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요약

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

초록

미토콘드리아는 ATP 합성을 통해 에너지 생산을 조절하여 대사 항상성에 중요한 동적 세포 기관입니다. 세포 대사를 지원하기 위해 다양한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘이 협력하여 건강한 미토콘드리아 네트워크를 유지합니다. 그러한 경로 중 하나는 손상된 미토콘드리아의 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1) 및 파킨 포스포-유비퀴틴화가 리소좀 융합을 통해 세포에서 자가포식소 격리 및 후속 제거를 촉진하는 미토파지입니다. 유사분열은 세포 항상성에 중요하며 파킨의 돌연변이는 파킨슨병(PD)과 관련이 있습니다. 이러한 발견으로 인해 미토콘드리아 품질 관리의 분자 메커니즘과 역학을 이해하기 위해 미토콘드리아 손상 및 회전율을 조사하는 데 상당한 중점을 두었습니다. 여기에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하고 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)으로 처리한 후 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준을 정량화했습니다. 또한, 파킨 의존성 미토파지를 억제하는 파킨의 PD 연관 돌연변이(ParkinT240R)를 발현하여 돌연변이 발현이 야생형 파킨을 발현하는 세포와 비교하여 미토콘드리아 네트워크에 어떤 영향을 미치는지 확인했습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화하기 위해 형광 기반 접근 방식을 사용하는 간단한 워크플로를 설명합니다.

서문

미토콘드리아 네트워크는 에너지 생산1, 선천면역2,3, 세포신호전달4,5에 중요한 역할을 하는 일련의 상호 연결된 세포기관이다. 미토콘드리아 조절 장애는 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다6,7. PD는 전 세계적으로 거의 1,000만 명에게 영향을 미치는 흑질의 도파민성 뉴런에 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 장애입니다8. PD는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 세포 항상성을 유지하는 데 필요한 미토콘드리아 품질 관리 경로인 미토파지와 유전적으로 연결되어 있습니다 9,10. 연구에 따르면 FUN14 도메인 포함 1(FUNDC1) 매개 미토파지, Bcl-2 상호 작용 단백질 3(BNIP3) 촉진 미토파지, NIX 의존성 미토파지 및 잘 특성화된 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1)/파킨 조절 미토파지10,11. PINK1(추정 키나아제)과 파킨(E3 유비퀴틴 리가아제)은 손상된 포스포-유비퀴티네이트 손상된 미토콘드리아와 함께 작용하여 손상된 세포 소기관을 삼키고 리소좀과 융합하여 분해를 시작하는 자가포식소체의 형성을 유도합니다 12,13,14,15,16. Parkin의 돌연변이는 도파민성 뉴런의 손실을 통한 신경변성과 같은 PD 관련 표현형과 관련이 있습니다17,18.

여기에서는 자궁경부암에서 유래한 불멸화 세포인 HeLa 세포를 사용하여 미토콘드리아 네트워크 건강을 유지하는 데 있어 Parkin의 역할을 조사하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. HeLa 세포는 무시할 수 있는 수준의 내인성 파킨을 발현하므로 외인성 파킨 발현이 필요하다19. 미토콘드리아 네트워크 건강에서 파킨의 역할을 연구하기 위해 HeLa 세포를 야생형 파킨(ParkinWT), 파킨 돌연변이(ParkinT240R) 또는 빈 대조군 벡터로 형질감염시킵니다. ParkinT240R은 Parkin E3 ligase 활성에 영향을 미치는 상염색체 열성 소아 파킨슨증 돌연변이로, 미토파지 경로20의 효율성을 크게 감소시킵니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)의 경증(5μM) 또는 중증(20μM) 농도에 노출됩니다. 중증 농도의 CCCP를 이용한 치료는 다양한 세포주, 예컨대 HeLa 및 COS-7 세포에서 파킨 매개 미토파지를 유도하기 위해 일상적으로 사용된다21,22,23.

치료 후 이 프로토콜은 현재 사용 가능한 두 가지 미토콘드리아 표적 형광 염료를 사용하여 미토콘드리아 네트워크의 라이브 이미징을 사용합니다. 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르, 과염소산염(TMRE)은 미토콘드리아 막 전위24를 기반으로 형광을 발하는 양이온성 염료이며, MitoSOX는 형광 강도가 과산화물 농도25의 함수인 미토콘드리아 과산화물 지표입니다. 마지막으로, 요약된 프로토콜은 형광 기반 정량화와 간단한 워크플로우를 사용하여 사용자 편향을 최소화하면서 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화합니다. 이 프로토콜은 HeLa 세포에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위해 설계되었지만 미토콘드리아 네트워크 건강을 정량적으로 특성화하기 위해 추가 세포주 및 일차 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 생물학적 시료의 제조

알림: 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. 캐비닛 표면과 모든 재료에 70% 에탄올을 뿌립니다.

  1. HeLa 세포 배양 및 형질주입
    1. 10% 소 태아 혈청과 1% L-글루타민 용액이 보충된 4.5g/L 포도당을 함유하는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)에서 30,000개의 HeLa 세포를 배양합니다(HeLa media; 표 참조). 2mL의 예열된 HeLa 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 이미징 접시(T able of Materials 참조)에 세포를 플레이트합니다. HeLa 배양물을 5%CO2 및 37°C에서유지한다 26,27.
    2. 도금 다음 날 광학 현미경을 사용하여 35mm 이미징 접시를 검사하여 셀이 ~50%-60% 합류하는지 확인합니다. 일단 합류하면 빈 노란색 형광 단백질(YFP) 벡터, YFP-ParkinWT 또는 YFP-ParkinT240R 로 HeLa 세포를 transfection합니다(그림 1A).
    3. 각 형질감염을 위해 멸균 미세 원심분리 튜브에 두 개의 개별 혼합물을 준비합니다. 튜브를 두드리거나 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
      1. 튜브 1에서 200 μL의 환원된 혈청 배지( 재료 표 참조)와 2 μg의 플라스미드 DNA를 혼합합니다.
      2. 튜브 2에서 200 μL의 환원된 혈청 배지와 6 μL의 형질주입 시약을 혼합합니다( 재료 표 참조)28.
    4. 실온(RT)에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브 2를 튜브 1에 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
    5. 형질주입 복합체를 HeLa 세포 배양물이 포함된 기존 이미징 접시에 적하하여 전체 접시에 균등하게 분포되도록 합니다. 이미징 디쉬를 5%CO2 및 37°C 인큐베이터에 밤새 넣는다.
      참고: 각 접시에 적절한 형질주입된 플라스미드로 라벨을 붙입니다. 각 실험에 대해 3개의 YFP-ParkinWT 접시(디메틸 설폭사이드[DMSO; 재료 표 참조], 5μM CCCP 및 20μM CCCP)에 라벨을 붙입니다. 3개의 YFP-ParkinT240R 접시와 3개의 빈 YFP 벡터 접시로 라벨링을 반복합니다.
  2. CCCP 및 형광 염료의 제조
    주의 : 형광 염료는 종종 빛에 민감합니다. 빛에 대한 노출을 줄이기 위해 알루미늄 호일이나 갈색 원심분리기 튜브를 사용하여 염료를 어두운 곳에 보관하십시오.
    1. 5mg의 CCCP를 4.89mL의 DMSO에 용해시켜 5mM의 CCCP 작업 스톡을 만듭니다( 재료 표 참조). 5mg의 CCCP를 1.22mL의 DMSO에 용해시켜 20mM의 CCCP 작업 재고를 만듭니다.
    2. 10μL의 1mM MitoTracker Deep Red( 재료 표 참조) 원액을 390μL의 DMSO에 희석하여 25μM의 작업 스톡을 만듭니다.
    3. 50 μg의 MitoSOX Red25 ( 재료 표 참조)를 13 μL의 DMSO에 용해시켜 5 mM 작업 스톡을 만듭니다.
    4. 10mg의 TMRE24 ( 재료 표 참조)를 19.4mL의 DMSO에 용해시켜 1mM 원액을 만듭니다. 10μL의 DMSO에 1mM TMRE 10μL를 첨가하여 TMRE를 희석하여 10μM 작업 스톡을 만듭니다.

2. HeLa 세포에서 형광 프로브를 사용한 CCCP 처리 및 미토콘드리아 표지

주의 : HeLa 세포가 장기간 인큐베이터에서 나오지 않도록 다음 단계를 신속하게 수행하십시오.

  1. 형질감염 다음 날, 5 또는 20 mM CCCP (최종 농도: 각각 5 μM 및 20 μM)의 2 μL를 각 실험 플레이트에 첨가한다. 컨트롤 플레이트의 경우 2μL의 DMSO를 추가합니다. 플레이트를 5%CO2 및 37°C 인큐베이터에서 1.5시간 동안 복귀시킨다(도 1A).
    참고: CCCP 치료는 총 2시간 동안입니다. 그러나 미토콘드리아는 CCCP 처리의 마지막 30분 동안 형광 프로브로 표지됩니다.
  2. 1.5 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 이미징 접시에 형광 프로브를 추가합니다. 플레이트를 30분 동안 5%CO2 및 37°C 인큐베이터로 되돌린다(도 1A).
    1. TMRE 실험: 25μM MitoTracker(최종 농도: 25nM) 2μL와 10μM TMRE(최종 농도: 10nM) 2μL를 추가합니다.
    2. MitoSOX 실험: 25μM MitoTracker(최종 농도: 25nM) 2μL와 5mM MitoSOX(최종 농도: 2.5μM) 1μL를 추가합니다.
  3. 2시간 CCCP 처리 후 이미징을 위해 HeLa 세포를 준비합니다(그림 1A, B).
    1. TMRE 실험: HeLa 세포는 즉시 이미지화할 준비가 됩니다. TMRE가 HeLa 세포 배양 배지에 남아 있는지 확인합니다.
    2. MitoSOX 실험: 예열된 HeLa 배지 2mL로 세포를 3배 세척하여 유리 MitoSOX 염료를 제거합니다. 예열 매체 2mL를 추가합니다. 이제 HeLa 세포를 이미지화할 준비가 되었습니다.
      참고: 실험 조건과 동일한 DMSO 또는 CCCP 농도를 포함하는 신선하고 예열된 HeLa 배지로 HeLa 세포를 세척합니다. MitoSOX 또는 MitoTracker는 포함하지 마십시오.

3. 컨포칼 현미경 이미지 획득 설정

참고: 63x/1.40 개구수(NA) 오일 이멀젼 대물렌즈와 환경 챔버(재료 표 참조)가 장착된 컨포칼 현미경(재료 표 참조)을 사용하여 HeLa 세포를 이미지화합니다.

  1. 이미징 1시간 전에 탱크 밸브를 열어 CO2를 켭니다. On 버튼을 눌러 현미경의 환경 컨트롤러를 켭니다. 터치패드의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 온도를 37°C로 조정하고 CO2를 5%로 조정합니다. 완료되면 설정을 누릅니다.
    알림: 환경 챔버의 문이 닫혀 있는지 확인하고 조건이 안정될 때까지 기다립니다.
  2. 레이저 설정
    1. 백색광 레이저(WLL)를 켜고 레이저 출력을 85%로 설정하고 여자 제어를 최대 출력으로 설정합니다. 획득(Acquire) 탭을 클릭하고 레이저 추가(Add Laser)를 선택한 다음 표시되는 대화 상자에서 WLL을 켜기로 전환합니다. 레이저 출력 버튼을 클릭하고 85%를 입력합니다. Excitation Control(여기 제어) 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Maximum Power(최대 전력)를 선택합니다(그림 2A).
    2. TMRE 실험: YFP, MitoTracker 및 TMRE에 대한 여기 및 방출 스펙트럼을 설정합니다.
      1. YFP의 경우 여기 레이저를 514nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 524-545nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가를 클릭하고 설정 1로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 514를 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 부분에 524를 입력하고 끝 파장에 545를 입력합니다.
      2. MitoTracker Deep Red의 경우 여기 레이저를 641로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 650-750nm로 설정합니다. 획득(Acquire) 탭에서 레이저 추가(Add Laser) 버튼을 클릭하고 설정 1로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 641을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 파장에 650, 끝 파장에 750을 입력합니다.
      3. TMRE의 경우 여기 레이저를 555nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 557-643nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 2로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자에 파장으로 555를 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 파장에 557, 끝 파장에 643을 입력합니다.
    3. MitoSOX 실험: YFP, MitoTracker 및 MitoSOX에 대한 여기 및 방출 스펙트럼을 설정합니다(그림 2B).
      1. YFP의 경우 여기 레이저를 507nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 517-540nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 1로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자에서 파장으로 507을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 부분에 517을 입력하고 끝 파장에 540을 입력합니다.
      2. MitoSOX의 경우 여기 레이저를 547nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 564-636nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 2로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 547을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 파장에 564, 끝 파장에 636을 입력합니다.
      3. MitoTracker Deep Red의 경우 여기 레이저를 641nm로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 652-742nm로 설정합니다. Acquire(획득) 탭에서 Add New Setting(새 설정 추가) 버튼을 클릭합니다. 레이저 추가 버튼을 클릭하고 설정 3으로 드래그합니다. 여기선(Excitation Line)을 두 번 클릭하고 대화 상자의 파장으로 641을 입력합니다. 해당 감지기를 두 번 클릭하고 시작 부분에 652를 입력하고 끝 파장에 742를 입력합니다.
  3. 이미지 획득 설정(그림 2C)
    1. 형식을 1,024 x 1,024로, 스캔 속도를 600Hz로, 라인 평균을 3으로 설정합니다.
      1. 획득 탭을 선택하고 포맷 버튼을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 1,024 x 1,024를 선택합니다. 속도 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 600을 선택합니다. 그런 다음 Line Average 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 3을 선택합니다.
      2. 양방향 스캔을 켜고 위상 및 확대/축소 비율을 각각 22.61 및 1.50으로 설정합니다.
        1. 획득(Acquisition) 탭에서 양방향(Bidirectional) 버튼을 켜기(On)로 전환합니다. X 단계 설정을 클릭하고 22.61로 설정합니다. 확대/축소 계수 설정을 클릭하고 1.50으로 설정합니다.

4. 이미지 획득

주의: 실험자는 YFP 형광 신호를 기반으로 세포를 선택하기 위해 시각적 판단을 내려야 합니다. 과포화된 픽셀은 형광 강도 정량화에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 피하십시오. 채도가 높은 이미지를 획득하지 않도록 픽셀 채도를 나타내는 오버/언더 룩업 테이블을 사용합니다.

  1. 관심 설정을 클릭하고 Fast Live를 눌러 형광 이미지의 실시간 미리보기를 제공합니다.
  2. 해당 감지기를 두 번 클릭하여 게인과 강도를 조정합니다. 표시되는 대화 상자에서 슬라이더를 사용하여 게인을 조정합니다. 강도를 변경하려면 Excitation Line을 두 번 클릭하고 팝업 창에서 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 강도를 변경합니다. 중지를 클릭하여 미리 보기를 종료합니다.
    1. TMRE 실험: 먼저 DMSO 제어판을 이미지화합니다. TMRE 신호의 게인과 강도를 조정(설정 2)하여 미토콘드리아 네트워크 강도가 포화 바로 아래에 있도록 합니다. 실험에 대한 게인과 강도를 일정하게 유지합니다. MitoTracker 및 YFP(설정 1)의 게인과 강도를 조정하여 미토콘드리아 네트워크가 보이지만 흐리게 보이도록 합니다.
    2. MitoSOX 실험: 먼저 DMSO 컨트롤 플레이트를 이미지화합니다. MitoSOX(설정 2) 신호의 게인과 강도를 조정하여 형광이 보이지만 희미해지도록 합니다. 실험에 대한 게인과 강도를 일정하게 유지합니다. YFP(설정 1)와 MitoTracker(설정 3)의 게인과 강도를 조정하여 미토콘드리아 네트워크가 보이지만 어두워지도록 합니다.
      알림: TMRE와 MitoSOX의 이득과 강도는 실험 내내 일정하게 유지되어야 하므로 기록합니다. YFP 및 MitoTracker의 형광 신호는 이 프로토콜에서 정량화되지 않습니다. 따라서 각 이미지에 대해 게인과 강도를 조정할 수 있습니다. 세포가 세포 손상이나 광표백을 유발하는 과도한 레이저 강도에 노출되지 않도록 세포가 잘 보이지만 여전히 희미한 게인 및 강도 설정을 갖는 것이 가장 효과적입니다.
  3. 게인 및 강도 설정이 완료되면 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 실험 조건당 20개 세포의 이미지 획득(예: 이미지당 4개의 세포가 있는 5개의 이미지; 그림 2D).

5. ImageJ를 이용한 형광 강도 정량

참고: 이미징 파일은 ".lif"로 저장되며 ImageJ29와 호환됩니다. ImageJ와 호환되는 파일 형식은 해당 웹 사이트에 지정되어 있습니다. 호환되지 않는 경우 파일 형식을 변환해야 할 수 있습니다.

  1. 관심 영역(ROI)을 만들고 저장합니다.
    1. ImageJ에서 파일 | 새로 만들기 | 이미지. 표시되는 대화 상자에서 확인을 클릭합니다.
    2. 사각형 도구 버튼을 클릭하고 6미크론 x 6미크론 상자를 그립니다. Analyze(분석) | 도구 | ROI 관리자를 선택하고 ROI 관리자가 있는 대화 상자가 나타날 때까지 기다립니다(그림 3A). 관리자 대화 상자에서 추가를 클릭하여 관리자에 직사각형 ROI를 추가합니다. More(추가)를 선택하여 ROI를 저장한 다음 Save(저장) 버튼을 클릭하고 OK(확인)를 클릭합니다.
  2. 형광 강도를 측정합니다.
    1. 이미지 J에서 파일( File )을 클릭하고 열기(Open)를 선택합니다. 대화 상자에서 실험에 사용할 이미징 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
    2. Bio-formats 가져오기 옵션 창이 나타날 때까지 기다립니다(그림 3B). 채널 분할을 선택하고 열기를 클릭합니다.
      참고: 채널 분할 기능을 사용하면 이미지의 각 채널을 별도의 창으로 열 수 있습니다. 채널 순서는 획득 순서에 해당합니다.
      1. TMRE 실험: YFP (설정 1)는 첫 번째 채널(c=0)입니다. MitoTracker (설정 1)는 두 번째 채널 (c = 1)입니다. TMRE(설정 2)는 세 번째 채널(c = 2)입니다.
      2. MitoSOX 실험: YFP (설정 1)는 첫 번째 채널(c=0)입니다. MitoSOX (설정 2)는 두 번째 채널(c = 1)입니다. MitoTracker (설정 3)는 세 번째 채널 (c = 2)입니다.
    3. Image | 조정 | 밝기(그림 3C).
      참고: 이미지 밝기가 영구적으로 변경되지 않도록 설정 또는 적용을 누르지 마십시오. 때때로, 형광 강도는 TMRE 또는 MitoSOX 채널에서 보이지 않습니다. 더 쉽게 시각화할 수 있도록 밝기를 조정합니다. 밝기를 변경해도 원시 형광 강도 값에는 영향을 미치지 않습니다.
    4. Analyze(분석)를 클릭하고 Set Measurements(측정 설정)를 선택합니다. Area(영역) 및 Mean gray(평균 회색) 값 상자를 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다(그림 3D).
      참고: 평균 회색 값은 형광 강도입니다.
    5. ROI Manager를 열고 Analyze | 도구 | ROI 관리자. ROI 관리자에서 자세히를 클릭한 다음 표시되는 목록에서 열기를 클릭하고 저장된 ROI를 선택합니다.
    6. ROI 관리자에서 저장된 ROI를 선택하여 단일 셀에서 5개의 랜덤 영역의 형광 강도를 측정하고 ROI를 셀 내의 임의 위치로 이동합니다(그림 3E). M을 눌러 형광 강도를 측정합니다. 겹치지 않는 4개의 추가 영역을 사용하여 이 단계를 반복합니다. 영역 및 평균 회색 값이 있는 대화 상자가 나타나면(그림 3F) 분석을 위해 값을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
      1. TMRE 실험: 이미지를 선택합니다(c = 2).
      2. MitoSOX 실험: 이미지 선택(c = 2).
    7. 평균 형광 강도 값을 구합니다. 스프레드시트 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 5개의 평균 회색 값의 평균을 구합니다. 각 셀에 대해 이 과정을 반복합니다.
    8. 통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 실험 조건에 걸쳐 TMRE 또는 MitoSOX 평균 회색 값을 분석하고 비교합니다( 재료 표 참조; 그림 4 및 그림 5). 데이터를 막대 그래프 또는 바이올린 플롯으로 표시합니다.

결과

이 프로토콜에서는 CCCP 처리 후 미토콘드리아 네트워크의 막 전위와 과산화물 수준을 측정하기 위해 형광 기반 정량화를 사용했습니다(그림 1). 이 워크플로우는 자궁경부암에서 추출한 불멸화 세포주인 HeLa 세포를 사용했습니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 생물학을 연구하는 데 일상적으로 사용되며 비교적 평평하여 현미경을 사용하여 미토콘드리아 네트워크를 쉽게 시각?...

토론

여기에 요약된 워크플로우는 형광 기반 이미징을 사용하여 미토콘드리아 막 전위와 슈퍼옥사이드 수준을 강력하고 재현성 있게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다(30). 이러한 실험을 설계할 때 고려해야 할 중요한 기술적 제한 사항이 있습니다. HeLa 세포를 빈 YFP 벡터, YFP-ParkinWT, 또는 YFP-ParkinT240R로 형질감염시켰다. 실험 결과가 파킨에 특이적인지 확인하기 위?...

공개

저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.

감사의 말

이 원고에 대한 사려 깊은 피드백을 주신 Evans 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars 및 Howard Hughes Medical Institute(HHMI) Hanna Gray Fellowship의 지원을 받습니다. 도 1A 는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

참고문헌

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