生きたラットからの神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離のための「脳搾乳」法

要約

ここでは、生きたラットの脳から神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離する方法について、実験的に詳細に紹介します。これにより、健康を損なうことなく、同じ動物からこれらの細胞を複数回収集できます。

要約

組織特異的神経幹細胞(NSC)は、哺乳類の出生後の脳で活性を保ちます。それらは特殊なニッチに存在し、そこで新しいニューロンとグリアを生成します。そのようなニッチの1つは、上衣下細胞層に隣接する側脳室の側壁を横切って位置する上衣下ゾーン(SEZ;心室-脳室下ゾーンとも呼ばれます)です。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、中枢神経系全体に豊富に分布しており、オリゴデンドロサイトを生成できる増殖性前駆細胞のプールを構成しています。

NSCとOPCはどちらも自己複製の可能性と静止/活性化サイクルを示します。それらの位置のために、これらの細胞の分離と実験的調査は死後に行われます。ここでは、生きた動物からNSCやOPCなどの細胞を単離する方法である「ブレインミルキング」について詳しく説明します。これは、げっ歯類で使用するために設計され、ラットでテストされた2段階のプロトコルです。まず、細胞は「放出カクテル」の脳室定位固定管内(i.c.v.)注射 によって 組織から「放出」されます。主成分は、上衣細胞を標的とし、心室壁の剥離を誘導するノイラミニダーゼ、インテグリン-β1阻害抗体、線維芽細胞増殖因子-2です。第2の「採取」ステップでは、大槽から大脳槽から、切開を必要とせずに麻酔ラットで脳脊髄液のリキッドバイオプシーが実施される。

ここで示した結果は、単離された細胞が内因性プロファイルを保持し、SEZのNSCが静止状態を保持していることを示しています。上衣層の剥離は注射の解剖学的レベルに制限され、プロトコル(放出と収集)は動物によってよく許容されます。この新しいアプローチは、実験動物における内因性神経新生と神経膠新生の縦断的研究への道を開きます。

概要

組織特異的幹細胞は、それぞれの組織を構成するすべての細胞集団を生じさせることができる部分的にコミットされた細胞です。多能性であることは別として、それらは自己複製細胞であり、組織の恒常性と再生能力を維持するために重要です¹。腸幹細胞や造血幹細胞など、一部の組織特異的幹細胞は活発で強い増殖状態にとどまります。また、脳幹細胞などは、大部分が静止状態または休^眠状態のままです2。成人の脳では、神経幹細胞(NSC)は、しばしばニッチと呼ばれる特殊な領域に見られます。そのような2つのよく記述された領域は、側脳室の上衣下ゾーン(SEZ)と海馬の歯状回に存在します。SEZニッチは、嗅球に向かって移動し、局所的な介在ニューロン集団に寄与する神経芽細胞を中心に、最も多くの細胞を生成します。対照的に、生成された乏突起芽細胞は隣接する脳梁(CC)³に移動する。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、中枢神経系全体に広く分布する有糸分裂活性細胞であり、i)オリゴデンドログリア系統に関与し、ii)脱髄部位に遊走でき、iii)有髄化オリゴデンドロサイトに分化することができます。OPCは、自己複製の可能性と^{静止状態4}も示します。

これまで、神経幹細胞とOPCの単離と研究には、解剖した脳と脊髄組織の死後解離が必要でした。この実験上の制約を回避するため、生きた動物から脳のNSCやOPCを単離できる手法を世界で初めて確立しました。この方法を「搾乳」と呼ぶのは、プールが枯渇しないため、複数の細胞の収集が可能になるからです。このプロトコルは、脳のサイズが大きいラットで開発され、主に経済特区またはCCを標的とし、2つの主要なステップが含まれています。まず、神経幹細胞またはOPCは、心室壁の剥離を誘導する毒素であるノイラミニダーゼ、インテグリン-β1阻害抗体、および線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む「放出カクテル」のi.c.v.注射 によって 組織から「除去」されます。カクテルは、側脳室内に両側で定位的に注射されます。使用目的が神経幹細胞の単離である場合、側脳室の吻側領域が標的となります。OPCをより純粋に分離することが目的である場合、カクテルは海馬線維の領域に尾側に注入されます。第2の「採取」ステップでは、脳脊髄液(CSF)のリキッドバイオプシーが、切開を必要とせずに麻酔ラットの槽マグナから行われます。リキッドバイオプシーはNSC培養培地と混合され、プレーティングまで4°Cに保つことができます。

プロトコル

動物の飼育、維持、実験は、内務省の認可を受けた1986年英国動物(科学的手順)法、およびギリシャ共和国の大統領令56/2013に従って実施され、ケンブリッジ大学とパトラス大学の動物福祉および倫理審査機関によって精査され、地元の県動物管理委員会(プロトコル番号: 5675/39/18-01-2021)。 Sprague-Dawley、Wistar、Long-Evansラットの雄と雌のラットを使用し、月齢は2〜4か月で、体重は150g〜250gでした。プロトコルを 図1にグラフでまとめます。

1.カクテルの準備を解放します

注意: 施術当日に新鮮なものを準備し、氷の上に保管してください。量は、各側脳室に i.c.v を注入する 2 μL あたりに与えられます。目的の注入ごとに追加の 1 μL を調製します。

1. クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium welchii)由来の500 mUノイラミニダーゼ0.5 μLを調製します。
   注:-20°Cの滅菌水で希釈した1 U/μLストックとして保管してください。 他のタイプのノイラミニダーゼはテストされていません。.
2. インテグリン-β1ブロッキング抗体1 μgを含む1 μLを調製します。
   注意: 4°Cで保管してください。
3. 塩基性線維芽細胞増殖因子(組換えヒトFGF-塩基性)0.5μgを含む0.5μLを調製する。
   注:-20°Cの滅菌水で希釈した1 μg/μLのストックとして保存してください。

2.リリースカクテルの注入

注:プロセス全体は20分以内に実行できます。無菌状態で手術を行うように注意してください。すべての表面を消毒剤(3%または6%の過酸化水素など)で清掃します。オートクレーブ滅菌または滅菌しやすい道具、手袋、ガウン、ドレープを使用してください。

1. イソフルラン吸入により実験動物に麻酔をかける(誘導に2.5%、維持に2%)。角膜反射、刺激に対する反応(後肢・尾挟みテスト)、呼吸様式などを確認し、麻酔の深さを確認します。
   注:外科的処置は、腹腔内注射麻酔によって誘発される全身麻酔下で実行できます(例:.、ケタミン[40 mg / kg]およびキシラジン[10 mg / kg])。深部麻酔は、角膜反射、刺激に対する反応(後肢・尾挟みテスト)、呼吸様式を確認した。
2. 麻酔導入時に鎮痛剤を皮下投与します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン)。.
3. ラットを脳定位固定装置フレームに取り付けます。
4. カミソリで頭の毛皮を剃り、10%ポビドンヨード溶液とアルコールなどの消毒剤で皮膚をきれいにします。滅菌綿棒を使用して消毒剤を3回塗布します。毎回3〜5秒間円を描くようにこすります。乾燥を防ぐために眼軟膏を塗ります。
5. 滅菌メスを使用して、中央線に沿って頭の皮膚を2cm切開します。
6. 滅菌綿棒と滅菌生理食塩水を使用して頭蓋骨を細心の注意を払って取り除きます。
7. 脳定位固定装置に装着された10μLのハミルトンシリンジの針の端を使用してブレグマを特定します。ブレグマを「点0,0」として設定します。
   注:ブレグマは、矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点として識別されます。詳細については、PaxinosとWatson⁵のラット脳アトラスを参照してください。
8. デバイスを前後 (AP) = 0.3 mm、横方向 (L) = +1.2 mm (SEZ をターゲットにする場合)、または AP = 1.5 mm、L = +2.0 mm (CC をターゲットにする場合) の座標に移動します。
9. 歯科用ドリルを使用して1mmのバリ穴を開けます。
   注意: 手で穴を開ける場合は、皮質表面を傷つけないように注意してください。出血は大したものではないと予想されます。生理食塩水で血液を取り除き、圧力をかけて出血を止めます。
10. 10 μLのハミルトンシリンジに4 μLのリリースカクテルをロードします。
11. 硬膜に接触させるために、ハミルトンシリンジの針(できれば鈍いまたは円錐形のエッジ)を下げます。
12. 針を希望の深さ(D = 3.5 mm)に挿入します。
    注意: 硬膜の表面に生理食塩水を注ぎ、組織の水分を保ちます。
13. 2 μL のリリースカクテルを 1 μL/分の速度で注入します。
14. リリースカクテルの浮上を避けるために、ゆっくりと回収する前に、針をさらに2分間そのままにしておきます。
15. もう一方の半球の座標 AP = 0.3 mm、L = -1.2 mm(SEZ をターゲットにする場合)、または AP = 1.5 mm、L = -2.0 mm (CC をターゲットにする場合)で、手順 2.8 から 2.14 を繰り返します。
16. 切開部を5-0ナイロン(直径0.1mm)で縫合し、縫合部を消毒剤で洗浄します。
17. 麻酔薬を供給しているマスクを外し、動物を手術後の監視エリアに移します。
    注意: 麻酔からの回復と横臥の維持は5〜10分以内に発生し、25分以内に完全に回復(通常の動作)する必要があります。
    1. 気道を塞ぐ可能性のある小粒子の寝具のない、十分に加熱された(24〜25°C)静かな空間で、回復(鮮やかで途切れることのない動き、水への頻繁なアクセス)を注意深く監視します。動物は、完全に回復したことを確認した後にのみ、ケージメイトの会社に戻してください(新しい動物には戻らない)。
    2. 手術後少なくとも48時間は、メンテナンス施設で動物を監視します。鎮痛剤を投与することにより、痛みの兆候(頭の隠蔽、頭または体の異常な姿勢、過敏症、および取り扱いに対する過興奮性)に対処します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン、皮下)。.毛皮が変色したり、直立したりしている動物は、担当の獣医に紹介してください。

3.脳脊髄液(CSF)リキッドバイオプシー

注:プロセス全体は10分以内に実行できます。ここで説明するリキッドバイオプシーは、放出カクテルの注射の3日後に実施されますが、必要に応じていつでもまったく同じ方法で実施できます。無菌状態で手術を行うように注意してください。消毒剤(3%または6%の過酸化水素など)ですべての表面を清掃します。オートクレーブ滅菌または滅菌しやすい道具、手袋、ガウン、ドレープを使用してください。

1. イソフルラン吸入により動物を麻酔する(誘導に2.5%、維持に2%)。角膜をチェックして麻酔の深さを確認する
   反射、刺激に対する反応(後肢と尾のつまみテスト)、および呼吸様式。
   注:外科的処置は、腹腔内注射麻酔によって誘発される全身麻酔下で実行できます(例:ケタミン[40 mg / kg]およびキシラジン[10 mg / kg])。ただし、特に生検が連続して複数回行われる場合は、手順が短いため、これはお勧めできません。
2. 麻酔導入時に鎮痛剤を皮下投与します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン)。.
3. 実験動物を脳定位固定装置フレームに装着します。イヤーバーを使用して、前後への回転運動を妨げずにヘッドを固定します。
4. 首の後ろをうまく伸ばせるように、頭を下向きに40°の角度で安定させます。
   注意: これを行う1つの方法は、デバイス⁶のマウスバーを使用することです。
5. カミソリを使用して首の部分の毛を剃り、10%ポビドンヨード溶液とアルコールなどの消毒剤で皮膚をきれいにします。滅菌綿棒を使用して消毒剤を3回塗布します。毎回3〜5秒間円を描くようにこすります。
6. 指先で、後頭隆起とアトラス⁶の脊椎の間にある菱形の陥没領域を見つけます。
7. ポイントマークを描画します(マーカーを使用するなど)。
8. 1 mLまたは0.5 mLのシリンジを脳定位固定フレームに固定します。
   注意: 取り外し不可能な針付きのシリンジは、吸引力が高く、デッドボリュームが少ないため、使用することをお勧めします。
9. ポイントマークの皮膚との接触点に針を持ってきます。
10. 一対の鉗子を使用して、シリンジを皮膚層から下げながら皮膚を持ち上げます。
11. プランジャーを少し回収して、シリンジ内に負圧を発生させます。
12. 液体(CSF)がシリンジに現れるまで、針を非常にゆっくりと浸すために再開します。
13. この位置に針を落ち着かせ、CSFのゆっくりとした流れを待ちます。
    注意: CSFの流れが非常に遅い場合は、針をわずかに下げたり上げたりすることができます。
14. 120 μLまでゆっくりと(40 μL/分刻みで)CSFの除去を開始します。
15. シリンジをゆっくりと取り出します。
16. 1 mL の正常血清を腹腔内に投与して、実験動物の水分補給をサポートします。
17. リキッドバイオプシー(CSF)を400 μLのNSC培地と混合し、さらに使用するまで微量遠心チューブを4°Cに保ちます。
    注:リキッドバイオプシーは、凍結しない場合、3時間以内に処理する必要があります。
18. 麻酔薬を供給するマスクを外し、動物を術後の監視エリアに移します。
    注意: 麻酔からの回復と横臥の維持は5〜10分以内に発生し、25分以内に完全に回復(通常の動作)する必要があります。
    1. 気道を塞ぐ可能性のある小粒子の寝具のない、十分に加熱された(24〜25°C)静かな空間で、回復(鮮やかで途切れることのない動き、水への頻繁なアクセス)を注意深く監視します。動物は、完全に回復したことが確認された後にのみ、ケージメイトの会社に戻してください(新しい動物には戻らない)。
    2. 手術後少なくとも48時間は、メンテナンス施設で動物を監視します。痛みの兆候(頭の隠蔽、頭または体の異常な姿勢、過敏症、取り扱いに対する過興奮性)が観察された場合は、鎮痛剤を投与します(例:.、0.3 mg / mLブプレノルフィン皮下)。.毛皮が変色したり、直立したりしている動物は、担当の獣医に紹介してください。

4. 免疫蛍光法のための組織の処理

1. 20 mLの氷冷生理食塩水の心臓内注入、続いて50 mLの氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA;pH = 7.4のリン酸緩衝生理食塩水[PBS]中)によって動物を安楽死させます。.
2. 脳組織を解剖します。
   1. ハサミを使って頭と体を分離し、頸部に切り込みを入れます。はさみを使って皮膚を取り除き、脳組織を傷つけないように、はさみの先端が上を向くように、矢状正中線に沿って頭蓋骨を切断します。冠状正中線を通過して、できるだけ切断を続けることを目指します。
   2. 鉗子を使用して、後頭上骨と頭頂骨から始めて骨を取り除き、最後に前頭骨を取り除きます。
   3. 脳組織が明らかになったら、鉗子またはスパチュラを使用して頭蓋骨から持ち上げます。これを容易にするために、脳の基部の神経と嗅球を切断します。
3. 組織を2%PFAで4°Cで一晩後固定します。
4. 組織が底に沈むまで、30%スクロース(PBS中)で4°Cで少なくとも48時間凍結保護します。
5. 組織を-80°Cで凍結します。
6. クライオスタットで脳組織を厚さ14μmの冠状切片に切断します。
7. 標準プロトコルを用いた免疫蛍光染色の実施 ^3,7
   1. 切片をブロッキングバッファー(3%ウシ血清アルブミン[BSA]、0.1% Triton X-100、PBS溶液)で室温で2時間インキュベートします。
   2. 抗原賦活化を行います(ガラス瓶を使用して、10 mMクエン酸緩衝液、pH = 6.0で15分間煮沸します)。
      注:この手順はオプションですが、核抗原には必要です。
   3. 室温に戻して、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ダブルコルチン(Dcx)、S100β、β-カテニン( 材料表を参照)に対する一次抗体とともに、ブロッキングバッファー中で4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含むPBS中の二次抗体と2時間インキュベートし、室温で核対比染色を行います( 材料表を参照)。
   5. カバーガラスを取り付けます。

5. 単離細胞の免疫蛍光法の処理

1. ポリ-D-リジン(100 μg/mL)でコーティングされた顕微鏡検査に適した96ウェルプレートに細胞を播種します。
2. 細胞を氷冷した2%PFAで10分間固定し、PBSで3回洗浄します。
3. PDGFRα、GFAP、Dcx、SOX2、およびID3の標準手順^3,7を使用して免疫蛍光法を実施します(材料表を参照)。
4. 細胞をPBS + NaN₃ (0.1%)中、暗所で4°Cに保ちます。

6. 顕微鏡検査と画像解析

1. 落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影し、セルカウンターなどの標準的な画像解析ソフトウェアツールを使用して細胞カウントを行います。

結果

NSCの公開と収集
SEZのNSCは、上衣細胞の単層によってのみCSFから分離されていますが、それらはインターカレーション単繊毛プロセスを介して心室内容物と直接接触したままです^8,9。ノイラミニダーゼは、シアル酸残基の切断を介して上衣細胞に特異的に作用し、心室壁の剥離を誘発する可能性があります。これは、心?...

ディスカッション

幹細胞と前駆細胞は、哺乳類の脳組織では比較的まばらです。さらに、神経幹細胞は、簡単で安全な生検のためにアクセスできない領域(心室壁、海馬)にあります。したがって、これまでのところ、そのような細胞を実験的に扱う唯一の方法は、死後の分離でした。ここでは、生きたラットからNSCおよびOPCを単回または反復して採取する方法(搾乳)について、段階的に説明します。この方法は...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX