Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

Resumen

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Resumen

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos críticos para la homeostasis metabólica mediante el control de la producción de energía a través de la síntesis de ATP. Para apoyar el metabolismo celular, varios mecanismos de control de calidad mitocondrial cooperan para mantener una red mitocondrial saludable. Una de estas vías es la mitofagia, donde la quinasa 1 inducida por PTEN (PINK1) y la fosfoubiquitinación Parkin de las mitocondrias dañadas facilitan el secuestro de autofagosomas y la posterior eliminación de la célula a través de la fusión de lisosomas. La mitofagia es importante para la homeostasis celular, y las mutaciones en Parkin están relacionadas con la enfermedad de Parkinson (EP). Debido a estos hallazgos, ha habido un énfasis significativo en la investigación del daño mitocondrial y el recambio para comprender los mecanismos moleculares y la dinámica del control de calidad mitocondrial. Aquí, se utilizaron imágenes de células vivas para visualizar la red mitocondrial de células HeLa, para cuantificar el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido después del tratamiento con cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP), un agente de desacoplamiento mitocondrial. Además, se expresó una mutación ligada a la PD de Parkin (Parkin^T240R) que inhibe la mitofagia dependiente de Parkin para determinar cómo la expresión mutante afecta la red mitocondrial en comparación con las células que expresan Parkin de tipo salvaje. El protocolo descrito aquí describe un flujo de trabajo simple que utiliza enfoques basados en fluorescencia para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido de manera efectiva.

Introducción

La red mitocondrial es una serie de orgánulos interconectados que desempeñan un papel crucial en la producción de energía¹, la inmunidad innata ^2,3 y la señalización celular ^4,5. La desregulación mitocondrial se ha asociado con enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (EP)^6,7. La EP es un trastorno neurodegenerativo progresivo que afecta a las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y que afecta a casi 10 millones de personas en todo....

Protocolo

1. Preparación de muestras biológicas

NOTA: Realice los siguientes pasos utilizando una técnica estéril en un gabinete de bioseguridad. Rocíe la superficie del gabinete y todos los materiales con etanol al 70%.

1. Cultivo y transfección de células HeLa
   1. Cultive 30.000 células HeLa en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 4,5 g/L de glucosa suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de solución de L-glutamina (HeLa media; ver Tabla de materiales). Coloque las células en platos de imágenes con fondo de vidrio de 35 mm (ver Table of Materials) que cont....

Discusión

El flujo de trabajo descrito aquí se puede utilizar para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido de forma robusta y reproducible utilizando imágenes basadas en fluorescencia³⁰. Existen importantes limitaciones técnicas a considerar al diseñar estos experimentos. Las células HeLa se transfectaron con un vector YFP vacío, YFP-Parkin^WT o YFP-Parkin^T240R. El vector YFP vacío se utilizó como control para confirmar que los hallazgos.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anhydrous	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	This Paper	Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope	Leica	N/A
LIGHTNING Deconvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 confocal microscope	Leica	N/A