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要約

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。

要約

ミトコンドリアは、ATP合成 を介して エネルギー産生を制御することにより、代謝恒常性に不可欠な動的オルガネラです。細胞の代謝をサポートするために、さまざまなミトコンドリアの品質管理メカニズムが連携して、健康なミトコンドリアネットワークを維持します。そのような経路の1つはマイトファジーであり、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1)と損傷したミトコンドリアのパーキンホスホユビキチン化は、オートファゴソームの隔離とその後のリソソーム融合 による 細胞からの除去を促進します。マイトファジーは細胞の恒常性にとって重要であり、パーキンの変異はパーキンソン病(PD)に関連しています。これらの発見により、ミトコンドリアの品質管理の分子メカニズムとダイナミクスを理解するために、ミトコンドリアの損傷と代謝回転の研究に大きな重点が置かれてきました。ここでは、生細胞イメージングを使用してHeLa細胞のミトコンドリアネットワークを視覚化し、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)で処理した後のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを定量化しました。さらに、パーキン依存性マイトファジーを阻害するパーキンのPD結合変異(パーキンT240R)を発現させ、変異発現が野生型パーキンを発現する細胞と比較してミトコンドリアネットワークにどのように影響するかを決定しました。ここで概説するプロトコルは、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量するための蛍光ベースのアプローチを使用した簡単なワークフローを説明しています。

概要

ミトコンドリアネットワークは、エネルギー生産1、自然免疫2,3、および細胞シグナル伝達4,5において重要な役割を果たす一連の相互接続された細胞小器官です。ミトコンドリアの調節不全は、パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患と関連しています6,7。PDは、黒質のドーパミン作動性ニューロンに影響を与える進行性の神経変性疾患であり、世界中で約1,000万人が罹患しています8。PDは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去する細胞の恒常性を維持するために必要なミトコンドリアの品質管理経路であるマイトファジーと遺伝的に関連しています9,10。研究により、1(FUNDC1)を介したマイトファジーを含むFUN14ドメイン、Bcl-2相互作用タンパク質3(BNIP3)促進マイトファジー、NIX依存性マイトファジー、および十分に特徴付けられたPTEN誘導キナーゼ1(PINK1)/パーキン調節マイトファジー10,11を含む複数の独立したマイトファジー経路が特定されています。PINK1(推定されるキナーゼ)とパーキン(E3ユビキチンリガーゼ)は連携して働き、損傷したミトコンドリアをリン酸ユビキチン化し、損傷した細胞小器官を飲み込み、リソソームと融合して分解を開始するオートファゴソームの形成を促進します12,13,14,15,16。パーキンの変異は、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を介した神経変性などのPD結合表現型と関連しています17,18。

ここでは、子宮頸がん由来の不死化細胞であるHeLa細胞を使用して、ミトコンドリアネットワークの健康を維持する上でのパーキンの役割を調査するプロトコルについて説明します。HeLa細胞はごくわずかなレベルの内因性パーキンを発現するため、外因性パーキン発現が必要です19。ミトコンドリアネットワークの健康におけるパーキンの役割を研究するために、HeLa細胞を野生型パーキン(パーキンWT)、パーキン変異体(パーキンT240R)、または空のコントロールベクターのいずれかでトランスフェクトします。パーキンT240Rは、パーキンE3リガーゼ活性に影響を及ぼす常染色体劣性若年性パーキンソニズム変異であり、マイトファジー経路20の効率を著しく低下させる。HeLa細胞は、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)の軽度(5 μM)または重度(20 μM)濃度にさらされます。高濃度のCCCPによる処理は、HeLaおよびCOS-7細胞などの様々な細胞株においてパーキン媒介マイトファジーを誘導するために日常的に使用されている21、22、23。

治療後、プロトコルは、現在利用可能な2つのミトコンドリア標的蛍光色素を使用したミトコンドリアネットワークのライブイメージングを使用します。テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩(TMRE)は、ミトコンドリア膜電位24に基づいて蛍光を発するカチオン色素であり、MitoSOXは、蛍光強度がスーパーオキシド濃度25の関数であるミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターです。最後に、概説したプロトコルは、蛍光ベースの定量とシンプルなワークフローを使用して、ユーザーのバイアスの範囲を最小限に抑えながら、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量します。このプロトコルは、HeLa細胞のミトコンドリア機能を研究するために設計されましたが、ミトコンドリアネットワークの健全性を定量的に特徴付けるために、追加の細胞株および初代細胞タイプに適合させることができます。

プロトコル

1. 生体試料の調製

注意: バイオセーフティキャビネットで滅菌技術を使用して、次の手順を実行します。キャビネットの表面とすべての材料に70%エタノールをスプレーします。

  1. HeLa細胞の培養とトランスフェクション
    1. 10%ウシ胎児血清および1%L-グルタミン溶液を添加した4.5 g/Lグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で30,000個のHeLa細胞を培養します(HeLa培地;材料表を参照)。2 mLの予熱したHeLa培地を含む35 mmガラス底イメージングディッシュ(材料のT缶を参照)に細胞をプレートします。HeLa培養物を5%CO2および37°C26,27に維持する。
    2. プレーティングの翌日、光学顕微鏡を使用して35 mmイメージングディッシュを検査し、細胞が~50%-60%コンフルエントであることを確認します。コンフルエントになったら、HeLa細胞を空の黄色蛍光タンパク質(YFP)ベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240R でトランスフェクトします(図1A)。
    3. トランスフェクションごとに、滅菌マイクロ遠心チューブで2つの別々の混合物を調製します。チューブを軽くたたくか、上下に軽くピペッティングして混合します。
      1. チューブ1で、200 μLの還元血清培地( 材料の表を参照)を2 μgのプラスミドDNAと混合します。
      2. チューブ2で、200 μLの還元血清培地を6 μLのトランスフェクション試薬と混合します( 材料表を参照)28。
    4. チューブを室温(RT)で5分間インキュベートします。チューブ2をチューブ1に加え、上下にピペッティングして混合し、RTで20分間インキュベートします。
    5. トランスフェクション複合体をHeLa細胞培養物を含む既存のイメージングディッシュに滴下し、ディッシュ全体に均等に分布するようにします。イメージングディッシュを5%CO2 および37°Cのインキュベーターに一晩置きます。
      注:各ディッシュに適切なトランスフェクトプラスミドを標識します。各実験について、3つのYFP-パーキンWT ディッシュ(ジメチルスルホキシド[DMSO; 材料表を参照]、5 μM CCCP、および20 μM CCCP)に標識します。3つのYFP-パーキンT240R ディッシュと3つの空のYFPベクターディッシュでラベリングを繰り返します。
  2. CCCPおよび蛍光色素の調製
    注意: 蛍光染料は、多くの場合、感光性です。光への露出を減らすために、アルミホイルまたは茶色の遠沈管を使用して染料を暗所に保管してください。
    1. 5 mgのCCCPを4.89 mLのDMSOに溶解することにより、CCCPの5 mMのワーキングストックを作成します( 材料の表を参照)。5 mgのCCCPを1.22 mLのDMSOに溶解することにより、20 mMのCCCPのワーキングストックを作成します。
    2. 1 mM MitoTracker ディープレッド( 材料表参照)ストック溶液 10 μL を 390 μL の DMSO で希釈して、25 μM のワーキングストックを作成します。
    3. 50 μg の MitoSOX Red25 ( 材料表を参照) を 13 μL の DMSO に溶解して、5 mM のワーキングストックを作成します。
    4. 10 mgのTMRE24 ( 材料表を参照)を19.4 mLのDMSOに溶解して、1 mMのストック溶液を作ります。10 μLの1 mM TMREを990 μLのDMSOに加えてTMREを希釈し、10 μMのワーキングストックを作成します。

2. HeLa細胞におけるCCCP処理と蛍光プローブによるミトコンドリア標識

注意: 次の手順をすばやく実行して、HeLa細胞が長期間インキュベーターから出ていないことを確認してください。

  1. トランスフェクションの翌日に、各実験プレートに5 μLまたは20 mM CCCP(最終濃度:それぞれ5 μMおよび20 μM)を2 μL加えます。コントロールプレートの場合は、2 μLのDMSOを追加します。プレートを5%CO2 および37°Cのインキュベーターに1.5時間戻します(図1A)。
    注:CCCP治療は合計2時間です。ただし、ミトコンドリアは、CCCP処理の最後の30分間に蛍光プローブで標識されます。
  2. 1.5時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、イメージングディッシュに蛍光プローブを追加します。プレートを5%CO2 および37°Cのインキュベーターに30分間戻します(図1A)。
    1. TMRE実験:25 μLの25 μM MitoTracker(最終濃度:25 nM)と2 μLの10 μM TMRE(最終濃度:10 nM)を追加します。
    2. MitoSOX 実験: 25 μM マイトトラッカー (最終濃度: 25 nM) を 2 μL 加え、5 mM MitoSOX (最終濃度: 2.5 μM) を 1 μL 加えます。
  3. 2時間のCCCP処理の後、イメージング用のHeLa細胞を調製します(図1A、B)。
    1. TMRE実験:HeLa細胞はすぐにイメージングの準備ができています。TMREがHeLa細胞培養培地に残っていることを確認します。
    2. MitoSOX実験:遊離のMitoSOX色素を除去するために、2 mLの予熱したHeLa培地で細胞を3倍洗浄します。予熱した培地2 mLを加えます。これで、HeLa細胞をイメージングする準備が整いました。
      注:実験条件と同じDMSOまたはCCCP濃度を含む新鮮な予熱したHeLa培地でHeLa細胞を洗浄します。MitoSOX または MitoTracker は含めないでください。

3. 共焦点顕微鏡画像取得のセットアップ

注:63x / 1.40開口数(NA)油浸対物レンズと環境チャンバー(材料表を参照)を備えた共焦点顕微鏡(材料表を参照)を使用してHeLa細胞を画像化します。

  1. イメージングの1時間前に、タンクバルブを開いてCO2をオンにします。Onボタンを押して、顕微鏡の環境コントローラーをオンにします。タッチパッドの上矢印と下矢印を使用して、温度を37°Cに、CO2を5%に調整します。完了したら、[設定]を押します。
    注意: 環境チャンバーへのドアが閉じていることを確認し、状態が安定するのを待ちます。
  2. レーザー設定
    1. 白色光レーザー(WLL)をオンにし、レーザー出力を85%に設定し、励起制御を最大出力に設定します。[取得]タブをクリックし、[レーザーの追加]を選択して、表示されるダイアログ ボックスで WLL を [オン] に切り替えます。[レーザー出力] ボタンをクリックし、「85%」と入力します。励起制御ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[最大電力]を選択します(図2A)。
    2. TMRE実験: YFP、マイトトラッカー、TMREの励起スペクトルと発光スペクトルを設定します。
      1. YFPの場合、励起レーザーを514 nmに設定し、発光スペクトルウィンドウを524-545 nmに設定します。 [取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]をクリックして、設定1にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスに波長として514と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に524、終了波長に545を入力します。
      2. MitoTracker ディープレッドの場合は、励起レーザーを641に設定し、発光スペクトルウィンドウを650-750 nmに設定します。[取得]タブで、[レーザーの追加]ボタンをクリックし、[設定1]にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として641と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に650、終了波長に750を入力します。
      3. TMREの場合、励起レーザーを555 nmに、発光スペクトルウィンドウを557-643 nmに設定します。[取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定2にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として555と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に557、終了波長に643を入力します。
    3. マイトSOX実験: YFP、マイトトラッカー、およびMitoSOXの励起スペクトルと発光スペクトルを設定します(図2B)。
      1. YFPの場合、励起レーザーを507 nmに設定し、発光スペクトルウィンドウを517-540 nmに設定します。[取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定1にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として507と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に517、終了波長に540を入力します。
      2. MitoSOXの場合、励起レーザーを547 nmに設定し、発光スペクトルウィンドウを564-636 nmに設定します。[取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。次に、[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定2にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として547と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に564、終了波長に636を入力します。
      3. MitoTracker ディープレッドの場合は、励起レーザーを 641 nm に設定し、発光スペクトルウィンドウを 652-742 nm に設定します。 [取得]タブで、[新しい設定の追加]ボタンをクリックします。[レーザーの追加]ボタンをクリックして、設定3にドラッグします。励起ラインをダブルクリックし、ダイアログボックスの波長として641と入力します。対応する検出器をダブルクリックして、開始波長に652、終了波長に742を入力します。
  3. 画像取得設定(図2C)
    1. フォーマットを1,024 x 1,024、スキャン速度を600 Hz、ライン平均を3に設定します。
      1. [取得]タブを選択し、[フォーマット]ボタンをクリックします。ドロップダウンメニューから[1,024 x 1,024]を選択します。[速度]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[600]を選択します。次に、[ライン平均]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[3]を選択します。
      2. 双方向スキャンをオンにして、位相とズーム係数をそれぞれ22.61と1.50に設定します。
        1. [ 取得] タブで、[ 双方向 ] ボタンを [オン] に切り替えます。 フェーズX 設定をクリックし、 22.61に設定します。 ズーム係数 設定をクリックし、 1.50に設定します。

4. 画像取得

注意:実験者は、YFP蛍光シグナルに基づいて細胞を選択するために視覚的な判断を下す必要があります。過飽和ピクセルは蛍光強度の定量化に大きな影響を与える可能性があるため、避けてください。ピクセルの彩度を示すオーバー/アンダールックアップテーブルを使用して、飽和画像の取得を回避します。

  1. 目的の 設定 をクリックし、 Fast Liveを押して、蛍光画像のライブプレビューを提供します。
  2. 対応する検出器をダブルクリックして、ゲインと強度を調整します。表示されるダイアログボックスで、スライダーを使用してゲインを調整します。強度を変更するには、励起ラインをダブルクリックし、ポップアップウィンドウの上矢印と下矢印を使用して強度を変更します。[停止] をクリックしてプレビューを終了します。
    1. TMRE実験:最初にDMSOコントロールプレートを画像化します。TMRE信号のゲインと強度を調整し(設定2)、ミトコンドリアネットワークの強度が飽和のすぐ下になるようにします。 実験のゲインと強度を一定に保ちます。MitoTrackerとYFP(設定1)のゲインと強度を調整して、ミトコンドリアネットワークが見えるが暗くなるようにします。
    2. MitoSOX実験:最初にDMSOコントロールプレートを画像化します。MitoSOX(設定2)信号のゲインと強度を調整して、蛍光が見えるが暗くなるようにします。実験のゲインと強度を一定に保ちます。YFP(設定1)とMitoTracker(設定3)のゲインと強度を調整して、ミトコンドリアネットワークが見えるが暗くなるようにします。
      注:TMREとMitoSOXのゲインと強度は、実験全体を通して一定に保つ必要があるため、記録してください。YFPおよびMitoTrackerの蛍光シグナルは、このプロトコルでは定量化されません。したがって、ゲインと強度は画像ごとに調整できます。細胞が細胞の損傷や光退色を引き起こす過度のレーザー強度にさらされないようにするために、 細胞が見やすく、それでも暗いゲインと強度の設定が最も効果的です。
  3. ゲインと強度の設定が完了したら、[ 開始 ]をクリックして画像を取り込みます。実験条件ごとに 20個の細胞の 画像を取得する(例えば、画像ごとに4個の細胞を有する5枚の画像; 図 2D)。

5. ImageJを用いた蛍光強度の定量化

注意: イメージングファイルは「.lif」として保存され、ImageJ29と互換性があります。ImageJと互換性のあるファイルタイプは、そのWebサイトで指定されています。互換性がない場合は、ファイルタイプを変換する必要がある場合があります。

  1. 関心領域 (ROI) を作成して保存します。
    1. ImageJ で、[ ファイル |新規 |画像。 表示されるダイアログ ボックスで、[ OK] をクリックします。
    2. [長方形ツール] ボタンをクリックして、6 ミクロン x 6 ミクロンのボックスを描画します。ROI マネージャーを開くには、[分析] |ツール |ROIマネージャ]をクリックし、ROIマネージャのダイアログボックスが表示されるのを待ちます(図3A)。長方形の ROI をマネージャに追加するには、マネージャ ダイアログ ボックスで [追加] をクリックします。[その他] を選択して ROI を保存し、[保存] ボタンをクリックして [OK] をクリックします。
  2. 蛍光強度を測定します。
    1. イメージ J で、[ ファイル ] をクリックし、[ 開く] を選択します。ダイアログ ボックスで、実験用のイメージング ファイルを選択し、[ 開く] をクリックします。
    2. [Bio-formatsインポートオプション]ウィンドウが表示されるのを待ちます(図3B)。「チャンネルを分割」を選択し、「開く」をクリックします。
      注意: 分割チャンネル機能を使用すると、画像内の各チャンネルを個別のウィンドウとして開くことができます。チャネル順序は取得順序に対応します。
      1. TMRE 実験: YFP (設定1)は最初のチャネル(c = 0)です。 MitoTracker (設定1)は2番目のチャネル(c = 1)です。TMRE(設定2)は3番目のチャネル(c = 2)です。
      2. MitoSOX 実験: YFP (設定1)が最初のチャネル(c = 0)です。 MitoSOX (設定2)は2番目のチャネル(c = 1)です。 MitoTracker (設定 3) は 3 番目のチャネル (c = 2) です。
    3. 画像を選択して明るさを調整します |調整 |明るさ (図3C)。
      注意: 画像の明るさが永続的に変更されないように、[ 設定]または [適用]を押さないでください。時折、蛍光強度がTMREまたはMitoSOXチャネルで表示されないことがあります。明るさを調整して、視覚化しやすくします。明るさを変更しても、生の蛍光強度の値には影響しません。
    4. [ 分析 ]をクリックし、[ 測定値の設定]を選択します。 [面積 ] ボックスと [平均] グレー値 チェックボックスをオンにして、[ OK ] をクリックします (図 3D)。
      注:平均グレー値は蛍光強度です。
    5. ROIマネージャを開き、分析をクリックしてステップ5.1で保存したROIをロードします。ツール |ROIマネージャー。ROI マネージャーで、[その他] をクリックし、表示されるリストから [開く] をクリックして、保存した ROI を選択します。
    6. ROIマネージャーから保存されたROIを選択して、単一セル内の5つのランダム領域の蛍光強度を測定し、ROIをセル内のランダムな位置に移動します(図3E)。 Mを押して蛍光強度を測定します。オーバーラップしない 4 つの領域を追加して、この手順を繰り返します。面積と平均グレー値を含むダイアログボックスが表示されたら(図3F)、値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けて分析します。
      1. TMRE 実験:画像を選択します(c = 2)。
      2. MitoSOX 実験: 画像を選択します (c = 2)。
    7. 平均蛍光強度値を求めます。表計算ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、5つの平均グレー値を平均します。セルごとにこのプロセスを繰り返します。
    8. 統計ソフトウェアプログラムを使用して、実験条件全体のTMREまたはMitoSOX平均グレー値を分析および比較します( 材料表を参照。図 4 および 図5)。データを棒グラフまたはバイオリンプロットとして表示します。

結果

このプロトコルでは、蛍光ベースの定量を使用して、CCCP処理後のミトコンドリアネットワークの膜電位とスーパーオキシドレベルを測定しました(図1)。このワークフローでは、子宮頸がん由来の不死化細胞株であるHeLa細胞を使用しました。HeLa細胞は、ミトコンドリア生物学の研究に日常的に使用されており、比較的平坦であるため、顕微鏡を使用してミトコンドリア?...

ディスカッション

ここで概説するワークフローは、蛍光ベースのイメージングを用いて、ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルを堅牢かつ再現性よく定量するために使用することができる30。これらの実験を設計する際に考慮すべき重要な技術的制限があります。HeLa細胞を、空のYFPベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240Rでトランスフェクトした。空...

開示事項

著者には、宣言する競合する利益はありません。

謝辞

この原稿に対する思慮深いフィードバックを提供してくれたEvansラボのメンバーに感謝します。この研究は、デュークホワイトヘッド奨学生、デューク科学技術奨学生、およびハワードヒューズ医学研究所(HHMI)ハンナグレイフェローシップによってサポートされています。 図1A は BioRender.com を用いて作製した。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

参考文献

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