A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم طريقة لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية oligodendrocyte من أدمغة الفئران الحية هنا بالتفصيل التجريبي. يسمح بمجموعات متعددة من هذه الخلايا من نفس دون المساس برفاههم.

Abstract

تظل الخلايا الجذعية العصبية الخاصة بالأنسجة (NSCs) نشطة في دماغ الثدييات بعد الولادة. يقيمون في منافذ متخصصة ، حيث يولدون خلايا عصبية جديدة وخلايا دبقية. أحد هذه الأماكن هو المنطقة تحت البطينية (SEZ ؛ وتسمى أيضا المنطقة البطينية تحت البطينية) ، والتي تقع عبر الجدران الجانبية للبطينين الجانبيين ، بجوار طبقة الخلايا العصبية. يتم توزيع الخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) بكثرة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، وتشكل مجموعة من الخلايا السلفية التكاثرية التي يمكن أن تولد خلايا قليلة التغصن.

تظهر كل من NSCs و OPCs إمكانية التجديد الذاتي ودورات الهدوء / التنشيط. بسبب موقعها ، يتم إجراء العزل والتحقيق التجريبي لهذه الخلايا بعد الوفاة. هنا ، نصف بالتفصيل "حلب الدماغ" ، وهي طريقة لعزل NSCs و OPCs ، من بين خلايا أخرى ، عن الحية. هذا بروتوكول من خطوتين مصمم للاستخدام في القوارض واختباره في الفئران. أولا ، يتم "إطلاق" الخلايا من الأنسجة عن طريق الحقن داخل المخ البطيني التجسيمي (i.c.v.) من "كوكتيل التحرير". المكونات الرئيسية هي النورامينيداز ، الذي يستهدف خلايا البطانة العصبية ويحفز تعرية جدار البطين ، وهو جسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، وعامل نمو الخلايا الليفية -2. في خطوة "التجميع" الثانية ، يتم إجراء الخزعات السائلة من السائل النخاعي من الصهريج الكبير ، في الفئران المخدرة دون الحاجة إلى شق.

تظهر النتائج المعروضة هنا أن الخلايا المعزولة تحتفظ بصورتها الذاتية وأن NSCs في المنطقة الاقتصادية الخاصة تحافظ على هدوءها. يقتصر تعرية طبقة البطانة العصبية على المستوى التشريحي للحقن ويتم تحمل البروتوكول (الإطلاق والتجميع) جيدا من قبل. يمهد هذا النهج الجديد الطريق لإجراء دراسات طولية لتكوين الخلايا العصبية الداخلية والتكون الدبقي في التجارب.

Introduction

الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة هي خلايا ملتزمة جزئيا يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع مجموعات الخلايا التي تشكل الأنسجة المعنية. بصرف النظر عن كونها متعددة القدرات ، فهي خلايا ذاتية التجديد وضرورية للحفاظ على التوازن والقدرة التجديدية للأنسجة1. تظل بعض الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة في حالة نشطة وتكاثرية قوية ، مثل الخلايا الجذعية المعوية أو المكونة للدم. البعض الآخر ، مثل الخلايا الجذعية في الدماغ ، لا يزال هادئا أو نائما إلى حد كبير2. في الدماغ البالغ ، يمكن العثور على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في مناطق متخصصة ، وغالبا ما تسمى المنافذ. توجد منطقتان موصوفتان جيدا في المنطقة تحت البطينية (SEZ) للبطينين الجانبيين وفي الت....

Protocol

تم إجراء إجراءات تربية وصيانتها وتجربتها وفقا لقانون في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 ، الذي أذنت به وزارة الداخلية ، والمرسوم الرئاسي 56/2013 للجمهورية اليونانية ، والذي تم فحصه من قبل هيئات رعاية والمراجعة الأخلاقية لجامعتي كامبريدج وباتراس ، وكذلك تمت الموافقة عليه وفحصه من قبل لجنة رعاية واستخدام المحلية في المحافظات (رقم البروتوكول: 5675/39/18-01-2021). تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley و Wistar و Long-Evans ، التي تتراوح أعمارها بين 2 و 4 أشهر وبأوزان جسم تتراوح بين 150 جم و 250 جم. يتم تلخيص البروتوكول بيانيا في الشكل 1.

1. الافراج عن إعداد كوكتيل

النتائج

الإفراج عن وجمع NSCs
يتم فصل NSCs من SEZ عن CSF فقط عن طريق الطبقة الأحادية من الخلايا العصبية ، وإن كانت لا تزال على اتصال مباشر مع محتوى البطين عن طريق إقحام العمليات أحادية الهدب 8,9. يعمل Neuraminidase بشكل خاص على خلايا البطانة العصبية عن طريق انشق?.......

Discussion

الخلايا الجذعية والسلفية متناثرة نسبيا في أنسجة المخ في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، توجد NSCs في مناطق يتعذر الوصول إليها لإجراء خزعات سهلة وآمنة (جدران البطين ، الحصين). لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة للعمل تجريبيا مع هذه الخلايا ، حتى الآن ، هي عزلها بعد الوفاة. يتم وصف طريقة تسمح بالجمع الفرد?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة Action Medical Research (المملكة المتحدة) (GN2291) إلى R.J.M.F. و I.K. كما تم دعم العمل البحثي جزئيا (تكاليف ودعم D.D) من قبل المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار (H.F.R.I.) في إطار "الدعوة الأولى لمشاريع أبحاث H.F.R.I. لدعم أعضاء هيئة التدريس والباحثين وشراء منحة معدات البحث عالية التكلفة" (رقم المشروع: 3395).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibodyBD Biosciences#555002purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)Sigma-Aldrich#N2876Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech#100-18Bkept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL SyringeHamilton#80330Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringesBD biosciences04085-0029 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30MLLAVIPHARM-CASTALIASKU: 5201048131168
BupaqRICHTERPHARMA1021854AF10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and MouseStoelting51500D
Homeothermic Monitoring SystemHarvard Apparatus55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquidVetpharma Animal Health32509/4031
KetamidorRICHTER PHARMASKU: 9004114002531Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, EthilonEthiconD9635Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical TrimmersStoeltingItem:51472
Scalpel blades, sterileSwann MortonAW050
Scopettes Jr.  8-inch SwabsBirchwood Laboratories34-7021-12P
Stereotaxic High Speed DrillForedom1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument KitStoeltingItem: 52189
Xylan 2%Chanelle Pharmaceuticals13764/03/19-5-2004Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopyGreiner#655866Screen star microplate
B27 supplementThermoFisher ScientificA1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)MerckP06-1391100Fraction V, heat shock
CitrateMerck71497Sodium citrate monobasic
CryostatLeicaCM1510S
DAPIMerck, Calbiochem28718-90-3Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEMThermoFisher Scientific11995065High glucose, pyruvate
donkey anti-goatBiotium20016 or 20106 or 20048Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouseBiotium20014 or 20105 or 20046Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbitBiotium20015 or 20098 or 20047Dilution: 1/1,000
EGFPeprotech315-09
FGF-2 (or bFGF)Peprotech100-18B
goat anti-GFAPAbcamab53554Dilution: 1/500
goat anti-SOX2Santa Cruz Biotecnologysc-17320Dilution: 1/200
mouse anti-ID3Santa Cruz Biotecnologysc-56712Dilution: 1/200
mouse anti-S100βSigmaS2532Dilution: 1/200
MowiolMerck, Calbiochem475904Mounting medium
N2 supplementThermoFisher Scientific17502048
ParafolmadehydeMerck158127
Poly-D-LysineMerck, MilliporeA-003-ESolution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)Abcamab18723Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRαAbcamab51875Dilution: 1/200
rabbit anti-β- cateninAbcamab16051Dilution: 1/500
Triton X-100MerckX100
Microscopy and image analysis
Confocal microscopeLeicaSP6 and SP8
Image analysisNIH, USAImageJ
Image analysisLeicaLasX

References

  1. Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
  2. Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem c....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved