طريقة "حلب الدماغ" لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن من الفئران الحية

Summary

يتم تقديم طريقة لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية oligodendrocyte من أدمغة الفئران الحية هنا بالتفصيل التجريبي. يسمح بمجموعات متعددة من هذه الخلايا من نفس دون المساس برفاههم.

Abstract

تظل الخلايا الجذعية العصبية الخاصة بالأنسجة (NSCs) نشطة في دماغ الثدييات بعد الولادة. يقيمون في منافذ متخصصة ، حيث يولدون خلايا عصبية جديدة وخلايا دبقية. أحد هذه الأماكن هو المنطقة تحت البطينية (SEZ ؛ وتسمى أيضا المنطقة البطينية تحت البطينية) ، والتي تقع عبر الجدران الجانبية للبطينين الجانبيين ، بجوار طبقة الخلايا العصبية. يتم توزيع الخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) بكثرة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، وتشكل مجموعة من الخلايا السلفية التكاثرية التي يمكن أن تولد خلايا قليلة التغصن.

تظهر كل من NSCs و OPCs إمكانية التجديد الذاتي ودورات الهدوء / التنشيط. بسبب موقعها ، يتم إجراء العزل والتحقيق التجريبي لهذه الخلايا بعد الوفاة. هنا ، نصف بالتفصيل "حلب الدماغ" ، وهي طريقة لعزل NSCs و OPCs ، من بين خلايا أخرى ، عن الحية. هذا بروتوكول من خطوتين مصمم للاستخدام في القوارض واختباره في الفئران. أولا ، يتم "إطلاق" الخلايا من الأنسجة عن طريق الحقن داخل المخ البطيني التجسيمي (i.c.v.) من "كوكتيل التحرير". المكونات الرئيسية هي النورامينيداز ، الذي يستهدف خلايا البطانة العصبية ويحفز تعرية جدار البطين ، وهو جسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، وعامل نمو الخلايا الليفية -2. في خطوة "التجميع" الثانية ، يتم إجراء الخزعات السائلة من السائل النخاعي من الصهريج الكبير ، في الفئران المخدرة دون الحاجة إلى شق.

تظهر النتائج المعروضة هنا أن الخلايا المعزولة تحتفظ بصورتها الذاتية وأن NSCs في المنطقة الاقتصادية الخاصة تحافظ على هدوءها. يقتصر تعرية طبقة البطانة العصبية على المستوى التشريحي للحقن ويتم تحمل البروتوكول (الإطلاق والتجميع) جيدا من قبل. يمهد هذا النهج الجديد الطريق لإجراء دراسات طولية لتكوين الخلايا العصبية الداخلية والتكون الدبقي في التجارب.

Introduction

الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة هي خلايا ملتزمة جزئيا يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع مجموعات الخلايا التي تشكل الأنسجة المعنية. بصرف النظر عن كونها متعددة القدرات ، فهي خلايا ذاتية التجديد وضرورية للحفاظ على التوازن والقدرة التجديدية للأنسجة¹. تظل بعض الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة في حالة نشطة وتكاثرية قوية ، مثل الخلايا الجذعية المعوية أو المكونة للدم. البعض الآخر ، مثل الخلايا الجذعية في الدماغ ، لا يزال هادئا أو نائما إلى حد كبير². في الدماغ البالغ ، يمكن العثور على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في مناطق متخصصة ، وغالبا ما تسمى المنافذ. توجد منطقتان موصوفتان جيدا في المنطقة تحت البطينية (SEZ) للبطينين الجانبيين وفي الت....

Protocol

تم إجراء إجراءات تربية وصيانتها وتجربتها وفقا لقانون في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 ، الذي أذنت به وزارة الداخلية ، والمرسوم الرئاسي 56/2013 للجمهورية اليونانية ، والذي تم فحصه من قبل هيئات رعاية والمراجعة الأخلاقية لجامعتي كامبريدج وباتراس ، وكذلك تمت الموافقة عليه وفحصه من قبل لجنة رعاية واستخدام المحلية في المحافظات (رقم البروتوكول: 5675/39/18-01-2021). تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley و Wistar و Long-Evans ، التي تتراوح أعمارها بين 2 و 4 أشهر وبأوزان جسم تتراوح بين 150 جم و 250 جم. يتم تلخيص البروتوكول بيانيا في الشكل 1.

1. الافراج عن إعداد كوكتيل

النتائج

الإفراج عن وجمع NSCs
يتم فصل NSCs من SEZ عن CSF فقط عن طريق الطبقة الأحادية من الخلايا العصبية ، وإن كانت لا تزال على اتصال مباشر مع محتوى البطين عن طريق إقحام العمليات أحادية الهدب ^8,9. يعمل Neuraminidase بشكل خاص على خلايا البطانة العصبية عن طريق انشق?.......

Discussion

الخلايا الجذعية والسلفية متناثرة نسبيا في أنسجة المخ في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، توجد NSCs في مناطق يتعذر الوصول إليها لإجراء خزعات سهلة وآمنة (جدران البطين ، الحصين). لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة للعمل تجريبيا مع هذه الخلايا ، حتى الآن ، هي عزلها بعد الوفاة. يتم وصف طريقة تسمح بالجمع الفرد?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX