HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

요약

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

초록

미토콘드리아는 ATP 합성을 통해 에너지 생산을 조절하여 대사 항상성에 중요한 동적 세포 기관입니다. 세포 대사를 지원하기 위해 다양한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘이 협력하여 건강한 미토콘드리아 네트워크를 유지합니다. 그러한 경로 중 하나는 손상된 미토콘드리아의 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1) 및 파킨 포스포-유비퀴틴화가 리소좀 융합을 통해 세포에서 자가포식소 격리 및 후속 제거를 촉진하는 미토파지입니다. 유사분열은 세포 항상성에 중요하며 파킨의 돌연변이는 파킨슨병(PD)과 관련이 있습니다. 이러한 발견으로 인해 미토콘드리아 품질 관리의 분자 메커니즘과 역학을 이해하기 위해 미토콘드리아 손상 및 회전율을 조사하는 데 상당한 중점을 두었습니다. 여기에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하고 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)으로 처리한 후 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준을 정량화했습니다. 또한, 파킨 의존성 미토파지를 억제하는 파킨의 PD 연관 돌연변이(Parkin^T240R)를 발현하여 돌연변이 발현이 야생형 파킨을 발현하는 세포와 비교하여 미토콘드리아 네트워크에 어떤 영향을 미치는지 확인했습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화하기 위해 형광 기반 접근 방식을 사용하는 간단한 워크플로를 설명합니다.

서문

미토콘드리아 네트워크는 에너지 생산1, 선천면역^2,3, 세포신호전달^4,5에 중요한 역할을 하는 일련의 상호 연결된 세포기관이다. 미토콘드리아 조절 장애는 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다^6,7. PD는 전 세계적으로 거의 1,000만 명에게 영향을 미치는 흑질의 도파민성 뉴런에 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 장애입니다⁸. PD는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 세포 항상성을 유지하는 데 필요한 미토콘드리아 품질 관리 경로인 미토파지와 유전적으로 연결되어 있습니다 ^9,10. 연구에 따르면 FUN14 도메인 포함 1(FUNDC1) 매개 미토파지, Bcl-2 상호 작용 단백질 3(BNIP3) 촉진 미토파지, NIX 의존성 미토파지 및 잘 특성화된 P....

프로토콜

1. 생물학적 시료의 제조

알림: 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. 캐비닛 표면과 모든 재료에 70% 에탄올을 뿌립니다.

1. HeLa 세포 배양 및 형질주입
   1. 10% 소 태아 혈청과 1% L-글루타민 용액이 보충된 4.5g/L 포도당을 함유하는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)에서 30,000개의 HeLa 세포를 배양합니다(HeLa media; 표 참조). 2mL의 예열된 HeLa 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 이미징 접시(T able of Materials 참조)에 세포를 플레이트합니다. HeLa 배양물을 5%_CO2 및 37°C에서^{유지한다 26,27}.
   2. 도금 다음 날 광학 현미경을 사용하여 35mm 이미징 접시를 검사하여 셀이 ~50%-60% 합류하는지 확인합니다. 일단 합류하면 빈 노란색 형광 단백질(YFP) 벡터, YFP-Parkin^WT 또는 YFP-Parkin^T240R

토론

여기에 요약된 워크플로우는 형광 기반 이미징을 사용하여 미토콘드리아 막 전위와 슈퍼옥사이드 수준을 강력하고 재현성 있게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다(³⁰). 이러한 실험을 설계할 때 고려해야 할 중요한 기술적 제한 사항이 있습니다. HeLa 세포를 빈 YFP 벡터, YFP-Parkin^WT, 또는 YFP-Parkin^T240R로 형질감염시켰다. 실험 결과가 파킨에 특이적인지 확인하기 위?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anhydrous	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	This Paper	Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope	Leica	N/A
LIGHTNING Deconvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 confocal microscope	Leica	N/A