש | תמונה. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, לחץ על אישור.
    2. לחץ על הלחצן כלי מלבן וצייר תיבה בגודל 6 מיקרון x 6 מיקרון. פתח את מנהל החזר ההשקעה על-ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל החזר השקעה והמתן להופעת תיבת דו-שיח עם מנהל החזר ההשקעה (איור 3A). הוסף את החזר ההשקעה המלבני למנהל על-ידי לחיצה על הוסף בתיבת הדו-שיח מנהל. שמור את החזר ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות עוד, ולאחר מכן לחץ על הלחצן שמור ועל אישור.
  2. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות.
    1. בתמונה J, לחץ על קובץ ובחר פתח. בתיבת הדו-שיח, בחרו בקובצי ההדמיה של הניסוי ולחצו על הלחצן 'פתח'.
    2. המתינו להופעת החלון 'אפשרויות ייבוא של תבניות ביולוגיות' (איור 3B). בחרו 'פיצול ערוצים ' ולחצו על ' פתח'.
      הערה: תכונת הערוצים המפוצלים מאפשרת לפתוח כל ערוץ בתמונה כחלון נפרד. הזמנת הערוץ תואמת את הזמנת הרכש.
      1. ניסויי TMRE: YFP (הגדרה 1) הוא הערוץ הראשון (c = 0); MitoTracker (הגדרה 1) הוא הערוץ השני (c = 1); ו-TMRE (הגדרה 2) הוא הערוץ השלישי (c = 2).
      2. ניסויי MitoSOX: YFP (הגדרה 1) הוא הערוץ הראשון (c = 0); MitoSOX (הגדרה 2) הוא הערוץ השני (c = 1); ו- MitoTracker (הגדרה 3) הוא הערוץ השלישי (c = 2).
    3. התאם את הבהירות על-ידי בחירה באפשרות תמונה | התאמה | בהירות (איור 3C).
      הערה: אל תלחץ על Set או Apply כדי להבטיח שבהירות התמונה לא תשתנה לצמיתות. לעיתים, עוצמת הפלואורסצנטיות אינה נראית בתעלות TMRE או MitoSOX. כוונן את הבהירות כדי לאפשר תצוגה חזותית קלה יותר. שינוי הבהירות אינו משפיע על ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית.
    4. לחצו על ' נתח ' ובחרו ' קבע מדידות'. סמן את התיבות אזור וממוצע ערך אפור ולחץ על אישור (איור 3D).
      הערה: הערך האפור הממוצע הוא עוצמת הפלואורסצנטיות.
    5. פתח את מנהל החזר ההשקעה וטען את החזר ההשקעה שנשמר בשלב 5.1 על-ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל החזר השקעה. במנהל החזר ההשקעה, לחץ על עוד, ולאחר מכן על פתח מהרשימה שמופיעה, ובחר את החזר ההשקעה שנשמר.
    6. מדדו את עוצמת הפלואורסצנטיות של חמישה אזורים אקראיים בתא בודד על-ידי בחירת החזר ההשקעה שנשמר ממנהל החזר ההשקעה והעבירו את החזר ההשקעה למיקום אקראי בתוך תא (איור 3E). מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות על ידי לחיצה על M. חזור על שלב זה עם ארבעה אזורים נוספים שאינם חופפים. כשמופיעה תיבת דו-שיח עם האזור והערכים האפורים הממוצעים (איור 3F), העתק והדבק את הערכים בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.
      1. ניסוי TMRE: בחר תמונה (c = 2).
      2. ניסוי MitoSOX: בחר תמונה (c = 2).
    7. קבל את ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת. באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני (ראה טבלת חומרים), ממוצע חמשת הערכים האפורים הממוצעים. חזור על תהליך זה עבור כל תא.
    8. לנתח ולהשוות את הערכים האפורים הממוצעים של TMRE או MitoSOX על פני תנאי ניסוי באמצעות תוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים; איור 4 ואיור 5). הצג נתונים כתרשימי עמודות או כתרשימי כינור.

תוצאות

בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בכימות מבוסס פלואורסצנטיות כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה ואת רמות הסופראוקסיד של הרשת המיטוכונדריאלית לאחר טיפול CCCP (איור 1). תהליך עבודה זה השתמש בתאי HeLa, קו תאים אימורטלי שמקורו בסרטן צוואר הרחם. תאי HeLa משמשים באופן שגרתי לחקר ביולוגיה מיטוכונדרי...

Discussion

ניתן להשתמש בתהליך העבודה המתואר כאן כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בצורה חזקה וניתנת לשחזור באמצעות הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות30. ישנן מגבלות טכניות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים אלה. תאי HeLa הודבקו בווקטור YFP ריק, YFP-ParkinWT א...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מעבדת אוונס על המשוב המתחשב שלהם על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכת על ידי מלגות דיוק וייטהד, חוקרי המדע והטכנולוגיה של דיוק ומלגת חנה גריי של המכון הרפואי הווארד יוז (HHMI). איור 1A נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195HeLa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved