生きたラットからの神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離のための「脳搾乳」法

要約

ここでは、生きたラットの脳から神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離する方法について、実験的に詳細に紹介します。これにより、健康を損なうことなく、同じ動物からこれらの細胞を複数回収集できます。

要約

組織特異的神経幹細胞(NSC)は、哺乳類の出生後の脳で活性を保ちます。それらは特殊なニッチに存在し、そこで新しいニューロンとグリアを生成します。そのようなニッチの1つは、上衣下細胞層に隣接する側脳室の側壁を横切って位置する上衣下ゾーン(SEZ;心室-脳室下ゾーンとも呼ばれます)です。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、中枢神経系全体に豊富に分布しており、オリゴデンドロサイトを生成できる増殖性前駆細胞のプールを構成しています。

NSCとOPCはどちらも自己複製の可能性と静止/活性化サイクルを示します。それらの位置のために、これらの細胞の分離と実験的調査は死後に行われます。ここでは、生きた動物からNSCやOPCなどの細胞を単離する方法である「ブレインミルキング」について詳しく説明します。これは、げっ歯類で使用するために設計され、ラットでテストされた2段階のプロトコルです。まず、細胞は「放出カクテル」の脳室定位固定管内(i.c.v.)注射 によって 組織から「放出」されます。主成分は、上衣細胞を標的とし、心室壁の剥離を誘導するノイラミニダーゼ、インテグリン-β1阻害抗体、線維芽細胞増殖因子-2です。第2の「採取」ステップでは、大槽から大脳槽から、切開を必要とせずに麻酔ラットで脳脊髄液のリキッドバイオプシーが実施される。

ここで示した結果は、単離された細胞が内因性プロファイルを保持し、SEZのNSCが静止状態を保持していることを示しています。上衣層の剥離は注射の解剖学的レベルに制限され、プロトコル(放出と収集)は動物によってよく許容されます。この新しいアプローチは、実験動物における内因性神経新生と神経膠新生の縦断的研究への道を開きます。

概要

組織特異的幹細胞は、それぞれの組織を構成するすべての細胞集団を生じさせることができる部分的にコミットされた細胞です。多能性であることは別として、それらは自己複製細胞であり、組織の恒常性と再生能力を維持するために重要です¹。腸幹細胞や造血幹細胞など、一部の組織特異的幹細胞は活発で強い増殖状態にとどまります。また、脳幹細胞などは、大部分が静止状態または休^眠状態のままです2。成人の脳では、神経幹細胞(NSC)は、しばしばニッチと呼ばれる特殊な領域に見られます。そのような2つのよく記述された領域は、側脳室の上衣下ゾーン(SEZ)と海馬の歯状回に存在します。SEZニッチは、嗅球に向かって移動し、局所的な介在ニューロン集団に寄与する神経芽細胞を中心に、最も多くの細胞を生成します。対照的に、生成された乏突起芽細胞は隣接する脳梁(CC)³に移動する。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、中枢神経系全体に広く分布する有糸分裂活性細胞であり、i)オリゴデンドログリア系統に関与し、ii)脱髄部位に遊走でき、iii)有髄化オリゴデンドロサイトに分化することができます。OPCは、自己複製の可能性と^{静止状態4}も示します。

これまで、神経幹細胞とOPCの単離と研究には、解剖した脳と脊髄組織の死後解離が必要でした。....

プロトコル

動物の飼育、維持、実験は、内務省の認可を受けた1986年英国動物(科学的手順)法、およびギリシャ共和国の大統領令56/2013に従って実施され、ケンブリッジ大学とパトラス大学の動物福祉および倫理審査機関によって精査され、地元の県動物管理委員会(プロトコル番号: 5675/39/18-01-2021)。 Sprague-Dawley、Wistar、Long-Evansラットの雄と雌のラットを使用し、月齢は2〜4か月で、体重は150g〜250gでした。プロトコルを 図1にグラフでまとめます。

1.カクテルの準備を解放します

注意: 施術当日に新鮮なものを準備し、氷の上に保管してください。量は、各側脳室に i.c.v を注入する 2 μL あたりに与えられます。目的の注入ごとに追加の 1 μL を調製します。

1. クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium welchii)由来の500 mUノイラミニダーゼ0.5 μLを調製します。
   注:-20°Cの滅菌水で希釈した1 U/μLストックとして保管してください。 他のタイプのノイラミニダーゼはテストされていません。.
2. インテグリン-β1ブロッキング抗体1 μgを含む1 μLを調製します。
   ....

ディスカッション

幹細胞と前駆細胞は、哺乳類の脳組織では比較的まばらです。さらに、神経幹細胞は、簡単で安全な生検のためにアクセスできない領域(心室壁、海馬)にあります。したがって、これまでのところ、そのような細胞を実験的に扱う唯一の方法は、死後の分離でした。ここでは、生きたラットからNSCおよびOPCを単回または反復して採取する方法(搾乳)について、段階的に説明します。この方法は.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX