Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Resumo

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Resumo

As mitocôndrias são organelas dinâmicas críticas para a homeostase metabólica, controlando a produção de energia via síntese de ATP. Para apoiar o metabolismo celular, vários mecanismos de controle de qualidade mitocondrial cooperam para manter uma rede mitocondrial saudável. Uma dessas vias é a mitofagia, onde a quinase 1 induzida por PTEN (PINK1) e a fosfoubiquitinação de Parkin das mitocôndrias danificadas facilitam o sequestro do autofagossomo e a subsequente remoção da célula via fusão lisossômica. A mitofagia é importante para a homeostase celular, e mutações em Parkin estão ligadas à doença de Parkinson (DP). Devido a esses achados, tem havido uma ênfase significativa na investigação do dano e turnover mitocondrial para entender os mecanismos moleculares e a dinâmica do controle de qualidade mitocondrial. Aqui, imagens de células vivas foram usadas para visualizar a rede mitocondrial de células HeLa, para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. Além disso, uma mutação PD-ligada de Parkin (Parkin^T240R) que inibe a mitofagia Parkin-dependente foi expressa para determinar como a expressão mutante impacta a rede mitocondrial em comparação com as pilhas que expressam Parkin selvagem-tipo. O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho simples usando abordagens baseadas em fluorescência para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma eficaz.

Introdução

A rede mitocondrial é uma série de organelas interconectadas que desempenham um papel crucial na produção de energia¹, imunidade inata ^2,3 e sinalização celular ^4,5. A desregulação mitocondrial tem sido associada a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP)^6,7. A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta neurônios dopaminérgicos da substância negra e afeta cerca de 10 milhões de pessoas em todo o^mundo8. A DP....

Protocolo

1. Preparação de amostras biológicas

NOTA: Execute as seguintes etapas usando técnica estéril em um gabinete de biossegurança. Borrife a superfície do gabinete e todos os materiais com etanol 70%.

1. Cultura e transfecção de células HeLa
   1. Cultura de 30.000 células HeLa em meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g/L de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e solução de L-glutamina a 1% (HeLa media; ver Tabela de Materiais). Plaquear as células em placas de imagem com fundo de vidro de 35 mm (verT capaz de Materiais) contendo 2 mL de mídia HeLa pré-aquec....

Discussão

O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma robusta e reprodutível usando imagens baseadas em fluorescência³⁰. Há limitações técnicas importantes a serem consideradas ao projetar esses experimentos. As células HeLa foram transfectadas com um vetor YFP vazio, YFP-Parkin^WT ou YFP-Parkin^T240R. O vetor YFP vazio foi usado como controle para confirmar que os achados experimentais.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anhydrous	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	This Paper	Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope	Leica	N/A
LIGHTNING Deconvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 confocal microscope	Leica	N/A