Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

Özet

Mitokondri, ATP sentezi yoluyla enerji üretimini kontrol ederek metabolik homeostaz için kritik öneme sahip dinamik organellerdir. Hücresel metabolizmayı desteklemek için, çeşitli mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları sağlıklı bir mitokondriyal ağı korumak için işbirliği yapar. Böyle bir yolak, PTEN'e bağlı kinaz 1 (PINK1) ve hasarlı mitokondrinin Parkin fosfo-ubikitinasyonunun otofagozom sekestrasyonunu ve daha sonra lizozom füzyonu yoluyla hücreden çıkarılmasını kolaylaştırdığı mitopajidir. Mitopaji, hücresel homeostaz için önemlidir ve Parkin'deki mutasyonlar Parkinson hastalığı (PD) ile bağlantılıdır. Bu bulgular nedeniyle, mitokondriyal kalite kontrolün moleküler mekanizmalarını ve dinamiklerini anlamak için mitokondriyal hasar ve cironun araştırılmasına önemli bir vurgu yapılmıştır. Burada, HeLa hücrelerinin mitokondriyal ağını görselleştirmek, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için canlı hücre görüntüleme, bir mitokondriyal ayrıştırıcı ajan olan karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedaviyi takiben kullanıldı. Ek olarak, Parkin'e bağımlı mitopajiyi inhibe eden PD'ye bağlı bir Parkin mutasyonu (ParkinT240R), mutant ekspresyonun, vahşi tip Parkin'i eksprese eden hücrelere kıyasla mitokondriyal ağı nasıl etkilediğini belirlemek için ifade edildi. Burada özetlenen protokol, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için floresan tabanlı yaklaşımlar kullanan basit bir iş akışını açıklamaktadır.

Giriş

Mitokondriyal ağ, enerji üretimi 1, doğuştan gelen bağışıklık2,3 ve hücre sinyalizasyonu 4,5'te çok önemli bir rol oynayan birbirine bağlı bir dizi organeldir. Mitokondriyal disregülasyon, Parkinson hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir6,7. PH, dünya çapında yaklaşık 10 milyon insanı etkileyen, substantia nigra'nın dopaminerjik nöronlarını etkileyen ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır8. PD, genetik olarak, hasarlı mitokondri 9,10'u seçici olarak ortadan kaldıran hücresel homeostazı korumak için gerekli bir mitokondriyal kalite kontrol yolu olan mitopajiye bağlanmıştır. Çalışmalar, 1 (FUNDC1) aracılı mitopaji içeren FUN14 alanı, Bcl-2 etkileşimli protein 3 (BNIP3) kolaylaştırılmış mitopaji, NIX'e bağımlı mitofaji ve iyi karakterize edilmiş PTEN-indüklenmiş kinaz 1 (PINK1) / Parkin tarafından düzenlenen mitopaji10,11 dahil olmak üzere birçok bağımsız mitopaji yolu tanımlamıştır. PINK1 (varsayılan bir kinaz) ve Parkin (bir E3 ubikitin ligaz), fosfo-ubikitinat hasarlı mitokondri ile birlikte çalışır, bu da hasarlı organeli içine çeken otofagozomların oluşumunu yönlendirir ve 12,13,14,15,16 bozulmasını başlatmak için lizozomlarla kaynaşır. Parkin'deki mutasyonlar, dopaminerjik nöronların kaybı yoluyla nörodejenerasyon gibi PD'ye bağlı fenotiplerle ilişkilendirilmiştir17,18.

Burada, rutin olarak kullanılan HeLa hücrelerinin, rahim ağzı kanserinden türetilen ölümsüzleştirilmiş hücrelerin, Parkin'in mitokondriyal ağ sağlığını korumadaki rolünü araştırmak için kullanıldığı bir protokol açıklanmaktadır. HeLa hücreleri ihmal edilebilir seviyelerde endojen Parkin eksprese eder ve bu nedenle eksojen Parkin ekspresyonugerektirir 19. Parkin'in mitokondriyal ağ sağlığındaki rolünü incelemek için, HeLa hücreleri vahşi tip Parkin (ParkinWT), bir Parkin mutantı (ParkinT240R) veya boş bir kontrol vektörü ile transfekte edilir. ParkinT240R, Parkin E3 ligaz aktivitesini etkileyen, mitopaji yolu20'nin etkinliğini önemli ölçüde azaltan otozomal resesif geçişli bir juvenil parkinsonizm mutasyonudur. HeLa hücreleri, mitokondriyal ayrıştırıcı bir ajan olan hafif (5 μM) veya şiddetli (20 μM) karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) konsantrasyonlarına maruz kalır. Şiddetli CCCP konsantrasyonları ile tedavi, HeLa ve COS-7 hücreleri21,22,23 gibi çeşitli hücre hatlarında Parkin aracılı mitopajiyi indüklemek için rutin olarak kullanılır.

Tedaviyi takiben, protokol şu anda mevcut olan iki mitokondriyal hedefli floresan boya kullanarak mitokondriyal ağın canlı görüntülemesini kullanır. Tetrametilrhodamin, etil ester, perklorat (TMRE), mitokondriyal membran potansiyeli24'e dayanan floresan katyonik bir boyadır, MitoSOX ise floresan yoğunluğunun süperoksit konsantrasyonu25'in bir fonksiyonu olduğu mitokondriyal bir süperoksit göstergesidir. Son olarak, özetlenen protokol, kullanıcı yanlılığı için minimum kapsamla mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için floresan tabanlı bir niceleme ve basit bir iş akışı kullanır. Bu protokol, HeLa hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu incelemek için tasarlanmış olmasına rağmen, mitokondriyal ağ sağlığını nicel olarak karakterize etmek için ek hücre hatları ve birincil hücre tipleri için uyarlanabilir.

Protokol

1. Biyolojik numunelerin hazırlanması

NOT: Bir biyogüvenlik kabininde steril teknik kullanarak aşağıdaki adımları uygulayın. Kabinin yüzeyine ve tüm malzemelere% 70 etanol püskürtün.

  1. HeLa hücre kültürü ve transfeksiyonu
    1. Dulbecco'nun modifiye kartal besiyerinde (DMEM) %10 fetal sığır serumu ve %1 L-glutamin çözeltisi (HeLa media; bakınız Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş 4.5 g/L glikoz içeren 30.000 HeLa hücresi kültürü. Hücreleri, 2 mL önceden ısıtılmış HeLa ortamı içeren 35 mm cam tabanlı görüntüleme kaplarına (bkz. HeLa kültürlerini %5 CO2 ve 37 °C26,27'de tutun.
    2. Kaplamadan sonraki gün, hücrelerin ~% 50 -% 60 oranında akıcı olduğundan emin olmak için 35 mm'lik görüntüleme kaplarını ışık mikroskobu kullanarak inceleyin. Bir kez birleştiğinde, HeLa hücrelerini boş sarı floresan protein (YFP) vektörü, YFP-ParkinWT veya YFP-ParkinT240R ile transfekte edin (Şekil 1A).
    3. Her transfeksiyon için steril mikrosantrifüj tüplerinde iki ayrı karışım hazırlayın. Tüpe dokunarak veya hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
      1. Tüp 1'de, 200 μL indirgenmiş serum ortamını (bakınız Malzeme Tablosu) 2 μg plazmid DNA'sı ile karıştırın.
      2. Tüp 2'de, 200 μL indirgenmiş serum ortamını 6 μL transfeksiyon reaktifi ile karıştırın (bakınız Malzeme Tablosu)28.
    4. Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca inkübe edin. Tüp 2'yi tüp 1'e ekleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    5. Transfeksiyon komplekslerini, HeLa hücre kültürlerini içeren mevcut görüntüleme kaplarına damla damla ekleyerek tüm çanak boyunca eşit dağılım sağlayın. Görüntüleme kaplarını gece boyunca %5 CO2 ve 37 °C inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Her çanağı uygun transfekte plazmid ile etiketleyin. Her deney için üç YFP-ParkinWT kabını etiketleyin (dimetil sülfoksit [DMSO; bkz. Malzeme Tablosu], 5 μM CCCP ve 20 μM CCCP). Etiketlemeyi üç YFP-ParkinT240R kabı ve üç boş YFP vektör kabı ile tekrarlayın.
  2. CCCP ve floresan boyaların hazırlanması
    DİKKAT: Floresan boyalar genellikle ışığa duyarlıdır. Işığa maruz kalmayı azaltmak için alüminyum folyo veya kahverengi santrifüj tüpleri kullanarak boyaları karanlıkta saklayın.
    1. 5 mg CCCP'yi 4.89 mL DMSO'da çözerek 5 mM'lik bir CCCP çalışma stoğu yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız). 5 mg CCCP'yi 1.22 mL DMSO'da çözerek 20 mM'lik bir CCCP çalışma stoğu yapın.
    2. 25 μM çalışma stoğu oluşturmak için 1 μL DMSO'da 1 mM MitoTracker Deep Red (Malzeme Tablosuna bakın) stok çözeltisinin 10 μL'sini seyreltin.
    3. 50 μg MitoSOX Red25'i ( Malzeme Tablosuna bakınız) 13 μL DMSO'da çözerek 5 mM'lik bir çalışma stoğu oluşturun.
    4. 1 mM stok çözeltisi oluşturmak için 10 mg TMRE24'ü ( Malzeme Tablosuna bakınız) 19.4 mL DMSO içinde çözün. 10 μM çalışma stoğu oluşturmak için 990 μL DMSO'ya 10 μL 1 mM TMRE ekleyerek TMRE'yi seyreltin.

2. HeLa hücrelerinde floresan problarla CCCP tedavisi ve mitokondriyal etiketleme

DİKKAT: HeLa hücrelerinin uzun süre inkübatörden çıkmadığından emin olmak için aşağıdaki adımları hızlı bir şekilde uygulayın.

  1. Transfeksiyondan sonraki gün, her deney plakasına 5 veya 20 mM CCCP'den 2 μL (nihai konsantrasyon: sırasıyla 5 μM ve 20 μM) ekleyin. Kontrol plakaları için 2 μL DMSO ekleyin. Plakaları %5 CO2 ve 37 °C inkübatöre 1,5 saat bekletin (Şekil 1A).
    NOT: CCCP tedavisi toplam 2 saattir. Bununla birlikte, mitokondri, CCCP tedavisinin son 30 dakikasında floresan problarla etiketlenir.
  2. 1,5 saat sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve görüntüleme kaplarına floresan problar ekleyin. Plakaları %5 CO2 ve 37 °C inkübatöre 30 dakika bekletin (Şekil 1A).
    1. TMRE deneyi: 2 μL 25 μM MitoTracker (son konsantrasyon: 25 nM) ve 2 μL 10 μM TMRE (son konsantrasyon: 10 nM) ekleyin.
    2. MitoSOX deneyi: 2 μL 25 μM MitoTracker (son konsantrasyon: 25 nM) ve 1 μL 5 mM MitoSOX (son konsantrasyon: 2,5 μM) ekleyin.
  3. 2 saatlik CCCP tedavisinden sonra HeLa hücrelerini görüntüleme için hazırlayın (Şekil 1A,B).
    1. TMRE deneyi: HeLa hücreleri hemen görüntülenmeye hazırdır; TMRE'nin HeLa hücre kültürü ortamında kalmasını sağlayın.
    2. MitoSOX deneyi: Serbest MitoSOX boyasını çıkarmak için hücreleri 2 mL önceden ısıtılmış HeLa ortamı ile 3 kat yıkayın. 2 mL önceden ısıtılmış ortam ekleyin. HeLa hücreleri artık görüntülenmeye hazırdır.
      NOT: HeLa hücrelerini, deneysel durumla aynı DMSO veya CCCP konsantrasyonunu içeren taze, önceden ısıtılmış HeLa ortamı ile yıkayın; MitoSOX veya MitoTracker'ı dahil etmeyin.

3. Konfokal mikroskop görüntü alma kurulumu

NOT: HeLa hücrelerini, 63x/1.40 sayısal açıklık (NA) yağ daldırma hedefi ve bir çevre odası (bkz.

  1. Görüntülemeden 1 saat önce, tank vanasını açarak CO2'yi açın. Mikroskop için ortam denetleyicisini açmak üzere Açık düğmesine basın. Sıcaklığı 37 ° C'ye ve CO2 ila %5'e ayarlamak için dokunmatik yüzeydeki Yukarı ve Aşağı Okları kullanın. Tamamlandığında Set tuşuna basın.
    NOT: Çevre odasının kapılarının kapalı olduğundan emin olun ve koşulların dengelenmesini bekleyin.
  2. Lazer ayarları
    1. Beyaz Işık Lazerini (WLL) açın ve lazer gücünü% 85'e ve uyarma kontrolünü maksimum güce ayarlayın. Al sekmesini tıklatın, Lazer Ekle'yi seçin ve görüntülenen iletişim kutusunda WLL'yi Açık olarak değiştirin. Lazer Güç düğmesine tıklayın ve% 85 girin. Uyarma Kontrolü düğmesini tıklatın ve açılır menüden Maksimum Güç'ü seçin (Şekil 2A).
    2. TMRE deneyi: YFP, MitoTracker ve TMRE için uyarma ve emisyon spektrumlarını ayarlayın.
      1. YFP için, uyarma lazerini 514 nm'ye ve emisyon spektrum penceresini 524-545 nm'ye ayarlayın. Al sekmesinde, Yeni Ayar Ekle düğmesini tıklatın; ardından Lazer Ekle'yi tıklatın ve Ayar 1'e sürükleyin. Uyarma Hattı'na çift tıklayın ve iletişim kutusuna dalga boyu olarak 514 girin. İlgili dedektöre çift tıklayın ve başlangıç için 524 ve bitiş dalga boyu için 545 girin.
      2. MitoTracker Deep Red için, uyarma lazerini 641'e ve emisyon spektrum penceresini 650-750 nm'ye ayarlayın. Al sekmesinde, Lazer Ekle düğmesini tıklatın ve Ayar 1'e sürükleyin. Uyarma Hattı'na çift tıklayın ve iletişim kutusuna dalga boyu olarak 641 girin. İlgili dedektöre çift tıklayın ve başlangıç için 650 ve bitiş dalga boyu için 750 girin.
      3. TMRE için, uyarma lazerini 555 nm'ye ve emisyon spektrum penceresini 557-643 nm'ye ayarlayın. Al sekmesinde, Yeni Ayar Ekle düğmesini tıklatın; Ardından, Lazer Ekle düğmesini tıklatın ve Ayar 2'ye sürükleyin. Uyarma Hattı'na çift tıklayın ve iletişim kutusuna dalga boyu olarak 555 girin. İlgili dedektöre çift tıklayın ve başlangıç için 557 ve bitiş dalga boyu için 643 girin.
    3. MitoSOX deneyi: YFP, MitoTracker ve MitoSOX için uyarma ve emisyon spektrumlarını ayarlayın (Şekil 2B).
      1. YFP için, uyarma lazerini 507 nm'ye ve emisyon spektrum penceresini 517-540 nm'ye ayarlayın. Al sekmesinde, Yeni Ayar Ekle düğmesini tıklatın; Ardından, Lazer Ekle düğmesini tıklayın ve Ayar 1'e sürükleyin. Uyarma Hattı'na çift tıklayın ve iletişim kutusuna dalga boyu olarak 507 girin. İlgili dedektöre çift tıklayın ve başlangıç için 517 ve bitiş dalga boyu için 540 girin.
      2. MitoSOX için, uyarma lazerini 547 nm'ye ve emisyon spektrum penceresini 564-636 nm'ye ayarlayın. Al sekmesinde, Yeni Ayar Ekle düğmesini tıklatın; Ardından, Lazer Ekle düğmesini tıklatın ve Ayar 2'ye sürükleyin. Uyarma Hattı'na çift tıklayın ve iletişim kutusuna dalga boyu olarak 547 girin. İlgili dedektöre çift tıklayın ve başlangıç için 564 ve bitiş dalga boyu için 636 girin.
      3. MitoTracker Deep Red için, uyarma lazerini 641 nm'ye ve emisyon spektrum penceresini 652-742 nm'ye ayarlayın. Al sekmesinde, Yeni Ayar Ekle düğmesini tıklatın; Lazer Ekle düğmesini tıklatın ve Ayar 3'e sürükleyin. Uyarma Hattı'na çift tıklayın ve iletişim kutusuna dalga boyu olarak 641 girin. İlgili dedektöre çift tıklayın ve başlangıç için 652 ve bitiş dalga boyu için 742 girin.
  3. Görüntü alma ayarları (Şekil 2C)
    1. Biçimi 1.024 x 1.024, tarama hızını 600 Hz ve satır ortalamasını 3 olarak ayarlayın.
      1. Edinme sekmesini seçin ve Biçim düğmesini tıklatın. Açılır menüden 1.024 x 1.024'ü seçin. Tıkla Hız düğmesine basın ve açılır menüden 600'ü seçin. Ardından, Çizgi Ortalaması düğmesini tıklatın ve açılır menüden 3'ü seçin.
      2. Çift Yönlü Tarama'yı açın ve faz ve yakınlaştırma faktörünü sırasıyla 22,61 ve 1,50 olarak ayarlayın.
        1. Edinme sekmesinde, Çift Yönlü düğmesini Açık olarak değiştirin. Phase X ayarına tıklayın ve 22.61 olarak ayarlayın. Yakınlaştırma Faktörü ayarına tıklayın ve 1,50 olarak ayarlayın.

4. Görüntü alma

DİKKAT: Deneyci, YFP floresan sinyaline dayanarak hücreleri seçmek için görsel bir karar vermelidir. Floresan yoğunluğu ölçümünü önemli ölçüde etkileyebileceğinden, aşırı doygun piksellerden kaçının. Doygun görüntüler elde edilmesini önlemek için piksel doygunluğunu gösteren bir üst/alt arama tablosu kullanın.

  1. İlgilenilen ayar'a tıklayın ve floresan görüntünün canlı bir önizlemesini sağlamak için Hızlı Canlı düğmesine basın.
  2. İlgili dedektöre çift tıklayarak kazancı ve yoğunluğu ayarlayın. Görüntülenen iletişim kutusunda, kaydırıcıyı kullanarak Kazanç'ı ayarlayın. Yoğunluğu değiştirmek için, Uyarma Çizgisine çift tıklayın ve yoğunluğu değiştirmek için açılır penceredeki Yukarı ve Aşağı Okları kullanın. Önizlemeyi sonlandırmak için Durdur'u tıklatın.
    1. TMRE deneyi: Önce DMSO kontrol plakasını görüntüleyin. TMRE sinyalinin kazancını ve yoğunluğunu ayarlayın (Ayar 2), mitokondriyal ağ yoğunluğu doygunluğun hemen altında olacak şekilde; Deney için kazancı ve yoğunluğu sabit tutun. MitoTracker ve YFP'nin (Ayar 1) kazancını ve yoğunluğunu, mitokondriyal ağın görünür ancak loş olması için ayarlayın.
    2. MitoSOX deneyi: Önce DMSO kontrol plakasını görüntüleyin. MitoSOX (Ayar 2) sinyalinin kazancını ve yoğunluğunu, floresan görünür ancak loş olacak şekilde ayarlayın; Deney için kazancı ve yoğunluğu sabit tutun. YFP'nin (Ayar 1) ve MitoTracker'ın (Ayar 3) kazancını ve yoğunluğunu, mitokondriyal ağın görünür ancak loş olması için ayarlayın.
      NOT: TMRE ve MitoSOX'un kazancını ve yoğunluğunu kaydedin, çünkü bu değerler deney boyunca sabit kalmalıdır. YFP ve MitoTracker'ın floresan sinyalleri bu protokolde ölçülmemiştir. Bu nedenle, kazanç ve yoğunluk her görüntü için ayarlanabilir. Hücrelerin hücre hasarına veya fotobeyazlatmaya neden olan aşırı lazer yoğunluklarına maruz kalmamasını sağlamak için hücrelerin görülmesinin kolay ancak yine de loş olduğu kazanç ve yoğunluk ayarlarına sahip olmak en etkilidir.
  3. Kazanç ve yoğunluk ayarları tamamlandıktan sonra, bir görüntü almak için Başlat'ı tıklatın. Deneysel koşul başına 20 hücreli görüntüler elde edin (örneğin, görüntü başına dört hücreli beş görüntü; Şekil 2D).

5. ImageJ kullanarak floresan yoğunluğu ölçümü

NOT: Görüntüleme dosyaları ".lif" olarak kaydedilir ve ImageJ29 ile uyumludur. ImageJ ile uyumlu dosya türleri web sitelerinde belirtilmiştir. Uyumsuzsa dosya türünü dönüştürmek gerekebilir.

  1. İlgi çekici bir bölge (YG) oluşturun ve kaydedin.
    1. ImageJ'de Dosya | Yeni | Görüntü. Görüntülenen iletişim kutusunda Tamam'ı tıklatın.
    2. Dikdörtgen Aracı düğmesini tıklatın ve 6 mikron x 6 mikron boyutunda bir kutu çizin. Analiz Et'e tıklayarak YG yöneticisini açın | Araçlar | ROI Manager'ı (ROI Yöneticisi) tıklayın ve ROI yöneticisini içeren bir iletişim kutusunun görünmesini bekleyin (Şekil 3A)). Yönetici iletişim kutusunda Ekle'yi tıklatarak dikdörtgen YG'yi yöneticiye ekleyin. Diğer'i seçerek YG'yi kaydedin, ardından Kaydet düğmesini ve Tamam'ı tıklayın.
  2. Floresan yoğunluğunu ölçün.
    1. Resim J'de, Dosya'ya tıklayın ve Aç'ı seçin. İletişim kutusunda, deneme için görüntüleme dosyalarını seçin ve Aç'ı tıklatın.
    2. Biyo-formatlar İçe Aktarma Seçenekleri penceresinin görünmesini bekleyin (Şekil 3B). Kanalları Böl'ü seçin ve Aç'ı tıklatın.
      NOT: Kanalları bölme özelliği, görüntüdeki her kanalın ayrı bir pencere olarak açılmasını sağlar. Kanal sırası, satın alma emrine karşılık gelir.
      1. TMRE deneyleri: YFP (Ayar 1) ilk kanaldır (c = 0); MitoTracker (Ayar 1) ikinci kanaldır (c = 1); ve TMRE (Ayar 2) üçüncü kanaldır (c = 2).
      2. MitoSOX deneyleri: YFP (Ayar 1) ilk kanaldır (c = 0); MitoSOX (Ayar 2) ikinci kanaldır (c = 1); ve MitoTracker (Ayar 3) üçüncü kanaldır (c = 2).
    3. Görüntü | Ayarlama | Parlaklık (Şekil 3C).
      NOT: Görüntü parlaklığının kalıcı olarak değiştirilmediğinden emin olmak için Ayarla veya Uygula düğmesine basmayın. Bazen, floresan yoğunluğu TMRE veya MitoSOX kanallarında görünmez. Daha kolay görselleştirme sağlamak için parlaklığı ayarlayın. Parlaklığın değiştirilmesi ham floresan yoğunluğu değerlerini etkilemez.
    4. Analiz Et'e tıklayın ve Ölçümleri Ayarla'yı seçin. Alan ve Ortalama gri değer kutularını işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın (Şekil 3D).
      NOT: Ortalama gri değer, floresan yoğunluğudur.
    5. YG Yöneticisi'ni açın ve Analiz Et'e tıklayarak adım 5.1'de kaydedilen YG'yi yükleyin | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi. YG Yöneticisi'nde Diğer'i tıklayın, ardından görüntülenen listeden Aç'ı seçin ve kaydedilen YG'yi seçin.
    6. ROI yöneticisinden kaydedilen YG'yi seçerek tek bir hücredeki beş rastgele bölgenin floresan yoğunluğunu ölçün ve YG'yi bir hücre içinde rastgele bir konuma taşıyın (Şekil 3E). M tuşuna basarak floresan yoğunluğunu ölçün. Bu adımı, çakışmayan dört ek bölgeyle yineleyin. Alan ve ortalama gri değerleri içeren bir iletişim kutusu göründüğünde (Şekil 3F), değerleri analiz için kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın.
      1. TMRE deneyi: Resim seçin (c = 2).
      2. MitoSOX deneyi: Görüntü seçin (c = 2).
    7. Ortalama floresan yoğunluğu değerlerini elde edin. Elektronik tablo yazılımını kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), beş ortalama gri değerin ortalamasını alın. Her hücre için bu işlemi yineleyin.
    8. TMRE veya MitoSOX ortalama gri değerlerini istatistiksel bir yazılım programı kullanarak deneysel koşullar arasında analiz edin ve karşılaştırın (bkz. Şekil 4 ve Şekil 5). Verileri çubuk grafikler veya keman grafikleri olarak sunun.

Sonuçlar

Bu protokolde, CCCP tedavisini takiben mitokondriyal ağın membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için floresan bazlı niceleme kullanılmıştır (Şekil 1). Bu iş akışı, rahim ağzı kanserinden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı olan HeLa hücrelerini kullandı. HeLa hücreleri mitokondriyal biyolojiyi incelemek için rutin olarak kullanılır ve nispeten düzdür, bu da mikroskopi kullanarak mitokondriyal ağı görselleştirmeyi kolaylaştır?...

Tartışmalar

Burada özetlenen iş akışı, floresan bazlı görüntüleme30 kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu deneyleri tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken önemli teknik sınırlamalar vardır. HeLa hücreleri boş bir YFP vektörü, YFP-ParkinWT veya YFP-ParkinT240R ile transfekte edildi. Boş YFP vektörü, deneysel bulguların Parkin'e özgü olduğunu...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri rakip çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Evans laboratuvarı üyelerine bu makale hakkındaki düşünceli geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars ve Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship tarafından desteklenmektedir. Şekil 1A , BioRender.com kullanılarak yapılmıştır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

Referanslar

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847 (2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260 (2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543 (2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961 (2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778 (2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30 (2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 195mitokondrimitofajin rodejenerasyonParkinmitokondriyal membran potansiyelireaktif oksijen t rleris peroksitHeLa h crelerikonfokal mikroskopi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır