살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

요약

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

초록

조직 특이적 신경 줄기 세포(NSC)는 포유류의 출생 후 뇌에서 활성 상태를 유지합니다. 그들은 새로운 뉴런과 신경교세포를 생성하는 특수한 틈새에 상주합니다. 그러한 틈새 중 하나는 뇌실막하 영역(SEZ, 심실-심실하 영역이라고도 함)으로, 뇌실막 세포층에 인접한 외측 심실의 측벽을 가로질러 위치합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 풍부하게 분포되어 있으며, 희소돌기아교세포를 생성할 수 있는 증식성 전구세포 풀을 구성합니다.

NSC와 OPC 모두 자체 갱신 잠재력과 정지/활성화 주기를 나타냅니다. 위치로 인해 이러한 세포의 분리 및 실험 조사는 사후에 수행됩니다. 여기에서는 살아있는 동물에서 다른 세포 중에서도 NSC 및 OPC를 분리하는 방법인 "뇌 착유"에 대해 자세히 설명합니다. 이것은 설치류에 사용하도록 설계되고 쥐에서 테스트된 2단계 프로토콜입니다. 첫째, 세포는 "방출 칵테일"의 입체적 뇌내 뇌실(i.c.v.) 주입을 통해 조직에서 "방출"됩니다. 주성분은 뇌실막세포를 표적으로 하여 심실벽 침상을 유도하는 뉴라미니다아제, 인테그린-β1 차단 항체, 섬유아세포 성장인자-2입니다. 두 번째 "수집" 단계에서, 뇌척수액의 액체 생검은 절개 없이 마취된 쥐에서 수조 마그나(cisterna magna)에서 수행됩니다.

여기에 제시된 결과는 분리된 세포가 내인성 프로파일을 유지하고 SEZ의 NSC가 정지를 유지한다는 것을 보여줍니다. 뇌실막층의 퇴색은 주입의 해부학적 수준으로 제한되며 프로토콜(방출 및 수집)은 동물에 의해 잘 견뎌집니다. 이 새로운 접근법은 실험 동물의 내인성 신경 발생 및 신경 형성에 대한 종단 연구를 수행하기 위한 길을 열어줍니다.

서문

조직 특이적 줄기세포는 각 조직을 구성하는 모든 세포 집단을 생성할 수 있는 부분적으로 커밋된 세포입니다. 다능성 외에도 자가 재생 세포이며 조직의 항상성과 재생 능력을 유지하는 데 중요합니다¹. 일부 조직 특이적 줄기세포는 장 또는 조혈모세포와 같이 활성화되고 강하게 증식하는 상태로 남아 있습니다. 뇌 줄기세포와 같은 다른 세포들은 대부분 정지 상태이거나 휴면 상태로 남아 있다². 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포(NSC)는 종종 틈새라고 불리는 특수 영역에서 발견될 수 있습니다. 이렇게 잘 기술된 두 개의 영역은 외측 심실의 뇌막하 영역(SEZ)과 해마의 치상이랑에 존재합니다. SEZ 틈새는 가장 많은 수의 세포를 생성하며, 주로 후각 전구로 이동하여 지역 인터뉴런 개체군에 기여하는 신경아세포를 생성합니다. 대조적으로, 생성된 희소돌기아세포는 인접한 뇌량(corpus callosum, CC)³으로 이동합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 널리 분포하는 유사분열 활성 세포로, i) 희소돌기아교세포에 전념하고, ii) 탈수초화 부위로 이동할 수 있으며, iii) 수초성 희소돌기아교세포로 분화할 수 있습니다. OPC는 또한 자체 재생 잠재력과 정지^{4를 나타낸다}.

지금까지 NSC와 OPC의 분리 및 연구는 절개된 뇌와 척수 조직의 사후 해리가 필요했습니다. 이러한 실험적 한계를 피하기 위해 우리는 처음으로 살아있는 동물에서 뇌 NSC와 OPC를 분리할 수 있는 방법을 확립했습니다. 우리는 이 방법을 "착유"라고 부르는데, 이는 세포의 풀이 고갈되지 않기 때문에 세포를 여러 번 수집할 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜은 뇌 크기가 크기 때문에 쥐를 대상으로 개발되었으며 주로 SEZ 또는 CC를 대상으로 하며 두 가지 주요 단계를 포함합니다. 먼저, NSC 또는 OPC는 심실 벽 침상을 유도하는 독소인 뉴라미니다아제, 인테그린-β1 차단 항체 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하는 "방출 칵테일"의 i.c.v. 주입을 통해 조직에서 "제거"됩니다. 칵테일은 측심실 내에서 양측으로 입체적으로 주입됩니다. 의도된 용도가 NSC의 격리인 경우 외측 심실의 로스트랄 영역이 표적이 됩니다. OPC를 보다 순수하게 분리하는 것이 목표인 경우 칵테일은 해마 핌브리아(hippocampal fimbria) 영역에 꼬리 방향으로 주입됩니다. 두 번째 "수집" 단계에서는 절개 없이 마취된 쥐의 수조 마그나에서 뇌척수액(CSF)의 액체 생검을 수행합니다. 액체 생검은 NSC 배양 배지와 혼합되며 도금될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.

프로토콜

동물 사육, 유지 관리 및 실험 절차는 영국 내무부가 승인한 1986년 영국 동물(과학적 절차)법과 그리스 공화국 대통령령 56/2013에 따라 수행되었으며, 케임브리지 및 파트라스 대학의 동물 복지 및 윤리 검토 기관에서 면밀히 조사하고, 지역 현 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호: 5675/39/18-01-2021). 수컷과 암컷 Sprague-Dawley, Wistar 및 Long-Evans 쥐를 사용했으며, 연령은 2개월에서 4개월 사이이고 체중은 150g에서 250g 사이였습니다. 프로토콜은 그림 1에 그래픽으로 요약되어 있습니다.

1. 칵테일 준비 해제

알림: 시술 당일에 신선하게 준비하고 얼음에 보관하십시오. 양은 각 외측 심실에 주입하기 위해 2μL당 제공됩니다. 의도한 주사당 추가로 1μL를 준비합니다.

1. 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium welchii)에서 0.5μL의 500mU 뉴라미니다아제를 준비합니다.
   참고: -20°C의 멸균수에 희석한 1U/μL 육수로 보관하십시오. 다른 유형의 뉴라미니다아제는 테스트되지 않았습니다.
2. 인테그린-β1 차단 항체 1μg을 포함하는 1μL를 준비합니다.
   알림: 4 °C에서 보관하십시오.
3. 염기성 섬유아세포 성장인자 0.5μg(재조합 인간 FGF-염기성)을 함유한 0.5μL를 제조한다.
   참고: -20°C의 멸균수에 희석한 1μg/μL 스톡으로 보관하십시오.

2. 방출 칵테일 주입

알림: 전체 프로세스는 20분 이내에 수행할 수 있습니다. 무균 상태에서 수술을 수행하도록 주의하십시오. 방부제(예: 3% 또는 6% 과산화수소)로 모든 표면을 청소하십시오. 고압멸균 또는 쉽게 멸균할 수 있는 도구, 장갑, 가운 및 커튼을 사용하십시오.

1. 이소플루란 흡입(유도 2.5%, 유지 2%)으로 실험 동물을 마취합니다. 각막 반사, 자극에 대한 반응 (뒷다리와 꼬리 꼬집기 테스트), 호흡 모드를 확인하여 마취 깊이를 확인합니다.
   참고: 수술 절차는 복강 내 주사 가능한 마취(예: 케타민[40mg/kg] 및 자일라진[10mg/kg])에 의해 유도된 전신 마취 하에 수행할 수 있습니다. 각막 반사, 자극에 대한 반응 (뒷다리와 꼬리 꼬집기 테스트), 호흡 모드를 확인하여 심부 마취를 확인했습니다.
2. 마취 유도 시 진통을 피하(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀)로 투여합니다.
3. 입체 프레임에 쥐를 장착하십시오.
4. 면도기로 머리털을 면도하고 10% 포비돈 요오드 용액과 알코올과 같은 소독약으로 피부를 청소합니다. 멸균 면봉을 사용하여 소독제를 세 번 바릅니다. 매번 3-5초 동안 원을 그리며 문지릅니다. 건조함을 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
5. 멸균 메스를 사용하여 중간 선을 따라 머리 피부를 2cm 절개합니다.
6. 멸균 면봉과 멸균 식염수를 사용하여 두개골을 꼼꼼하게 청소합니다.
7. 입체 장치에 장착된 10μL Hamilton 주사기의 바늘 가장자리를 사용하여 브레그마를 식별합니다. 브레그마를 "point 0,0"으로 설정합니다.
   참고: 브레그마는 시상과 관상 봉합사 사이의 교차점으로 식별됩니다. 자세한 내용은 Paxinos 및 Watson⁵의 쥐 뇌 지도에서 찾을 수 있습니다.
8. 장치를 전후(AP) = 0.3mm, 측면(L) = +1.2mm(SEZ 대상) 또는 AP = 1.5mm, L = +2.0mm(CC 대상) 좌표로 이동합니다.
9. 치과용 드릴을 사용하여 1mm 버 구멍을 뚫습니다.
   알림: 손으로 드릴링할 때 피질 표면이 손상되지 않도록 주의하십시오. 출혈은 크지 않을 것으로 예상된다. 식염수로 혈액을 맑게 하고 더 지속적인 출혈을 막기 위해 압력을 가합니다.
10. 10μL Hamilton 주사기에 방출 칵테일 4μL를 로드합니다.
11. 경막과 접촉하기 위해 Hamilton 주사기의 바늘(가급적이면 뭉툭하거나 원뿔형 가장자리)을 내립니다.
12. 원하는 깊이(D = 3.5mm)에 바늘을 삽입합니다.
    알림: 조직을 수분으로 유지하기 위해 경막 표면에 식염수를 붓습니다.
13. 방출 칵테일 2μL를 1μL/분의 속도로 주입합니다.
14. 릴리스 칵테일이 표면화되지 않도록 천천히 회수하기 전에 바늘을 2분 더 제자리에 두십시오.
15. 좌표 AP = 0.3mm, L = -1.2mm(SEZ 대상) 또는 AP = 1.5mm, L = -2.0mm(CC 대상)에서 다른 반구에 대해 2.8-2.14단계를 반복합니다.
16. 절개 부위를 5-0 나일론(직경 0.1mm)으로 봉합하고 봉합 부위를 소독제로 청소합니다.
17. 마취제를 공급하는 마스크를 제거하고 동물을 수술 후 모니터링 구역으로 옮깁니다.
    알림: 마취 회복 및 누운 자세 유지는 5-10분 이내에 이루어져야 하며 완전한 회복(정상 행동)은 25분 이내에 이루어져야 합니다.
    1. 기도를 막을 수 있는 작은 입자 침구가 없는 잘 가열된(24-25°C) 조용한 공간에서 회복(생생하고 중단 없는 움직임, 빈번한 물 접근)을 면밀히 모니터링하십시오. 완전히 회복된 것을 확인한 후에만 동물을 케이지 동료(새 동물이 아님)와 함께 돌려보내십시오.
    2. 수술 후 최소 48시간 동안 유지 관리 시설에서 동물을 모니터링하십시오. 진통제(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀, 피하)를 투여하여 통증 징후(머리 숨기기, 비정상적인 머리 또는 몸 자세, 과민증 및 취급 과흥분)를 해결합니다. 털이 변색되거나 발기된 동물은 담당 수의사에게 의뢰하십시오.

3. 뇌척수액(CSF) 액체 생검

알림: 전체 프로세스는 10분 이내에 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 액체 생검은 방출 칵테일 주입 후 3일 후에 수행되지만 필요할 때마다 정확히 동일한 방식으로 수행할 수 있습니다. 무균 상태에서 수술을 수행하도록 주의하십시오. 방부제(예: 3% 또는 6% 과산화수소)로 모든 표면을 청소하십시오. 고압멸균 또는 쉽게 멸균할 수 있는 도구, 장갑, 가운 및 커튼을 사용하십시오.

1. 이소플루란 흡입(유도 2.5%, 유지 2%)으로 동물을 마취합니다. 각막을 확인하여 마취 깊이 확인
   반사, 자극에 대한 반응(뒷다리 및 꼬리 꼬집기 테스트) 및 호흡 모드.
   참고: 수술 절차는 복강 내 주사 가능한 마취(예: 케타민[40mg/kg] 및 자일라진[10mg/kg])에 의해 유도된 전신 마취 하에 수행할 수 있습니다. 그러나 절차가 짧기 때문에, 특히 생검이 연속적으로 여러 번 수행되는 경우에는 권장하지 않습니다.
2. 마취 유도 시 진통을 피하(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀)로 투여합니다.
3. 실험용 동물을 입체 프레임에 장착합니다. 이어 바를 사용하여 앞뒤로 회전하는 움직임을 방해하지 않고 머리를 고정하십시오.
4. 목 뒤쪽이 잘 확장될 수 있도록 머리를 아래쪽 40° 각도로 고정합니다.
   알림: 이를 수행하는 한 가지 방법은 장치⁶의 마우스 바를 사용하는 것입니다.
5. 면도기를 사용하여 목 부분의 털을 면도하고 10% 포비돈 요오드 용액과 알코올과 같은 소독제로 피부를 청소합니다. 멸균 면봉을 사용하여 소독제를 세 번 바릅니다. 매번 3-5초 동안 원을 그리며 문지릅니다.
6. 손가락 끝으로 아틀라스⁶의 후두부 돌기와 척추 사이에 위치한 마름모꼴 모양의 함몰 부위를 찾습니다.
7. 포인트 마크를 그립니다(예: 마커 사용).
8. 1mL 또는 0.5mL 주사기를 입체 프레임에 고정합니다.
   알림: 분리할 수 없는 바늘이 있는 주사기는 흡입력이 더 좋고 데드 볼륨이 적기 때문에 사용하는 것이 좋습니다.
9. 피부와 접촉하는 지점의 지점에 바늘을 가져옵니다.
10. 한 쌍의 집게를 사용하여 피부층을 통해 주사기를 내리면서 피부를 들어 올립니다.
11. 플런저를 약간 회수하여 주사기에 음압을 생성합니다.
12. 주사기에 액체(CSF)가 나타날 때까지 바늘을 매우 천천히 담그려면 다시 시작합니다.
13. 이 위치에 바늘을 고정하고 CSF의 느린 흐름을 허용합니다.
    알림: CSF 흐름이 매우 느린 경우 바늘을 약간 내리거나 올릴 수 있습니다.
14. 뇌척수액을 천천히(40μL/분 단위로) 최대 120μL까지 제거하기 시작합니다.
15. 주사기를 천천히 회수합니다.
16. 복강내로 1mL의 정상 혈청을 투여하여 실험 동물의 체액 보충을 지원합니다.
17. 액체 생검(CSF)을 400μL의 NSC 배지와 혼합하고 더 사용할 때까지 마이크로 원심분리기 튜브를 4°C로 유지합니다.
    알림: 액체 생검은 냉동되지 않은 경우 3시간 이내에 처리해야 합니다.
18. 마취제를 공급하는 마스크를 제거하고 동물을 수술 후 모니터링 구역으로 옮깁니다.
    알림: 마취 회복 및 누운 자세 유지는 5-10분 이내에 이루어져야 하며 완전한 회복(정상 행동)은 25분 이내에 이루어져야 합니다.
    1. 기도를 막을 수 있는 작은 입자 침구가 없는 잘 가열된(24-25°C) 조용한 공간에서 회복(생생하고 중단 없는 움직임, 빈번한 물 접근)을 면밀히 모니터링하십시오. 완전히 회복된 것이 확인된 후에만 동물을 케이지 동료에게 돌려보내십시오(새로운 동물이 아님).
    2. 수술 후 최소 48시간 동안 유지 관리 시설에서 동물을 모니터링하십시오. 통증의 징후(머리 숨기기, 비정상적인 머리 또는 몸의 자세, 과민증 및 취급에 대한 과흥분)가 관찰되면 진통제(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀 피하)를 투여합니다. 털이 변색되거나 발기된 동물은 담당 수의사에게 의뢰하십시오.

4. 면역형광을 위한 조직의 가공

1. 얼음처럼 차가운 식염수 20mL를 심장내 주입한 후, 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA; pH = 7.4의 인산염 완충 식염수[PBS] 중) 50mL를 넣어 동물을 안락사시킨다.
2. 뇌 조직을 해부합니다.
   1. 가위를 사용하여 머리와 몸통을 분리하여 자궁 경부 부위를 자릅니다. 가위를 사용하여 피부를 제거한 다음 뇌 조직을 손상시키지 않도록 가위 끝이 위쪽을 향하도록 하여 시상 정중선을 따라 두개골의 뼈를 자릅니다. 코로나 정중선을 통과하여 가능한 한 많이 절단하는 것을 목표로하십시오.
   2. 겸자를 사용하여 후두상골과 두정골에서 시작하여 마지막으로 전두골까지 뼈를 제거합니다.
   3. 뇌 조직이 드러나면 집게나 주걱을 사용하여 두개골 밖으로 들어 올립니다. 이를 촉진하기 위해, 원하지 않는다면 뇌 기저부의 신경과 후각구를 절단한다.
3. 4 °C에서 2 % PFA로 밤새 조직을 고정 한 후
4. 조직이 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 최소 48시간 동안 30% 자당(PBS)으로 조직을 냉동 보호합니다.
5. -80 °C에서 조직을 얼립니다.
6. 저온 유지 장치로 뇌 조직을 14μm 두께의 관상 절편으로 자릅니다.
7. 표준 프로토콜 ^3,7을 사용하여 면역형광 염색 수행
   1. 차단 완충액(3% 소 혈청 알부민[BSA], 0.1% Triton X-100, PBS)으로 절편을 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   2. 항원 회수를 수행합니다(유리병 사용, 10mM 구연산염 완충액, pH = 6.0에서 15분 동안 끓임).
      참고: 이 단계는 선택 사항이지만 핵 항원에 필요합니다.
   3. 실온으로 가져와 4°C에서 밤새 차단 완충액에 신경교세포섬유산성단백질(GFAP), 더블코르틴(Dcx), S100β 및 β-카테닌( 재료 표 참조)에 대한 1차 항체와 함께 배양합니다.
   4. 실온에서 핵 대조염색을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이 있는 PBS의 2차 항체로 2시간 동안 배양합니다( 재료 표 참조).
   5. 커버슬립을 장착합니다.

5. 면역형광을 위한 분리된 세포 처리

1. poly-D-lysine(100μg/mL)으로 코팅된 현미경 검사에 적합한 96웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다.
2. 셀을 얼음처럼 차가운 2% PFA에 10분 동안 고정하고 PBS로 3번 세척합니다.
3. PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 및 ID3에 대한 표준 절차 ^3,7을 사용하여 면역형광을 수행합니다(재료 표 참조).
4. 어둠 속에서 3 °C에서 PBS + NaN 0.1 (_0.1 %)의 세포를 유지하십시오.

6. 현미경 및 이미지 분석

1. 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하고 세포 계수기와 같은 표준 이미지 분석 소프트웨어 도구를 사용하여 세포 계수를 수행합니다.

결과

NSC 공개 및 수집
경제특구의 NSC는 뇌실막세포의 단층에 의해서만 뇌척수액에서 분리되지만, 삽입된 단섬모돌기(intercalating mono-ciliated process) ^8,9를 통해 심실 내용물과 직접 접촉한다. 뉴라미니다아제는 시알산 잔기의 절단을 통해 뇌실막 세포에 특이적으로 작용하며 심실 벽의 탈피를 유도할 수 있습니다. 이것은 심실 표면?...

토론

줄기세포와 전구세포는 포유류의 뇌 조직에서 상대적으로 드물다. 또한 NSC는 쉽고 안전한 생검을 위해 접근할 수 없는 영역(심실 벽, 해마)에 위치합니다. 그러므로, 지금까지 그러한 세포들을 실험적으로 다루는 유일한 방법은 사후 분리였다. 살아있는 쥐로부터 NSC와 OPC를 단일 또는 반복적으로 채취할 수 있는 방법(착유라고 함)이 여기에 단계별로 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 가지 주요 특...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX