A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يتم تقديم طريقة لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية oligodendrocyte من أدمغة الفئران الحية هنا بالتفصيل التجريبي. يسمح بمجموعات متعددة من هذه الخلايا من نفس دون المساس برفاههم.
تظل الخلايا الجذعية العصبية الخاصة بالأنسجة (NSCs) نشطة في دماغ الثدييات بعد الولادة. يقيمون في منافذ متخصصة ، حيث يولدون خلايا عصبية جديدة وخلايا دبقية. أحد هذه الأماكن هو المنطقة تحت البطينية (SEZ ؛ وتسمى أيضا المنطقة البطينية تحت البطينية) ، والتي تقع عبر الجدران الجانبية للبطينين الجانبيين ، بجوار طبقة الخلايا العصبية. يتم توزيع الخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) بكثرة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، وتشكل مجموعة من الخلايا السلفية التكاثرية التي يمكن أن تولد خلايا قليلة التغصن.
تظهر كل من NSCs و OPCs إمكانية التجديد الذاتي ودورات الهدوء / التنشيط. بسبب موقعها ، يتم إجراء العزل والتحقيق التجريبي لهذه الخلايا بعد الوفاة. هنا ، نصف بالتفصيل "حلب الدماغ" ، وهي طريقة لعزل NSCs و OPCs ، من بين خلايا أخرى ، عن الحية. هذا بروتوكول من خطوتين مصمم للاستخدام في القوارض واختباره في الفئران. أولا ، يتم "إطلاق" الخلايا من الأنسجة عن طريق الحقن داخل المخ البطيني التجسيمي (i.c.v.) من "كوكتيل التحرير". المكونات الرئيسية هي النورامينيداز ، الذي يستهدف خلايا البطانة العصبية ويحفز تعرية جدار البطين ، وهو جسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، وعامل نمو الخلايا الليفية -2. في خطوة "التجميع" الثانية ، يتم إجراء الخزعات السائلة من السائل النخاعي من الصهريج الكبير ، في الفئران المخدرة دون الحاجة إلى شق.
تظهر النتائج المعروضة هنا أن الخلايا المعزولة تحتفظ بصورتها الذاتية وأن NSCs في المنطقة الاقتصادية الخاصة تحافظ على هدوءها. يقتصر تعرية طبقة البطانة العصبية على المستوى التشريحي للحقن ويتم تحمل البروتوكول (الإطلاق والتجميع) جيدا من قبل. يمهد هذا النهج الجديد الطريق لإجراء دراسات طولية لتكوين الخلايا العصبية الداخلية والتكون الدبقي في التجارب.
الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة هي خلايا ملتزمة جزئيا يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع مجموعات الخلايا التي تشكل الأنسجة المعنية. بصرف النظر عن كونها متعددة القدرات ، فهي خلايا ذاتية التجديد وضرورية للحفاظ على التوازن والقدرة التجديدية للأنسجة1. تظل بعض الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة في حالة نشطة وتكاثرية قوية ، مثل الخلايا الجذعية المعوية أو المكونة للدم. البعض الآخر ، مثل الخلايا الجذعية في الدماغ ، لا يزال هادئا أو نائما إلى حد كبير2. في الدماغ البالغ ، يمكن العثور على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في مناطق متخصصة ، وغالبا ما تسمى المنافذ. توجد منطقتان موصوفتان جيدا في المنطقة تحت البطينية (SEZ) للبطينين الجانبيين وفي الت....
تم إجراء إجراءات تربية وصيانتها وتجربتها وفقا لقانون في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 ، الذي أذنت به وزارة الداخلية ، والمرسوم الرئاسي 56/2013 للجمهورية اليونانية ، والذي تم فحصه من قبل هيئات رعاية والمراجعة الأخلاقية لجامعتي كامبريدج وباتراس ، وكذلك تمت الموافقة عليه وفحصه من قبل لجنة رعاية واستخدام المحلية في المحافظات (رقم البروتوكول: 5675/39/18-01-2021). تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley و Wistar و Long-Evans ، التي تتراوح أعمارها بين 2 و 4 أشهر وبأوزان جسم تتراوح بين 150 جم و 250 جم. يتم تلخيص البروتوكول بيانيا في الشكل 1.
1. الافراج عن إعداد كوكتيل
الإفراج عن وجمع NSCs
يتم فصل NSCs من SEZ عن CSF فقط عن طريق الطبقة الأحادية من الخلايا العصبية ، وإن كانت لا تزال على اتصال مباشر مع محتوى البطين عن طريق إقحام العمليات أحادية الهدب 8,9. يعمل Neuraminidase بشكل خاص على خلايا البطانة العصبية عن طريق انشق?.......
الخلايا الجذعية والسلفية متناثرة نسبيا في أنسجة المخ في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، توجد NSCs في مناطق يتعذر الوصول إليها لإجراء خزعات سهلة وآمنة (جدران البطين ، الحصين). لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة للعمل تجريبيا مع هذه الخلايا ، حتى الآن ، هي عزلها بعد الوفاة. يتم وصف طريقة تسمح بالجمع الفرد?.......
ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للإعلان عنه.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة Action Medical Research (المملكة المتحدة) (GN2291) إلى R.J.M.F. و I.K. كما تم دعم العمل البحثي جزئيا (تكاليف ودعم D.D) من قبل المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار (H.F.R.I.) في إطار "الدعوة الأولى لمشاريع أبحاث H.F.R.I. لدعم أعضاء هيئة التدريس والباحثين وشراء منحة معدات البحث عالية التكلفة" (رقم المشروع: 3395).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Release cocktail | |||
β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
Surgical procedures | |||
10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
Tissue and cells handling and immunostainings | |||
96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
Cryostat | Leica | CM1510S | |
DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
EGF | Peprotech | 315-09 | |
FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
Triton X-100 | Merck | X100 | |
Microscopy and image analysis | |||
Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
Image analysis | Leica | LasX |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved