El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

Resumen

Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.

Resumen

Las células madre neurales (NSC) específicas de tejido permanecen activas en el cerebro postnatal de los mamíferos. Residen en nichos especializados, donde generan nuevas neuronas y glía. Uno de estos nichos es la zona subependimaria (ZEE; también llamada zona ventricular-subventricular), que se encuentra a lo largo de las paredes laterales de los ventrículos laterales, adyacente a la capa de células ependimarias. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) están abundantemente distribuidas por todo el sistema nervioso central, constituyendo un conjunto de células progenitoras proliferativas que pueden generar oligodendrocitos.

Tanto los NSC como los OPC exhiben potencial de autorrenovación y ciclos de inactividad/activación. Debido a su localización, el aislamiento y la investigación experimental de estas células se realiza post mortem. Aquí, describimos en detalle el "ordeño cerebral", un método para el aislamiento de NSCs y OPCs, entre otras células, de animales vivos. Este es un protocolo de dos pasos diseñado para su uso en roedores y probado en ratas. En primer lugar, las células se "liberan" del tejido a través de una inyección estereotáxica intracerebroventricular (i.c.v.) de un "cóctel de liberación". Los componentes principales son la neuraminidasa, que se dirige a las células ependimarias e induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo bloqueante de la integrina-β1, y el factor de crecimiento de fibroblastos-2. En una segunda etapa de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna, en ratas anestesiadas sin necesidad de incisión.

Los resultados presentados aquí muestran que las células aisladas conservan su perfil endógeno y que las NSC de la ZEE conservan su quiescencia. La denudación de la capa ependimaria se restringe al nivel anatómico de la inyección y el protocolo (liberación y recolección) es bien tolerado por los animales. Este novedoso enfoque allana el camino para realizar estudios longitudinales de neurogénesis endógena y gliogénesis en animales de experimentación.

Introducción

Las células madre específicas de tejido son células parcialmente comprometidas que pueden dar lugar a todas las poblaciones celulares que constituyen los tejidos respectivos. Además de ser multipotentes, son células que se autorrenuevan y son cruciales para mantener la homeostasis y la capacidad regenerativa de los tejidos¹. Algunas células madre específicas de tejido permanecen en un estado activo y fuertemente proliferativo, como las células madre intestinales o hematopoyéticas. Otras, como las células madre cerebrales, permanecen en gran medida inactivas o inactivas². En el cerebro adulto, las células madre neurales (....

Protocolo

Los procedimientos de cría, mantenimiento y experimentación de animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986, autorizada por el Ministerio del Interior, y con el Decreto Presidencial 56/2013 de la República Helénica, examinada por los Órganos de Revisión Ética y de Bienestar Animal de las Universidades de Cambridge y Patras, así como aprobada y examinada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Prefectura local (Número de protocolo: 5675/39/18-01-2021). Se utilizaron ratas macho y hembra Sprague-Dawley, Wistar y Long-Evans, con edades que variaban entre 2 y 4 meses y con pesos corporales ent....

Discusión

Las células madre y progenitoras son relativamente escasas en el tejido cerebral de los mamíferos. Además, las NSC se encuentran en áreas inaccesibles para realizar biopsias fáciles y seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Por lo tanto, la única forma de trabajar experimentalmente con este tipo de células, hasta ahora, ha sido su aislamiento postmortem. A continuación se describe paso a paso un método que permite la recolección única o repetida de NSC y OPC de ratas vivas, llamado ordeño. El método se b.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX