살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

요약

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

초록

조직 특이적 신경 줄기 세포(NSC)는 포유류의 출생 후 뇌에서 활성 상태를 유지합니다. 그들은 새로운 뉴런과 신경교세포를 생성하는 특수한 틈새에 상주합니다. 그러한 틈새 중 하나는 뇌실막하 영역(SEZ, 심실-심실하 영역이라고도 함)으로, 뇌실막 세포층에 인접한 외측 심실의 측벽을 가로질러 위치합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 풍부하게 분포되어 있으며, 희소돌기아교세포를 생성할 수 있는 증식성 전구세포 풀을 구성합니다.

NSC와 OPC 모두 자체 갱신 잠재력과 정지/활성화 주기를 나타냅니다. 위치로 인해 이러한 세포의 분리 및 실험 조사는 사후에 수행됩니다. 여기에서는 살아있는 동물에서 다른 세포 중에서도 NSC 및 OPC를 분리하는 방법인 "뇌 착유"에 대해 자세히 설명합니다. 이것은 설치류에 사용하도록 설계되고 쥐에서 테스트된 2단계 프로토콜입니다. 첫째, 세포는 "방출 칵테일"의 입체적 뇌내 뇌실(i.c.v.) 주입을 통해 조직에서 "방출"됩니다. 주성분은 뇌실막세포를 표적으로 하여 심실벽 침상을 유도하는 뉴라미니다아제, 인테그린-β1 차단 항체, 섬유아세포 성장인자-2입니다. 두 번째 "수집" 단계에서, 뇌척수액의 액체 생검은 절개 없이 마취된 쥐에서 수조 마그나(cisterna magna)에서 수행됩니다.

여기에 제시된 결과는 분리된 세포가 내인성 프로파일을 유지하고 SEZ의 NSC가 정지를 유지한다는 것을 보여줍니다. 뇌실막층의 퇴색은 주입의 해부학적 수준으로 제한되며 프로토콜(방출 및 수집)은 동물에 의해 잘 견뎌집니다. 이 새로운 접근법은 실험 동물의 내인성 신경 발생 및 신경 형성에 대한 종단 연구를 수행하기 위한 길을 열어줍니다.

서문

조직 특이적 줄기세포는 각 조직을 구성하는 모든 세포 집단을 생성할 수 있는 부분적으로 커밋된 세포입니다. 다능성 외에도 자가 재생 세포이며 조직의 항상성과 재생 능력을 유지하는 데 중요합니다¹. 일부 조직 특이적 줄기세포는 장 또는 조혈모세포와 같이 활성화되고 강하게 증식하는 상태로 남아 있습니다. 뇌 줄기세포와 같은 다른 세포들은 대부분 정지 상태이거나 휴면 상태로 남아 있다². 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포(NSC)는 종종 틈새라고 불리는 특수 영역에서 발견될 수 있습니다. 이렇게 잘 기술된 두 개의 영역은 외측 심실의 뇌막하 영역(SEZ)과 해마의 치상이랑에 존재합니다. SEZ 틈새는 가장 많은 수의 세포를 생성하며, 주로 후각 전구로 이동하여 지역 인터뉴런 개체군에 기여하는 신경아세포를 생성합니다. 대조적으로, 생성된 희소돌기아세포는 인접한 뇌량(corpus callosum, CC)³으로 이동합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 널리 분포하는 유사분열 활성 세포로, i) 희소돌기아교세포에 전념하고, ii) 탈수초화 부위로 이동할 수 있으며, iii) 수초성 희소돌기아교세포로 분화할 수 있습니다. OPC는 또한 자체 재생 잠재력과 정....

프로토콜

동물 사육, 유지 관리 및 실험 절차는 영국 내무부가 승인한 1986년 영국 동물(과학적 절차)법과 그리스 공화국 대통령령 56/2013에 따라 수행되었으며, 케임브리지 및 파트라스 대학의 동물 복지 및 윤리 검토 기관에서 면밀히 조사하고, 지역 현 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호: 5675/39/18-01-2021). 수컷과 암컷 Sprague-Dawley, Wistar 및 Long-Evans 쥐를 사용했으며, 연령은 2개월에서 4개월 사이이고 체중은 150g에서 250g 사이였습니다. 프로토콜은 그림 1에 그래픽으로 요약되어 있습니다.

1. 칵테일 준비 해제

알림: 시술 당일에 신선하게 준비하고 얼음에 보관하십시오. 양은 각 외측 심실에 주입하기 위해 2μL당 제공됩니다. 의도한 주사당 추가로 1μL를 준비합니다.

1. 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium welchii)에서 0.5μL의 500mU 뉴라미니다아제를 준비합니다.
   참고: -20°C의 멸균수에 희석한 1U/μL 육수로 보관하십시오. 다른 유형의 뉴라미니다아제는 테스트되지 않았....

토론

줄기세포와 전구세포는 포유류의 뇌 조직에서 상대적으로 드물다. 또한 NSC는 쉽고 안전한 생검을 위해 접근할 수 없는 영역(심실 벽, 해마)에 위치합니다. 그러므로, 지금까지 그러한 세포들을 실험적으로 다루는 유일한 방법은 사후 분리였다. 살아있는 쥐로부터 NSC와 OPC를 단일 또는 반복적으로 채취할 수 있는 방법(착유라고 함)이 여기에 단계별로 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 가지 주요 특.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX