כימות מבוסס פלואורסצנטיות של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד באמצעות הדמיה חיה בתאי HeLa

Summary

טכניקה זו מתארת זרימת עבודה יעילה כדי להמחיש ולמדוד כמותית את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בתוך תאי HeLa באמצעות הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנטיות.

Abstract

מיטוכונדריה הם אברונים דינמיים החיוניים להומאוסטזיס מטבולי על ידי שליטה בייצור האנרגיה באמצעות סינתזת ATP. כדי לתמוך בחילוף החומרים בתאים, מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריאליים שונים משתפים פעולה כדי לשמור על רשת מיטוכונדריאלית בריאה. מסלול אחד כזה הוא מיטופגיה, שבה קינאז 1 המושרה על ידי PTEN (PINK1) ופרקין פוספו-יוביקוויטינציה של מיטוכונדריה פגומה מסייעים לקיבוע אוטופגוזום ולאחר מכן לסילוק מהתא באמצעות איחוי ליזוזומים. מיטופגיה חשובה להומאוסטזיס תאי, ומוטציות בפרקין קשורות למחלת פרקינסון (PD). בשל ממצאים אלה, הושם דגש משמעותי על חקירת נזק ותחלופת מיטוכונדריה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים והדינמיקה של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. כאן, נעשה שימוש בהדמיה של תאים חיים כדי להמחיש את הרשת המיטוכונדריאלית של תאי HeLa, כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד לאחר טיפול בקרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), חומר לפירוק צימוד מיטוכונדריאלי. בנוסף, מוטציה הקשורה לפרקינסון של פרקין (Parkin^T240R) המעכבת מיטופגיה תלוית פרקין באה לידי ביטוי כדי לקבוע כיצד ביטוי מוטנטי משפיע על הרשת המיטוכונדריאלית בהשוואה לתאים המבטאים פרקין מסוג פרא. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר זרימת עבודה פשוטה באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנטיות לכימות יעיל של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד.

Introduction

הרשת המיטוכונדריאלית היא סדרה של אברונים מחוברים זה לזה הממלאים תפקיד מכריע בייצור אנרגיה¹, חסינות מולדת^2,3 ואיתות תאי ^4,5. חוסר ויסות מיטוכונדריאלי נקשר למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון (PD)^6,7. פרקינסון היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המשפיעה על נוירונים דופמינרגיים של החומר השחור המשפיעה על כמעט 10 מיליון אנשים ברחבי העולם⁸. מחלת פרקינסון נקשרה גנטית למיטופגיה, מסלול בקרת איכות מיטוכונדריאלי הנחוץ לשמירה על הומאוסטזיס תאי המסי....

Protocol

1. הכנת דגימות ביולוגיות

הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות טכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית. רססו את פני הארון ואת כל החומרים באתנול 70%.

1. תרבית תאי HeLa וטרנספקציה
   1. תרבית 30,000 תאי HeLa בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכילים 4.5 גרם / ליטר גלוקוז בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ותמיסת L-גלוטמין 1% (HeLa media; ראה טבלת חומרים). לוחים את התאים על צלחות הדמיה בעלות תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ (ראו Table of Materials) המכילות 2 מ"ל של מדיה HeLa שחוממה מראש. שמור על תרביות HeLa ב 5% CO₂ ו 37 ° C^26,27.
   ....

תוצאות

בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בכימות מבוסס פלואורסצנטיות כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה ואת רמות הסופראוקסיד של הרשת המיטוכונדריאלית לאחר טיפול CCCP (איור 1). תהליך עבודה זה השתמש בתאי HeLa, קו תאים אימורטלי שמקורו בסרטן צוואר הרחם. תאי HeLa משמשים באופן שגרתי לחקר ביולוגיה מיטוכונדרי.......

Discussion

ניתן להשתמש בתהליך העבודה המתואר כאן כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בצורה חזקה וניתנת לשחזור באמצעות הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות³⁰. ישנן מגבלות טכניות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים אלה. תאי HeLa הודבקו בווקטור YFP ריק, YFP-Parkin^WT א.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anhydrous	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	This Paper	Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope	Leica	N/A
LIGHTNING Deconvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 confocal microscope	Leica	N/A