Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

Resumo

Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.

Resumo

As células-tronco neurais tecido-específicas (NSCs) permanecem ativas no cérebro pós-natal de mamíferos. Residem em nichos especializados, onde geram novos neurônios e glia. Um desses nichos é a zona subependimária (ZEE, também chamada de zona ventricular-subventricular), que está localizada através das paredes laterais dos ventrículos laterais, adjacente à camada de células ependimárias. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) distribuem-se abundantemente pelo sistema nervoso central, constituindo um pool de células progenitoras proliferativas que podem gerar oligodendrócitos.

Tanto NSCs quanto OPCs exibem potencial de auto-renovação e ciclos de quiescência/ativação. Devido à sua localização, o isolamento e a investigação experimental dessas células são realizados post-mortem. Aqui, descrevemos em detalhes a "ordenha cerebral", um método para o isolamento de NSCs e OPCs, entre outras células, de animais vivos. Este é um protocolo de duas etapas projetado para uso em roedores e testado em ratos. Primeiro, as células são "liberadas" do tecido por meio da injeção intracerebroventricular (i.c.v.) estereotáxica de um "coquetel de liberação". Os principais componentes são a neuraminidase, que tem como alvo as células ependimárias e induz o desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador da integrina-β1 e o fator de crescimento de fibroblastos-2. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano são realizadas a partir da cisterna magna, em ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão.

Os resultados aqui apresentados mostram que as células isoladas mantêm seu perfil endógeno e que as NSCs da ZEE preservam sua quiescência. O desnudamento da camada ependimária é restrito ao nível anatômico de injeção e o protocolo (liberação e coleta) é bem tolerado pelos animais. Esta nova abordagem abre caminho para a realização de estudos longitudinais de neurogênese endógena e gliogênese em animais experimentais.

Introdução

As células-tronco tecido-específicas são células parcialmente comprometidas que podem dar origem a todas as populações celulares que constituem os respectivos tecidos. Além de multipotentes, são células auto-renovadoras e cruciais para a manutenção da homeostase e da capacidade regenerativa dos^tecidos1. Algumas células-tronco tecido-específicas permanecem em um estado ativo e fortemente proliferativo, como células-tronco intestinais ou hematopoiéticas. Outras, como as células-tronco cerebrais, permanecem em grande parte quiescentes ou dormentes². No cérebro adulto, as células-tronco neurais (NSCs) podem ser encontradas em áreas especializadas, muitas vezes chamadas de nichos. Duas dessas áreas bem descritas existem na zona subependimária (ZEE) dos ventrículos laterais e no giro denteado do hipocampo. O nicho SEZ gera o maior número de células, principalmente neuroblastos que migram em direção aos bulbos olfativos e contribuem para a população local de interneurônios; em contraste, os oligodendroblastos gerados migram para o corpo caloso adjacente (CC)³. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) são células mitoticamente ativas, amplamente distribuídas pelo sistema nervoso central, que: i) estão comprometidas com a linhagem oligodendroglial, ii) podem migrar para sítios de desmielinização e iii) podem se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes. OPCs também apresentam potencial de auto-renovação e quiescência⁴.

Até agora, o isolamento e o estudo de NSCs e OPCs exigiam a dissociação post-mortem do tecido cerebral e medular dissecado. Para contornar essa limitação experimental, estabelecemos um método que permite, pela primeira vez, o isolamento de NSCs e OPCs cerebrais de animais vivos. Chamamos esse método de "ordenha", porque ele permite várias coletas de células, pois seus pools não se esgotam. O protocolo foi desenvolvido em ratos, devido ao seu grande tamanho cerebral, visando principalmente a ZEE, ou CC, e inclui duas etapas principais. Primeiro, NSCs ou OPCs são "removidos" do tecido por meio da injeção i.c.v. de um "coquetel de liberação" contendo neuraminidase, uma toxina que induz desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador de integrina-β1 e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2). O coquetel é injetado estereotaxicamente bilateralmente dentro dos ventrículos laterais. Se o uso pretendido for o isolamento de NSCs, áreas rostrais dos ventrículos laterais são alvo. Se o objetivo é isolar OPCs mais puramente, o coquetel é injetado caudalmente na área da fímbria hipocampal. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano (LCR) são realizadas a partir da cisterna magna de ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão. A biópsia líquida é misturada com meio de cultura NSC e pode ser mantida a 4 °C até o plaqueamento.

Protocolo

Os procedimentos de criação, manutenção e experimentação de animais foram conduzidos de acordo com o UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizado pelo Ministério do Interior, e com o Decreto Presidencial 56/2013 da República Helênica, examinados pelos Órgãos de Bem-Estar Animal e Revisão Ética das Universidades de Cambridge e Patras, bem como aprovados e examinados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Prefeitura local (número do protocolo: 5675/39/18-01-2021). Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, com idade variando entre 2 e 4 meses e peso corporal entre 150 g e 250 g. O protocolo está resumido graficamente na Figura 1.

1. Liberar o coquetel de preparação

OBS: Prepare fresco no dia do procedimento e mantenha no gelo. As quantidades são dadas por 2 μL a serem injetados i.c.v. em cada ventrículo lateral. Prepare mais 1 μL por injeção pretendida.

1. Preparar 0,5 μL de neuraminidase 500 mU de Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   NOTA: Conservar esta conserva em 1 U/μL diluída em água estéril a -20 °C. Outros tipos de neuraminidases não foram testados.
2. Preparar 1 μL contendo 1 μg de anticorpo bloqueador de integrina-β1.
   NOTA: Conservar a 4 °C.
3. Preparar 0,5 μL contendo 0,5 μg de fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-básico humano recombinante).
   NOTA: Conservar como uma reserva de 1 μg/μL diluída em água estéril a -20 °C.

2. Injeção de coquetel de liberação

NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 20 min. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.

1. Anestesiar o animal experimental por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando o reflexo corneano, a reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração.
   NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). A anestesia profunda foi confirmada pela verificação do reflexo corneano, da reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e do modo respiratório.
2. Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.
3. Monte o rato na estrutura estereotáxica.
4. Raspe o pelo da cabeça com uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez. Aplique pomada ocular para evitar o ressecamento.
5. Faça uma incisão de 2 cm na pele da cabeça ao longo da linha média usando um bisturi estéril.
6. Limpe meticulosamente o crânio usando cotonetes estéreis e soro fisiológico estéril.
7. Identifique o bregma utilizando a borda da agulha de uma seringa Hamilton de 10 μL montada no dispositivo estereotáxico. Defina o bregma como "ponto 0,0".
   OBS: O bregma é identificado como o ponto de intersecção entre as suturas sagital e coronal. Mais detalhes podem ser encontrados no atlas do cérebro de ratos de Paxinos e Watson⁵.
8. Deslocar o aparelho para as coordenadas anteroposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (para atingir a CC).
9. Faça um furo de rebarba de 1 mm usando uma broca dental.
   NOTA: Ao perfurar manualmente, tome cuidado para não ferir a superfície cortical. Não se espera que a hemorragia seja considerável. Limpe qualquer sangue com soro fisiológico e aplique pressão para parar o sangramento mais persistente.
10. Coloque 4 μL do cocktail de libertação na seringa Hamilton de 10 μL.
11. Abaixe a agulha (de preferência romba ou borda cônica) da seringa de Hamilton para entrar em contato com a dura-máter.
12. Inserir a agulha na profundidade desejada (D = 3,5 mm).
    NOTA: Despeje soro fisiológico na superfície da dura-máter para manter o tecido hidratado.
13. Infundir 2 μL do cocktail de libertação a uma taxa de 1 μL/min.
14. Deixe a agulha no lugar por mais 2 minutos antes da recuperação lenta para evitar o surgimento do coquetel de liberação.
15. Repita os passos 2,8-2,14 para o outro hemisfério nas coordenadas AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (para atingir a CC).
16. Sutura da incisão com náilon 5-0 (diâmetro 0,1 mm) e limpeza da área suturada com antisséptico.
17. Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitorização pós-operatória.
    NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.
    1. Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após confirmar a recuperação completa.
    2. Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Resolva os sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio) administrando analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina, por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.

3. Biópsia líquida do líquido cefalorraquidiano (LCR)

NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 10 min. A biópsia líquida descrita aqui é realizada 3 dias após a injeção do coquetel de liberação, mas pode ser realizada exatamente da mesma maneira sempre que necessário. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.

1. Anestesiar o animal por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando a córnea
   reflexo, a reação aos estímulos (teste da pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração.
   NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). No entanto, isso não é aconselhável, pois o procedimento é curto, especialmente se as biópsias forem realizadas várias vezes em dias consecutivos.
2. Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.
3. Monte o animal experimental sobre a estrutura estereotáxica. Use barras auriculares para fixar a cabeça sem obstruir o movimento rotacional em direção à frente e às costas.
4. Estabilize a cabeça em um ângulo descendente de 40° para que uma boa extensão da parte de trás do pescoço possa ser alcançada.
   Observação : uma maneira de fazer isso é usando a barra de boca do dispositivo⁶.
5. Raspe o pelo na área do pescoço usando uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez.
6. Com a ponta do dedo, encontrar a área depressível em forma de losango posicionada entre a protuberância occipital e a espinha do atlas⁶.
7. Desenhe um ponto (por exemplo, usando um marcador).
8. Fixe uma seringa de 1 ml ou 0,5 ml na estrutura estereotáxica.
   OBS: É aconselhável o uso de seringas com agulhas não destacáveis, pois produzem melhor sucção e possuem menor volume morto.
9. Traga a agulha no ponto de contacto com a pele na marca pontual.
10. Com um par de pinças, levante a pele enquanto abaixa a seringa através das camadas da pele.
11. Recupere ligeiramente o êmbolo para gerar pressão negativa na seringa.
12. Reinicie para mergulhar a agulha muito lentamente até que o líquido (LCR) apareça na seringa.
13. Assente a agulha nesta posição e permita o fluxo lento do líquor.
    NOTA: A agulha pode ser abaixada ou elevada ligeiramente se o fluxo do LCR for muito lento.
14. Iniciar a remoção lenta do líquor (em passos de 40 μL/min) até 120 μL.
15. Recupere lentamente a seringa.
16. Administrar intraperitonealmente 1 mL de soro normal para apoiar a reposição de fluidos do animal experimental.
17. Misturar a biópsia líquida (LCR) com 400 μL de meio NSC e manter o tubo de microcentrífuga a 4 °C até nova utilização.
    NOTA: As biópsias líquidas devem ser processadas dentro de 3 h se não forem congeladas.
18. Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitoramento pós-operatório.
    NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.
    1. Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após a recuperação total ter sido confirmada.
    2. Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Se forem observados sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio), administrar analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.

4. Processamento de tecidos para imunofluorescência

1. Eutanásia do animal por infusão intracárdica de 20 mL de solução salina gelada, seguida de 50 mL de paraformaldeído a 4% gelado (PFA; em solução salina tamponada com fosfato [PBS] de pH = 7,4).
2. Dissecção do tecido cerebral.
   1. Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura para fazer um corte na área cervical. Use a tesoura para remover a pele e, em seguida, corte o osso do crânio ao longo da linha média sagital, com as pontas da tesoura apontando para cima, a fim de não danificar o tecido cerebral. Procure continuar cortando o máximo possível, passando a linha média coronal.
   2. Use pinças para remover os ossos, começando pelos ossos supraoccipital e parietal e, finalmente, os ossos frontais.
   3. Uma vez que o tecido cerebral é revelado, use a pinça ou uma espátula para retirá-lo do crânio. Para facilitar isso, corte os nervos na base do cérebro e os bulbos olfativos, se não quiser.
3. Pós-fixar o tecido durante a noite em PFA a 2% a 4 °C.
4. Crio-proteger o tecido em sacarose a 30% (em PBS) por pelo menos 48 h a 4 °C até que o tecido afunde para o fundo.
5. Congelar o tecido a -80 °C.
6. Cortar o tecido cerebral em cortes coronais de 14 μm de espessura com um criostato.
7. Realizar coloração por imunofluorescência utilizando protocolos padronizados ^3,7
   1. Incubar os cortes com tampão de bloqueio (albumina de soro bovino a 3% [BSA], Triton X-100 a 0,1%, em PBS) por 2 h à temperatura ambiente.
   2. Realizar recuperação antigênica (fervura por 15 min em tampão citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizando frascos de vidro).
      NOTA: Esta etapa é opcional, mas necessária para antígenos nucleares.
   3. Levar à temperatura ambiente e incubar com anticorpos primários contra proteína glial fibrilar ácida (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β e β-catenina (ver Tabela de Materiais) em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C.
   4. Incubar durante 2 h com anticorpos secundários em PBS com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contramarcação nuclear à temperatura ambiente (ver Tabela de Materiais).
   5. Monte as lamínulas.

5. Processamento de células isoladas para imunofluorescência

1. Placatear as células em placas de 96 poços compatíveis para microscopia, revestidas com poli-D-lisina (100 μg/mL).
2. Fixar as células em PFA a 2% gelado por 10 min e lavar 3x com PBS.
3. Realizar imunofluorescência usando procedimentos padrão^3,7 para PDGFRα, GFAP^, Dcx, SOX2 e ID3 (consulte a Tabela de Materiais).
4. Manter as células em PBS + NaN₃ (0,1%) a 4 °C no escuro.

6. Microscopia e análise de imagens

1. Tire imagens usando epifluorescência ou microscopia confocal e realize contagens de células usando ferramentas padrão de software de análise de imagem, como contadores de células.

Resultados

Lançamento e coleta de NSCs
As NSCs da ZEE são separadas do LCR apenas pela monocamada de células ependimárias, embora permaneçam em contato direto com o conteúdo ventricular por meio de processos monociliados intercalantes ^8,9. A neuraminidase age especificamente nas células ependimárias via clivagem de resíduos de ácido siálico e pode induzir desnudamento da parede ventricular. Isso leva ao agrupamento de neurobl...

Discussão

As células-tronco e progenitoras são relativamente esparsas no tecido cerebral de mamíferos. Além disso, os NSCs estão localizados em áreas inacessíveis para biópsias fáceis e seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Portanto, a única maneira de trabalhar experimentalmente com essas células, até agora, tem sido seu isolamento post-mortem. Um método que permite a coleta única ou repetida de NSCs e OPCs de ratos vivos, denominado ordenha, é descrito passo a passo. O método baseia-se em duas característi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX