Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод описывает эффективный рабочий процесс для визуализации и количественного измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида в клетках HeLa с использованием флуоресцентной визуализации в реальном времени.

Аннотация

Митохондрии являются динамическими органеллами, критически важными для метаболического гомеостаза, контролируя выработку энергии посредством синтеза АТФ. Для поддержки клеточного метаболизма различные механизмы контроля качества митохондрий взаимодействуют для поддержания здоровой митохондриальной сети. Одним из таких путей является митофагия, при которой PTEN-индуцированная киназа 1 (PINK1) и фосфо-убиквитинирование Паркина поврежденных митохондрий способствуют секвестрации аутофагосом и последующему удалению из клетки посредством слияния лизосом. Митофагия важна для клеточного гомеостаза, а мутации в Паркине связаны с болезнью Паркинсона (БП). В связи с этими выводами значительное внимание уделялось исследованию повреждений и оборота митохондрий, чтобы понять молекулярные механизмы и динамику контроля качества митохондрий. Здесь визуализация живых клеток использовалась для визуализации митохондриальной сети клеток HeLa, для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида после обработки карбонильным цианидом м-хлорфенилгидразоном (CCCP), митохондриальным разъединяющим агентом. Кроме того, была экспрессирована мутация паркина, связанная с болезнью Паркина (ParkinT240R), которая ингибирует паркин-зависимую митофагию, чтобы определить, как экспрессия мутантов влияет на митохондриальную сеть по сравнению с клетками, экспрессирующими паркин дикого типа. Протокол, описанный здесь, описывает простой рабочий процесс с использованием подходов, основанных на флуоресценции, для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида.

Введение

Митохондриальная сеть представляет собой ряд взаимосвязанных органелл, которые играют решающую роль в производстве энергии1, врожденном иммунитете2,3 и клеточной сигнализации 4,5. Митохондриальная дисрегуляция была связана с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)6,7. БП — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, поражающее дофаминергические нейроны черной субстанции, которое поражает почти 10 миллионов человек во всем ....

протокол

1. Подготовка биологических образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги, используя стерильную технику в шкафу биобезопасности. Сбрызните поверхность шкафа и всех материалов 70% этанолом.

  1. Культивирование и трансфекция клеток HeLa
    1. Культивирование 30 000 клеток HeLa в модифицированной среде орла (DMEM) Дульбекко, содержащей 4,5 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% раствора L-глютамина (HeLa media; см. Таблицу материалов). Поместите ячейки на 35-миллиметровые чашки для визуализации состеклянным дном (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл предва....

Результаты

В этом протоколе количественное определение на основе флуоресценции использовалось для измерения мембранного потенциала и уровней супероксида митохондриальной сети после обработки CCCP (рис. 1). В этом рабочем процессе использовались клетки HeLa, иммортализированная кле?.......

Обсуждение

Рабочий процесс, описанный здесь, может быть использован для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида надежно и воспроизводимо с использованием флуоресцентной визуализации30. Существуют важные технические ограничения, которые сл.......

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Эванса за их вдумчивые отзывы об этой рукописи. Эта работа поддерживается стипендиатами Дьюка Уайтхеда, учеными в области науки и техники Дьюка и стипендией Ханны Грей Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI). Рисунок 1А был сделан с использованием BioRender.com.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

Ссылки

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195HeLa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены