从活大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的"脑挤奶"方法

摘要

本文详细介绍了从活大鼠大脑中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的方法。它允许从同一只动物身上多次收集这些细胞，而不会影响它们的健康。

摘要

组织特异性神经干细胞 （NSC） 在哺乳动物出生后大脑中保持活跃。它们居住在专门的生态位中，在那里它们产生新的神经元和神经胶质细胞。其中一个生态位是室管膜下区（SEZ;也称为室室-脑室下区），它位于侧脑室的侧壁上，与室管膜细胞层相邻。少突胶质细胞祖细胞 （OPC） 大量分布在整个中枢神经系统中，构成可产生少突胶质细胞的增殖祖细胞库。

NSC 和 OPC 都表现出自我更新潜力和静止/激活周期。由于它们的位置，这些细胞的分离和实验研究是在死后进行的。在这里，我们详细描述了"脑挤奶"，这是一种从活体动物中分离 NSC 和 OPC 以及其他细胞的方法。这是一个设计用于啮齿动物并在大鼠中测试的两步方案。首先， 通过 立体定位脑室内 （i.c.v.） 注射"释放鸡尾酒"，将细胞从组织中"释放"。主要成分是神经氨酸酶，其靶向室管膜细胞并诱导室壁剥落、整合素-β1 阻断抗体和成纤维细胞生长因子-2。在第二个"收集"步骤中，从麻醉的大鼠池中进行脑脊液的液体活检，而无需切口。

这里给出的结果表明，分离的细胞保留了其内源性特征，而经济特区的NSC保持了它们的静止状态。室管膜层的剥蚀仅限于注射的解剖水平，并且动物可以很好地耐受该方案（释放和收集）。这种新方法为在实验动物中进行内源性神经发生和胶质生成的纵向研究铺平了道路。

引言

组织特异性干细胞是部分承诺的细胞，可以产生构成各自组织的所有细胞群。除了多能外，它们还是自我更新的细胞，对于维持组织的稳态和再生能力至关重要¹.一些组织特异性干细胞保持活跃、强烈增殖状态，例如肠道或造血干细胞。其他细胞，如脑干细胞，在很大程度上保持静止或休眠状态².在成人大脑中，神经干细胞 （NSC） 可以在特定区域找到，通常称为生态位。在侧脑室的室管膜下区 （SEZ） 和海马的齿状回中存在两个这样的描述良好的区域。经济特区生态位产生的细胞数量最多，主要是向嗅球迁移并有助于局部中间神经元群的神经母细胞;相反，产生的少突胶质细胞迁移到相邻的胼胝体 （CC）³。少突胶质细胞祖细胞 （OPC） 是有丝分裂活性细胞，广泛分布在整个中枢神经系统中，它们:i） 致力于少突胶质细胞谱系，ii） 可以迁移到脱髓鞘位点，以及 iii） 可以分化成髓鞘少突胶质细胞。OPC 还表现出自我更新潜力和静止状态⁴。

到目前为止，NSC和OPC的分离和研究需要对解剖的大脑和脊髓组织进行死后解离。为了规避这一实验限制，我们建立了一种方法，首次允许从活体动物中分离大脑NSC和OPC。我们称这种方法为"挤奶"，因为它可以收集多个细胞，因为它们的池不会耗尽。该协议是在大鼠中开发的，因为它们的大脑体积很大，主要针对经济特区或CC，包括两个主要步骤。首先， 通过 静脉注射含有神经氨酸酶（一种诱导脑室壁剥落的毒素、一种整合素-β1 阻断抗体和成纤维细胞生长因子 2 （FGF2）的"释放鸡尾酒"，将 NSC 或 OPC 从组织中"去除"。鸡尾酒在侧脑室内双侧立体注射。如果预期用途是分离 NSC，则以侧脑室的喙部区域为目标。如果目的是更纯净地分离OPC，则将混合物从尾部注射到海马菌毛区域。在第二个"收集"步骤中，从麻醉大鼠的脑池中进行脑脊液（CSF）的液体活检，而无需切口。将液体活检与NSC培养基混合，并可保持在4°C直至接种。

研究方案

动物育种、维护和实验程序是根据内政部授权的《1986年英国动物（科学程序）法》和希腊共和国第56/2013号总统令进行的，由剑桥大学和帕特雷大学的动物福利和伦理审查机构审查，并由当地县动物护理和使用委员会批准和审查（协议编号: 5675/39/18-01-2021）。 使用雄性和雌性 Sprague-Dawley、Wistar 和 Long-Evans 大鼠，年龄在 2 至 4 个月之间，体重在 150 g 至 250 g 之间。该协议以图形方式总结在 图1中。

1. 释放鸡尾酒准备

注意:手术当天新鲜准备并放在冰上。每 2 μL 给予量以静脉注射到每个侧脑室中。每次预期进样再准备 1 μL。

1. 从 产气荚膜梭菌 （Clostridium welchii）中制备0.5μL的500mU神经氨酸酶。
   注意:将其储存为1U / μL原液，在-20°C的无菌水中稀释。 其他类型的神经氨酸酶尚未经过测试。
2. 制备含有 1 μg 整合素-β1 阻断抗体的 1 μL。
   注意:将其储存在4°C。
3. 制备含有0.5μg碱性成纤维细胞生长因子（重组人FGF-碱性）的0.5μL。
   注意:将其储存为1μg/ μL原液，在-20°C的无菌水中稀释。

2.注射释放鸡尾酒

注意:整个过程可以在 20 分钟内完成。注意在无菌条件下进行手术。用消毒剂（例如 3% 或 6% 过氧化氢）清洁所有表面。使用高压灭菌或易于消毒的工具、手套、防护服和窗帘。

1. 通过吸入异氟烷麻醉实验动物（诱导为2.5%，维持为2%）。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾巴捏合试验）和呼吸方式来确认麻醉深度。
   注意:外科手术可以在腹膜内注射麻醉诱导的全身麻醉下进行（例如，氯胺酮 [40 mg/kg] 和甲苯噻嗪 [10 mg/kg]）。通过检查角膜反射、对刺激的反应（后肢和尾巴捏合试验）和呼吸方式来确认深度麻醉。
2. 麻醉诱导后皮下注射镇痛药（例如，0.3 mg/mL 丁丙诺啡）。
3. 将大鼠安装在立体定位框架上。
4. 用剃须刀剃掉头部的皮毛，并用防腐剂清洁皮肤，例如10%聚维酮碘溶液，然后用酒精清洁皮肤。使用无菌棉签涂抹消毒剂三次。每次以圆周运动揉搓 3-5 秒。涂抹眼药膏以防止干燥。
5. 使用无菌手术刀沿中线在头部皮肤上做一个 2 厘米的切口。
6. 使用无菌拭子和无菌盐水仔细清除颅骨。
7. 使用安装在立体定位装置上的 10 μL Hamilton 注射器的针头边缘识别前囟。将 bregma 设置为"点 0,0"。
   注意:前囟被确定为矢状缝和冠状缝之间的交点。更多细节可以在Paxinos和Watson⁵的大鼠大脑图谱中找到。
8. 将设备移动到坐标前后 （AP） = 0.3 mm，横向 （L） = +1.2 mm（以瞄准经济特区），或 AP = 1.5 mm，L = +2.0 mm（以瞄准 CC）。
9. 用牙钻钻一个 1 毫米的毛刺孔。
   注意: 用手钻孔时，注意不要伤害皮质表面。预计出血量不会很大。用生理盐水清除所有血液，并施加压力以阻止更持久的出血。
10. 在 10 μL Hamilton 注射器中加载 4 μL 释放混合物。
11. 降低汉密尔顿注射器的针头（最好是钝的或锥形边缘），以便与硬脑膜接触。
12. 将针插入所需深度 （D = 3.5 mm）。
    注意:将生理盐水倒在硬脑膜表面以保持组织水分。
13. 以 1 μL/min 的速率注入 2 μL 释放混合物。
14. 在缓慢取出之前，将针头再留在原位 2 分钟，以避免释放混合物浮出水面。
15. 在坐标 AP = 0.3 mm、L = -1.2 mm（以经济特区为目标）或 AP = 1.5 mm、L = -2.0 mm（以 CC 为目标）处对另一个半球重复步骤 2.8-2.14。
16. 用 5-0 尼龙（直径 0.1 毫米）缝合切口，并用防腐剂清洁缝合区域。
17. 取下供应麻醉剂的面罩，并将动物转移到术后监测区域。
    注意:麻醉恢复和卧位维持应在 5-10 分钟内进行，并在 25 分钟内完全恢复（正常行为）。
    1. 密切监测恢复情况（生动和不间断的运动，经常接触水），在加热良好（24-25°C）的安静空间中，没有小颗粒床上用品，这可能会阻塞气道。只有在确认完全康复后，才能将动物放回笼友的陪伴下（而不是新动物）。
    2. 手术后在维持设施中监测动物至少48小时。通过给予镇痛剂（例如，皮下注射 0.3 mg/mL 丁丙诺啡）来解决疼痛体征（隐藏头部、头部或身体姿势异常、超敏反应和对处理过度兴奋）。将皮毛变色或竖立的动物转介给负责的兽医。

3. 脑脊液（CSF）液体活检

注意:整个过程可以在 10 分钟内完成。这里描述的液体活检在注射释放鸡尾酒后 3 天进行，但可以在需要时以完全相同的方式进行。注意在无菌条件下进行手术。用消毒剂（例如，3% 或 6% 过氧化氢）清洁所有表面。使用高压灭菌或易于消毒的工具、手套、防护服和窗帘。

1. 通过吸入异氟烷麻醉动物（2.5%用于诱导，2%用于维持）。通过检查角膜来确认麻醉深度
   反射、对刺激的反应（后肢和尾巴捏合试验）和呼吸方式。
   注意:外科手术可以在腹膜内注射麻醉（例如氯胺酮 [40 mg/kg] 和甲苯噻嗪 [10 mg/kg]）诱导的全身麻醉下进行。然而，这是不可取的，因为手术时间很短，特别是如果活检将在连续几天进行多次。
2. 麻醉诱导后皮下注射镇痛药（例如，0.3 mg/mL 丁丙诺啡）。
3. 将实验动物安装在立体定位框架上。使用耳杆固定头部，而不会阻碍向前和向后的旋转运动。
4. 将头部稳定在向下的 40° 角，以便颈部后部的良好伸展。
   注意: 一种方法是使用设备⁶ 的口杆。
5. 用剃须刀剃掉颈部的毛发，并用防腐剂清洁皮肤，例如 10% 聚维酮碘溶液，然后使用酒精。使用无菌棉签涂抹消毒剂三次。每次以圆周运动揉搓 3-5 秒。
6. 用指尖找到位于枕骨突起和脊柱之间的菱形可抑郁区域⁶.
7. 画一个点标记（例如，使用记号笔）。
8. 将 1 mL 或 0.5 mL 注射器固定在立体定位框架上。
   注意:建议使用带有不可拆卸针头的注射器，因为它们会产生更好的吸力和更少的死体积。
9. 将针头放在与皮肤接触点的点标记处。
10. 用一把镊子抬起皮肤，同时将注射器穿过皮肤层。
11. 稍微取回柱塞以在注射器中产生负压。
12. 重新启动以非常缓慢地浸入针头，直到注射器中出现液体 （CSF）。
13. 将针头固定在这个位置，让脑脊液缓慢流动。
    注意:如果脑脊液流速非常慢，针头可以稍微降低或升高。
14. 开始缓慢（以 40 μL/min 的步长）去除 CSF，直至 120 μL。
15. 慢慢取回注射器。
16. 腹膜内施用 1 mL 正常血清以支持实验动物补充液体。
17. 将液体活检（CSF）与400μLNSC培养基混合，并将微量离心管保持在4°C直至进一步使用。
    注意:如果不冷冻，液体活检应在 3 小时内处理。
18. 取下提供麻醉剂的面罩，将动物转移到术后监测区域。
    注意:麻醉恢复和卧位维持应在 5-10 分钟内进行，并在 25 分钟内完全恢复（正常行为）。
    1. 密切监测恢复情况（生动和不间断的运动，经常接触水），在加热良好（24-25°C）的安静空间中，没有小颗粒床上用品，这可能会阻塞气道。只有在确认完全康复后，才能将动物送回笼友（而不是新动物）的陪伴下。
    2. 手术后在维持设施中监测动物至少48小时。如果观察到疼痛体征（头部隐藏、头部或身体姿势异常、过敏反应和对处理过度兴奋），给予镇痛（例如，皮下注射 0.3 mg/mL 丁丙诺啡）。将皮毛变色或竖立的动物转介给负责的兽医。

4. 用于免疫荧光的组织处理

1. 通过心内输注 20 mL 冰冷盐水，然后输注 50 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA;在 pH = 7.4 的磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 中）对动物实施安乐死。
2. 解剖脑组织。
   1. 用剪刀将头部与身体分开，在宫颈区域切开。用剪刀去除皮肤，然后沿着矢状中线剪下颅骨，剪刀的尖端朝上，以免损坏脑组织。目标是尽可能多地继续切割，通过日冕中线。
   2. 使用镊子取出骨头，从枕上骨和顶骨开始，最后取出额骨。
   3. 一旦脑组织显露出来，用镊子或刮刀将其从颅骨中取出。为了促进这一点，如果不需要，请切断大脑底部的神经和嗅球。
3. 将组织在4°C下在2%PFA中固定过夜。
4. 在4°C下在30%蔗糖（PBS中）中冷冻保护组织至少48小时，直到组织沉入底部。
5. 将组织冷冻在-80°C。
6. 用低温恒温器将脑组织切成 14 μm 厚的冠状切片。
7. 使用标准方案进行免疫荧光染色 ^3,7
   1. 在室温下用封闭缓冲液（3%牛血清白蛋白[BSA]，0.1%Triton X-100，在PBS中）孵育切片2小时。
   2. 进行抗原修复（在10mM柠檬酸盐缓冲液中煮沸15分钟，pH = 6.0，使用玻璃罐）。
      注意:此步骤是可选的，但对于核抗原是必需的。
   3. 置于室温下，与抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP），双皮质素（Dcx），S100β和β-连环蛋白的一抗（参见 材料表）在封闭缓冲液中在4°C下孵育过夜。
   4. 在PBS中与具有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的二抗一起孵育2小时，用于室温下的核复染（参见 材料表）。
   5. 安装盖玻片。

5. 处理分离的细胞进行免疫荧光

1. 将细胞铺接到与显微镜兼容的 96 孔板中，涂有聚-D-赖氨酸 （100 μg/mL）。
2. 将细胞固定在冰冷的 2% PFA 中 10 分钟，并用 PBS 洗涤 3 次。
3. 使用标准程序 ^3,7 对 PDGFRα、GFAP、Dcx、SOX2 和 ID3 进行免疫荧光（参见材料表）。
4. 将细胞在4°C下保持在4°C的PBS + NaN₃ （0.1%）中。

6. 显微镜和图像分析

1. 使用落射荧光或共聚焦显微镜拍摄图像，并使用标准图像分析软件工具（如细胞计数仪）进行细胞计数。

结果

NSC的发布和收集
经济特区的 NSC 仅通过室管膜细胞的单层与脑脊液分离，尽管它们通过插入的单纤毛突与心室内容物保持直接接触 ^8,9。神经氨酸酶通过裂解唾液酸残基特异性作用于室管膜细胞，并可诱导心室壁脱落。这导致神经母细胞聚集在心室^{表面 10,11}。此外，在静脉注射整合...

讨论

干细胞和祖细胞在哺乳动物脑组织中相对稀疏。此外，NSC 位于难以进入且易于安全活检的区域（心室壁、海马体）。因此，到目前为止，对这种细胞进行实验的唯一方法是它们的死后分离。这里逐步描述了一种允许从活大鼠中单次或重复收集NSC和OPC的方法，称为挤奶。该方法基于两个关键特征:i） NSC 或 OPC 由室管膜细胞单层与脑脊液分离，在脑室系统内流动;ii） 室管膜细胞和神经祖细胞通过整?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX