طريقة "حلب الدماغ" لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن من الفئران الحية

Summary

يتم تقديم طريقة لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية oligodendrocyte من أدمغة الفئران الحية هنا بالتفصيل التجريبي. يسمح بمجموعات متعددة من هذه الخلايا من نفس دون المساس برفاههم.

Abstract

تظل الخلايا الجذعية العصبية الخاصة بالأنسجة (NSCs) نشطة في دماغ الثدييات بعد الولادة. يقيمون في منافذ متخصصة ، حيث يولدون خلايا عصبية جديدة وخلايا دبقية. أحد هذه الأماكن هو المنطقة تحت البطينية (SEZ ؛ وتسمى أيضا المنطقة البطينية تحت البطينية) ، والتي تقع عبر الجدران الجانبية للبطينين الجانبيين ، بجوار طبقة الخلايا العصبية. يتم توزيع الخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) بكثرة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، وتشكل مجموعة من الخلايا السلفية التكاثرية التي يمكن أن تولد خلايا قليلة التغصن.

تظهر كل من NSCs و OPCs إمكانية التجديد الذاتي ودورات الهدوء / التنشيط. بسبب موقعها ، يتم إجراء العزل والتحقيق التجريبي لهذه الخلايا بعد الوفاة. هنا ، نصف بالتفصيل "حلب الدماغ" ، وهي طريقة لعزل NSCs و OPCs ، من بين خلايا أخرى ، عن الحية. هذا بروتوكول من خطوتين مصمم للاستخدام في القوارض واختباره في الفئران. أولا ، يتم "إطلاق" الخلايا من الأنسجة عن طريق الحقن داخل المخ البطيني التجسيمي (i.c.v.) من "كوكتيل التحرير". المكونات الرئيسية هي النورامينيداز ، الذي يستهدف خلايا البطانة العصبية ويحفز تعرية جدار البطين ، وهو جسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، وعامل نمو الخلايا الليفية -2. في خطوة "التجميع" الثانية ، يتم إجراء الخزعات السائلة من السائل النخاعي من الصهريج الكبير ، في الفئران المخدرة دون الحاجة إلى شق.

تظهر النتائج المعروضة هنا أن الخلايا المعزولة تحتفظ بصورتها الذاتية وأن NSCs في المنطقة الاقتصادية الخاصة تحافظ على هدوءها. يقتصر تعرية طبقة البطانة العصبية على المستوى التشريحي للحقن ويتم تحمل البروتوكول (الإطلاق والتجميع) جيدا من قبل. يمهد هذا النهج الجديد الطريق لإجراء دراسات طولية لتكوين الخلايا العصبية الداخلية والتكون الدبقي في التجارب.

Introduction

الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة هي خلايا ملتزمة جزئيا يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع مجموعات الخلايا التي تشكل الأنسجة المعنية. بصرف النظر عن كونها متعددة القدرات ، فهي خلايا ذاتية التجديد وضرورية للحفاظ على التوازن والقدرة التجديدية للأنسجة¹. تظل بعض الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة في حالة نشطة وتكاثرية قوية ، مثل الخلايا الجذعية المعوية أو المكونة للدم. البعض الآخر ، مثل الخلايا الجذعية في الدماغ ، لا يزال هادئا أو نائما إلى حد كبير². في الدماغ البالغ ، يمكن العثور على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في مناطق متخصصة ، وغالبا ما تسمى المنافذ. توجد منطقتان موصوفتان جيدا في المنطقة تحت البطينية (SEZ) للبطينين الجانبيين وفي التلفيف المسنن للقرن الحمون. يولد مكانة المنطقة الاقتصادية الخاصة أكبر عدد من الخلايا ، في المقام الأول الخلايا العصبية التي تهاجر نحو المصابيح الشمية وتساهم في السكان المحليين بين الخلايا العصبية. في المقابل ، تهاجر الأرومات قليلة التغصن المتولدة إلى الجسم الثفني المجاور (CC)³. الخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) هي خلايا نشطة انقساميا ، موزعة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، والتي: أ) ملتزمة بسلالة oligodendroglial ، ب) يمكن أن تهاجر إلى مواقع إزالة الميالين ، و iii) يمكن أن تتمايز إلى oligodendrocytes الميالينية. تظهر OPCs أيضا إمكانات التجديد الذاتي والسكون⁴.

حتى الآن ، تطلب عزل ودراسة NSCs و OPCs تفكك ما بعد الوفاة للدماغ المشريح وأنسجة الحبل الشوكي. للتحايل على هذا القيد التجريبي ، أنشأنا طريقة تسمح ، لأول مرة ، بعزل NSCs و OPCs في الدماغ عن الحية. نسمي هذه الطريقة "الحلب" ، لأنها تمكن من مجموعات متعددة من الخلايا حيث لا يتم استنفاد بركها. تم تطوير البروتوكول في الفئران ، نظرا لحجم دماغها الكبير ، ويستهدف بشكل أساسي المنطقة الاقتصادية الخاصة ، أو CC ، ويتضمن خطوتين رئيسيتين. أولا ، يتم "إزالة" NSCs أو OPCs من الأنسجة عن طريق حقن i.c.v. من "كوكتيل إطلاق" يحتوي على النيورامينيداز ، وهو سم يحفز تعرية جدار البطين ، وجسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2). يتم حقن الكوكتيل بشكل نمطي ثنائي داخل البطينين الجانبيين. إذا كان الاستخدام المقصود هو عزل NSCs ، يتم استهداف المناطق المنضدية للبطينين الجانبيين. إذا كان الهدف هو عزل OPCs بشكل أكثر نقاء ، يتم حقن الكوكتيل ذيليا في منطقة الحصين فيمبريا. في خطوة "التجميع" الثانية ، يتم إجراء الخزعات السائلة من السائل النخاعي (CSF) من الصهريج العظيم للفئران المخدرة ، دون الحاجة إلى شق. يتم خلط الخزعة السائلة مع وسط زراعة NSC ويمكن الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية حتى الطلاء.

Protocol

تم إجراء إجراءات تربية وصيانتها وتجربتها وفقا لقانون في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 ، الذي أذنت به وزارة الداخلية ، والمرسوم الرئاسي 56/2013 للجمهورية اليونانية ، والذي تم فحصه من قبل هيئات رعاية والمراجعة الأخلاقية لجامعتي كامبريدج وباتراس ، وكذلك تمت الموافقة عليه وفحصه من قبل لجنة رعاية واستخدام المحلية في المحافظات (رقم البروتوكول: 5675/39/18-01-2021). تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley و Wistar و Long-Evans ، التي تتراوح أعمارها بين 2 و 4 أشهر وبأوزان جسم تتراوح بين 150 جم و 250 جم. يتم تلخيص البروتوكول بيانيا في الشكل 1.

1. الافراج عن إعداد كوكتيل

ملاحظة: استعد طازجا في يوم الإجراء واحفظه على الثلج. يتم إعطاء الكميات لكل 2 ميكرولتر ليتم حقنها في كل بطين جانبي. تحضير 1 ميكرولتر إضافية لكل حقنة مقصودة.

1. تحضير 0.5 ميكرولتر من 500 mU neuraminidase من كلوستريديوم بيرفرينجنز (كلوستريديوم ويلتشي).
   ملاحظة: قم بتخزين هذا كمخزون 1 وحدة / ميكرولتر مخفف في ماء معقم عند -20 درجة مئوية. لم يتم اختبار أنواع أخرى من النيورامينيداز.
2. تحضير 1 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة المانعة للإنتغرين-β1.
   ملاحظة: قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. تحضير 0.5 ميكرولتر تحتوي على 0.5 ميكروغرام من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (FGF البشري المؤتلف الأساسي).
   ملاحظة: قم بتخزينه كمرق 1 ميكروغرام / ميكرولتر مخفف في ماء معقم عند -20 درجة مئوية.

2. حقن كوكتيل الإفراج

ملاحظة: يمكن تنفيذ العملية برمتها في غضون 20 دقيقة. احرص على إجراء الجراحة في حالات العقم. نظف جميع الأسطح بمطهر (على سبيل المثال ، 3٪ أو 6٪ بيروكسيد الهيدروجين). استخدم أدوات وقفازات وأردية وستائر معقمة أو معقمة بسهولة.

1. تخدير التجارب عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (2.5٪ للتحريض و 2٪ للصيانة). تأكد من عمق التخدير عن طريق فحص منعكس القرنية ، ورد الفعل على المنبهات (اختبار قرصة الأطراف الخلفية والذيل) ، وطريقة التنفس.
   ملاحظة: يمكن إجراء العمليات الجراحية تحت التخدير العام الناجم عن التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق (على سبيل المثال ، الكيتامين [40 مجم / كجم] والزيلازين [10 مجم / كجم]). تم تأكيد التخدير العميق عن طريق فحص منعكس القرنية ، ورد الفعل على المنبهات (اختبار قرصة الطرف الخلفي والذيل) ، وطريقة التنفس.
2. يجب تطبيق التسكين تحت الجلد (مثال: 0.3 ملغ/مل من البوبرينورفين) عند تحريض التخدير.
3. جبل الفئران على الإطار المجسم.
4. حلق فرو الرأس بشفرة حلاقة ونظف البشرة بمطهر ، مثل محلول بوفيدون اليود بنسبة 10٪ ثم الكحول. ضع المطهر ثلاث مرات باستخدام مسحات قطنية معقمة. فرك في حركة دائرية لمدة 3-5 ثوان في كل مرة. ضع مرهم العين لمنع الجفاف.
5. قم بعمل شق 2 سم في جلد الرأس على طول الخط الأوسط باستخدام مشرط معقم.
6. قم بتنظيف الجمجمة بدقة باستخدام مسحات معقمة ومحلول ملحي معقم.
7. حدد البريغما باستخدام حافة إبرة حقنة هاملتون سعة 10 ميكرولتر مثبتة على جهاز التجسيم. اضبط bregma على أنه "النقطة 0,0".
   ملاحظة: يتم تحديد bregma كنقطة تقاطع بين الغرز السهمية والإكليلية. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل في أطلس دماغ الفئران في Paxinos و Watson⁵.
8. انقل الجهاز إلى الإحداثيات الأمامية الخلفية (AP) = 0.3 مم ، الجانبي (L) = +1.2 مم (لاستهداف المنطقة الاقتصادية الخاصة) ، أو AP = 1.5 مم ، L = +2.0 مم (لاستهداف CC).
9. حفر حفرة لدغ 1 مم باستخدام مثقاب الأسنان.
   ملاحظة: عند الحفر باليد ، احرص على عدم إصابة السطح القشري. من غير المتوقع أن يكون النزيف كبيرا. قم بإزالة أي دم بالمحلول الملحي واضغط لوقف النزيف المستمر.
10. تحميل 4 ميكرولتر من كوكتيل الإفراج في حقنة هاميلتون 10 ميكرولتر.
11. اخفض الإبرة (يفضل أن تكون حادة أو مخروطية الطرف) لحقنة هاملتون من أجل ملامسة الجافية.
12. أدخل الإبرة بالعمق المطلوب (D = 3.5 مم).
    ملاحظة: صب المياه المالحة على سطح الجافية للحفاظ على رطوبة الأنسجة.
13. نقع 2 ميكرولتر من كوكتيل الإطلاق بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة.
14. اترك الإبرة في مكانها لمدة 2 دقيقة أخرى قبل الاسترجاع البطيء لتجنب ظهور كوكتيل الإطلاق.
15. كرر الخطوات 2.8-2.14 لنصف الكرة الآخر عند الإحداثيات AP = 0.3 مم ، L = -1.2 مم (لاستهداف المنطقة الاقتصادية الخاصة) ، أو AP = 1.5 مم ، L = -2.0 مم (لاستهداف CC).
16. خياطة شق مع 5-0 نايلون (قطر 0.1 مم) وتنظيف المنطقة خياطة مع مطهر.
17. قم بإزالة القناع الذي يزود المخدر ونقل إلى منطقة مراقبة ما بعد العملية.
    ملاحظة: يجب أن يحدث التعافي من التخدير والحفاظ على الاستلقاء في غضون 5-10 دقائق ، والشفاء التام (السلوك الطبيعي) في غضون 25 دقيقة.
    1. راقب عن كثب الانتعاش (حركة حية وغير منقطعة ، وصول متكرر إلى الماء) في مكان ساخن جيدا (24-25 درجة مئوية) ، مكان هادئ بدون فراش صغير الجسيمات ، والذي يمكن أن يسد الشعب الهوائية. أعد إلى شركة زملائه في القفص (وليس للحيوانات الجديدة) فقط بعد التأكد من الشفاء التام.
    2. مراقبة في مرفق الصيانة لمدة 48 ساعة على الأقل بعد الجراحة. معالجة علامات الألم (إخفاء الرأس ، وضع الرأس أو الجسم غير الطبيعي ، فرط الحساسية ، وفرط الاستثارة في التعامل) عن طريق إعطاء تسكين الألم (على سبيل المثال ، 0.3 ملغ / مل من البوبرينورفين ، تحت الجلد). إحالة ذات الفراء المشوه أو المنسوب إلى الطبيب البيطري المسؤول.

3. خزعة السائل النخاعي (CSF)

ملاحظة: يمكن إجراء العملية برمتها في غضون 10 دقائق. يتم إجراء الخزعة السائلة الموصوفة هنا بعد 3 أيام من حقن كوكتيل الإطلاق ولكن يمكن إجراؤها بنفس الطريقة تماما عند الحاجة. احرص على إجراء الجراحة في حالات العقم. نظف جميع الأسطح بمطهر (على سبيل المثال ، 3٪ أو 6٪ بيروكسيد الهيدروجين). استخدم أدوات وقفازات وأردية وستائر معقمة أو معقمة بسهولة.

1. تخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (2.5 ٪ للتحريض و 2 ٪ للصيانة). تأكيد عمق التخدير عن طريق فحص القرنية
   رد الفعل ، رد الفعل على المنبهات (اختبار الأطراف الخلفية وقرصة الذيل) ، وطريقة التنفس.
   ملاحظة: يمكن إجراء العمليات الجراحية تحت التخدير العام الناجم عن التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق (على سبيل المثال ، الكيتامين [40 مجم / كجم] والزيلازين [10 مجم / كجم]). ومع ذلك ، لا ينصح بذلك لأن الإجراء قصير ، خاصة إذا تم إجراء الخزعات عدة مرات في أيام متتالية.
2. يجب تطبيق التسكين تحت الجلد (مثال: 0.3 ملغ/مل من البوبرينورفين) عند تحريض التخدير.
3. جبل التجريبي على الإطار المجسم. استخدم قضبان الأذن لتثبيت الرأس دون إعاقة الحركة الدورانية نحو الأمام والخلف.
4. ثبت الرأس بزاوية 40 درجة لأسفل بحيث يمكن تحقيق امتداد جيد للجزء الخلفي من الرقبة.
   ملاحظة: تتمثل إحدى طرق القيام بذلك في استخدام شريط الفم الخاص بالجهاز⁶.
5. حلق الفراء في منطقة الرقبة باستخدام ماكينة حلاقة ونظف البشرة بمطهر ، مثل محلول البوفيدون واليود بنسبة 10٪ ثم الكحول. ضع المطهر ثلاث مرات باستخدام مسحات قطنية معقمة. فرك في حركة دائرية لمدة 3-5 ثوان في كل مرة.
6. باستخدام طرف الإصبع ، ابحث عن المنطقة الاكتئابية على شكل معين الموضوعة بين النتوء القذالي والعمود الفقري للأطلس⁶.
7. ارسم علامة نقطة (على سبيل المثال ، باستخدام علامة).
8. إصلاح حقنة 1 مل أو 0.5 مل على الإطار المجسم.
   ملاحظة: ينصح باستخدام المحاقن ذات الإبر غير القابلة للفصل لأنها تنتج شفطا أفضل ولها حجم ميت أقل.
9. أحضر الإبرة عند نقطة ملامسة الجلد عند علامة النقطة.
10. باستخدام زوج من الملقط ، ارفع الجلد أثناء خفض المحقنة عبر طبقات الجلد.
11. استرجع المكبس قليلا لتوليد ضغط سلبي في المحقنة.
12. أعد التشغيل لغمس الإبرة ببطء شديد حتى يظهر السائل (CSF) في المحقنة.
13. قم بتثبيت الإبرة في هذا الموضع واترك التدفق البطيء ل CSF.
    ملاحظة: يمكن خفض الإبرة أو رفعها قليلا إذا كان تدفق السائل الدماغي النخاعي بطيئا جدا.
14. ابدأ في إزالة السائل الدماغي النخاعي ببطء (بخطوات 40 ميكرولتر / دقيقة) حتى 120 ميكرولتر.
15. استرجع المحقنة ببطء.
16. يتم تطبيق 1 مل من المصل الطبيعي داخل الصفاق لدعم تجديد التجريبية للسوائل.
17. امزج الخزعة السائلة (CSF) مع 400 ميكرولتر من وسط NSC واحتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: يجب معالجة الخزعات السائلة في غضون 3 ساعات إذا لم يتم تجميدها.
18. قم بإزالة القناع الذي يزود المخدر ونقل إلى منطقة مراقبة ما بعد العملية.
    ملاحظة: يجب أن يحدث التعافي من التخدير والحفاظ على الاستلقاء في غضون 5-10 دقائق ، والشفاء التام (السلوك الطبيعي) في غضون 25 دقيقة.
    1. راقب عن كثب الانتعاش (حركة حية وغير منقطعة ، وصول متكرر إلى الماء) في مكان ساخن جيدا (24-25 درجة مئوية) ، مكان هادئ بدون فراش صغير الجسيمات ، والذي يمكن أن يسد الشعب الهوائية. أعد إلى صحبة زملائه في القفص (وليس إلى جديدة) فقط بعد تأكيد الشفاء التام.
    2. مراقبة في مرفق الصيانة لمدة 48 ساعة على الأقل بعد الجراحة. في حال ملاحظة علامات الألم (إخفاء الرأس، وضع غير طبيعي للرأس أو الجسم، فرط الحساسية، وفرط استثارة التعامل)، يتم تطبيق التسكين (على سبيل المثال، 0.3 ملغ/مل من البوبرينورفين تحت الجلد). إحالة ذات الفراء المشوه أو المنسوب إلى الطبيب البيطري المسؤول.

4. معالجة الأنسجة للتألق المناعي

1. القتل الرحيم للحيوان عن طريق التسريب داخل القلب من 20 مل من محلول ملحي بارد مثلج ، يليه 50 مل من الجليد البارد 4٪ بارافورمالدهايد (PFA ؛ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS] من الرقم الهيدروجيني = 7.4).
2. تشريح أنسجة المخ.
   1. افصل الرأس عن الجسم باستخدام مقص لعمل قطع في منطقة عنق الرحم. استخدم المقص لإزالة الجلد ثم قطع عظم الجمجمة على طول خط الوسط السهمي ، مع توجيه أطراف المقص لأعلى حتى لا تتلف أنسجة المخ. تهدف إلى مواصلة القطع قدر الإمكان ، واجتياز خط الوسط الإكليلي.
   2. استخدم الملقط لإزالة العظام ، بدءا من العظام فوق القذالي والجداري وأخيرا العظام الأمامية.
   3. بمجرد الكشف عن أنسجة المخ ، استخدم الملقط أو ملعقة لرفعها من الجمجمة. لتسهيل ذلك ، قم بقطع الأعصاب في قاعدة الدماغ والمصابيح الشمية ، إن لم يكن مطلوبا.
3. بعد تثبيت الأنسجة طوال الليل في 2٪ PFA عند 4 درجات مئوية.
4. قم بحماية الأنسجة بالتبريد في 30٪ سكروز (في برنامج تلفزيوني) لمدة 48 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية حتى تغوص الأنسجة في القاع.
5. قم بتجميد المنديل عند -80 درجة مئوية.
6. قطع أنسجة المخ إلى أقسام إكليلية بسمك 14 ميكرومتر باستخدام cryostat.
7. إجراء تلطيخ المناعي باستخدام البروتوكولات القياسية ^3,7
   1. احتضان الأقسام مع العازلة المانع (3٪ ألبومين مصل البقر [BSA] ، 0.1٪ Triton X-100 ، في PBS) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   2. إجراء استرجاع المستضد (الغليان لمدة 15 دقيقة في محلول سترات 10 مللي متر ، الرقم الهيدروجيني = 6.0 ، باستخدام الجرار الزجاجية).
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكنها ضرورية للمستضدات النووية.
   3. يحضر إلى درجة حرارة الغرفة ويحتضن بالأجسام المضادة الأولية ضد البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، و doublecortin (Dcx) ، و S100β ، و β-catenin (انظر جدول المواد) في سد المخزن المؤقت طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   4. احتضان لمدة ساعتين مع الأجسام المضادة الثانوية في PBS مع 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) للتلطيخ النووي في درجة حرارة الغرفة (انظر جدول المواد).
   5. قم بتركيب أغطية الغطاء.

5. معالجة الخلايا المعزولة للتألق المناعي

1. قم بطلاء الخلايا في 96 لوحة بئر متوافقة مع الفحص المجهري ، مغلفة ببولي-D-lysine (100 ميكروغرام / مل).
2. ثبت الخلايا في الثلج البارد 2٪ PFA لمدة 10 دقائق واغسل 3x باستخدام PBS.
3. إجراء التألق المناعي باستخدام الإجراءات القياسية ^3,7 ل PDGFRα و GFAP و Dcx و SOX2 و ID3 (انظر جدول المواد).
4. احتفظ بالخلايا في PBS + NaN₃ (0.1٪) عند 4 درجات مئوية في الظلام.

6. الفحص المجهري وتحليل الصور

1. التقط صورا باستخدام التألق أو الفحص المجهري متحد البؤر وقم بإجراء عمليات عد الخلايا باستخدام أدوات برامج تحليل الصور القياسية ، مثل عدادات الخلايا.

النتائج

الإفراج عن وجمع NSCs
يتم فصل NSCs من SEZ عن CSF فقط عن طريق الطبقة الأحادية من الخلايا العصبية ، وإن كانت لا تزال على اتصال مباشر مع محتوى البطين عن طريق إقحام العمليات أحادية الهدب ^8,9. يعمل Neuraminidase بشكل خاص على خلايا البطانة العصبية عن طريق انشق?...

Discussion

الخلايا الجذعية والسلفية متناثرة نسبيا في أنسجة المخ في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، توجد NSCs في مناطق يتعذر الوصول إليها لإجراء خزعات سهلة وآمنة (جدران البطين ، الحصين). لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة للعمل تجريبيا مع هذه الخلايا ، حتى الآن ، هي عزلها بعد الوفاة. يتم وصف طريقة تسمح بالجمع الفرد?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX