从活大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的“脑挤奶”方法

摘要

本文详细介绍了从活大鼠大脑中分离神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞的方法。它允许从同一只动物身上多次收集这些细胞，而不会影响它们的健康。

摘要

组织特异性神经干细胞 （NSC） 在哺乳动物出生后大脑中保持活跃。它们居住在专门的生态位中，在那里它们产生新的神经元和神经胶质细胞。其中一个生态位是室管膜下区（SEZ;也称为室室-脑室下区），它位于侧脑室的侧壁上，与室管膜细胞层相邻。少突胶质细胞祖细胞 （OPC） 大量分布在整个中枢神经系统中，构成可产生少突胶质细胞的增殖祖细胞库。

NSC 和 OPC 都表现出自我更新潜力和静止/激活周期。由于它们的位置，这些细胞的分离和实验研究是在死后进行的。在这里，我们详细描述了“脑挤奶”，这是一种从活体动物中分离 NSC 和 OPC 以及其他细胞的方法。这是一个设计用于啮齿动物并在大鼠中测试的两步方案。首先， 通过 立体定位脑室内 （i.c.v.） 注射“释放鸡尾酒”，将细胞从组织中“释放”。主要成分是神经氨酸酶，其靶向室管膜细胞并诱导室壁剥落、整合素-β1 阻断抗体和成纤维细胞生长因子-2。在第二个“收集”步骤中，从麻醉的大鼠池中进行脑脊液的液体活检，而无需切口。

这里给出的结果表明，分离的细胞保留了其内源性特征，而经济特区的NSC保持了它们的静止状态。室管膜层的剥蚀仅限于注射的解剖水平，并且动物可以很好地耐受该方案（释放和收集）。这种新方法为在实验动物中进行内源性神经发生和胶质生成的纵向研究铺平了道路。

引言

组织特异性干细胞是部分承诺的细胞，可以产生构成各自组织的所有细胞群。除了多能外，它们还是自我更新的细胞，对于维持组织的稳态和再生能力至关重要¹.一些组织特异性干细胞保持活跃、强烈增殖状态，例如肠道或造血干细胞。其他细胞，如脑干细胞，在很大程度上保持静止或休眠状态².在成人大脑中，神经干细胞 （NSC） 可以在特定区域找到，通常称为生态位。在侧脑室的室管膜下区 （SEZ） 和海马的齿状回中存在两个这样的描述良好的区域。经济特区生态位产生的细胞数量最多，主要是向嗅球迁移并有助于局部中间神经元群的神经母细胞;相反，产生的少突胶质细胞迁移到相邻的胼胝体 （CC）³。少突胶质细胞祖细胞 （OPC） 是有丝分裂活性细胞，广泛分布在整个中枢神经系统中，它们：i） 致力于少突胶质细胞谱系，ii） 可以迁移到脱髓鞘位点，以及 iii） 可以分化成髓鞘少突胶质细胞。OPC 还表现出自我更新潜力和静止状态⁴。

到目前为止，NSC和OPC的分离和研究需要对解剖的大脑和脊髓组织进行死后解离。为了规避这一实验限制，我们建立了一种方法，首次允许从活体动物中分离大脑NSC和OPC。我们称这种方法为“挤奶”，因为它可以收集多个细胞，因为它们的池不会耗尽。该协议是在大鼠中开发的，因为它们的大脑体积很大，主要针对经济特区或C....

研究方案

动物育种、维护和实验程序是根据内政部授权的《1986年英国动物（科学程序）法》和希腊共和国第56/2013号总统令进行的，由剑桥大学和帕特雷大学的动物福利和伦理审查机构审查，并由当地县动物护理和使用委员会批准和审查（协议编号： 5675/39/18-01-2021）。 使用雄性和雌性 Sprague-Dawley、Wistar 和 Long-Evans 大鼠，年龄在 2 至 4 个月之间，体重在 150 g 至 250 g 之间。该协议以图形方式总结在 图1中。

1. 释放鸡尾酒准备

注意：手术当天新鲜准备并放在冰上。每 2 μL 给予量以静脉注射到每个侧脑室中。每次预期进样再准备 1 μL。

1. 从 产气荚膜梭菌 （Clostridium welchii）中制备0.5μL的500mU神经氨酸酶。
   注意：将其储存为1U / μL原液，在-20°C的无菌水中稀释。 其他类型的神经氨酸酶尚未经过测试。
2. 制备含有 1 μg 整合素-β1 阻断抗体的 1 μL。
   注意：将其储存在4°C。
3. 制备含有0.5μg碱性成纤维细胞生长因子（重组人FGF-碱性）的0.5μL。
   注意：将其储存为1μg/ μL原液，在-20°C的无菌水中稀释。....

讨论

干细胞和祖细胞在哺乳动物脑组织中相对稀疏。此外，NSC 位于难以进入且易于安全活检的区域（心室壁、海马体）。因此，到目前为止，对这种细胞进行实验的唯一方法是它们的死后分离。这里逐步描述了一种允许从活大鼠中单次或重复收集NSC和OPC的方法，称为挤奶。该方法基于两个关键特征：i） NSC 或 OPC 由室管膜细胞单层与脑脊液分离，在脑室系统内流动;ii） 室管膜细胞和神经祖细胞通过整.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX