JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

Abstract

תאי גזע עצביים ספציפיים לרקמות (NSCs) נשארים פעילים במוח של יונקים לאחר הלידה. הם מתגוררים בנישות מיוחדות, שם הם מייצרים נוירונים חדשים וגלריה. נישה אחת כזו היא האזור התת-אפנדימלי (SEZ; נקרא גם האזור החדרי-תת-חדרי), הממוקם מעבר לדפנות הצידיות של החדרים הרוחביים, בסמוך לשכבת התא האפנדימלי. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) מופצים בשפע ברחבי מערכת העצבים המרכזית, ומהווים מאגר של תאי אב מתרבים שיכולים לייצר אוליגודנדרוציטים.

הן NSCs והן OPCs מציגים פוטנציאל התחדשות עצמית ומחזורי שקט/הפעלה. בשל מיקומם, הבידוד והחקירה הניסויית של תאים אלה מבוצעת לאחר המוות. כאן, אנו מתארים בפירוט "חליבת מוח", שיטה לבידוד של תאי גזע גזעיים ו- OPC, בין תאים אחרים, מבעלי חיים חיים. זהו פרוטוקול דו-שלבי המיועד לשימוש במכרסמים ונבדק בחולדות. ראשית, תאים "משתחררים" מהרקמה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית תוך-מוחית (i.c.v.) של "קוקטייל שחרור". המרכיבים העיקריים הם neuraminidase, אשר מכוון תאים אפנדימליים וגורם denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט-2. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי מבוצעות מגנה cisterna, בחולדות מורדמות ללא צורך בחתך.

התוצאות המוצגות כאן מראות כי תאים מבודדים שומרים על הפרופיל האנדוגני שלהם וכי NSCs של SEZ שומרים על שלוותם. הדנודציה של שכבת האפנדימל מוגבלת לרמה האנטומית של ההזרקה והפרוטוקול (שחרור ואיסוף) נסבל היטב על ידי בעלי החיים. גישה חדשנית זו סוללת את הדרך לביצוע מחקרי אורך של נוירוגנזה אנדוגנית וגליוגנזה בחיות ניסוי.

Introduction

תאי גזע ספציפיים לרקמות הם תאים מחויבים חלקית שיכולים ליצור את כל אוכלוסיות התאים המרכיבות את הרקמות המתאימות. מלבד היותם מולטיפוטנטיים, הם תאים המתחדשים מעצמם וחיוניים לשמירה על ההומאוסטזיס ויכולת ההתחדשות של רקמות1. חלק מתאי הגזע הספציפיים לרקמות נשארים במצב פעיל ומתרבים מאוד, כגון תאי גזע במעי או בהמטופויטיקה. אחרים, כגון תאי גזע המוח, נשארים שקטים או רדומיםבמידה רבה 2. במוח הבוגר, תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים להימצא באזורים מיוחדים, הנקראים לעתים קרובות נישות. שני אזורים כאלה המתוארים היטב קיימים באזור התת-אפנדימלי (SEZ) של החדרים הרוחביים ובפיתול המשונן של ההיפוקמפוס. נישת SEZ מייצרת את המספר הגבוה ביותר של תאים, בעיקר נוירובלסטים הנודדים לעבר פקעות הריח ותורמים לאוכלוסיית הנוירונים המקומית; לעומת זאת, אוליגודנדרובלסטים שנוצרו נודדים לכפיס המוח הסמוך (CC)3. תאי אב אוליגודנדרוציטים (OPC) הם תאים פעילים מיטוטית, המפוזרים באופן נרחב ברחבי מערכת העצבים המרכזית, אשר: i) מחויבים לשושלת אוליגודנדרוגליאלית, ii) יכולים לנדוד לאתרים של demyelination, ו iii) יכולים להתמיין לאוליגודנדרוציטים myelinating. OPCs גם להציג פוטנציאל התחדשות עצמית שקט4.

עד כה, הבידוד והמחקר של NSCs ו- OPCs דרשו דיסוציאציה לאחר המוות של רקמת המוח וחוט השדרה המנותחת. כדי לעקוף את המגבלה הניסויית הזו, הקמנו שיטה שמאפשרת, לראשונה, בידוד של תאי גזע עצביים במוח ו-OPC מבעלי חיים חיים. אנו קוראים לשיטה זו "חליבה", מכיוון שהיא מאפשרת אוספים מרובים של תאים מכיוון שהמאגרים שלהם אינם מתרוקנים. הפרוטוקול פותח בחולדות, בשל גודל המוח הגדול שלהן, המכוון בעיקר ל-SEZ, או CC, וכולל שני שלבים עיקריים. ראשית, NSCs או OPCs "מוסרים" מהרקמה באמצעות הזרקת i.c.v של "קוקטייל שחרור" המכיל neuraminidase, רעלן המשרה denudation דופן החדר, נוגדן חוסם integrin-β1, וגורם גדילה פיברובלסט 2 (FGF2). הקוקטייל מוזרק באופן סטריאוטקסי דו צדדי בתוך החדרים הצדיים. אם השימוש המיועד הוא בידוד של NSCs, אזורים rostral של החדרים לרוחב ממוקדים. אם המטרה היא לבודד OPC בצורה טהורה יותר, הקוקטייל מוזרק באופן קאודלי באזור הפימבריה של ההיפוקמפוס. בשלב "איסוף" שני, ביופסיות נוזליות של נוזל מוחי שדרתי (CSF) מבוצעות מן cisterna magna של חולדות מורדמות, ללא צורך בחתך. הביופסיה הנוזלית מעורבבת עם מדיום תרבית NSC וניתן לשמור אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצפייה.

Protocol

הליכי גידול, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986, שאושר על ידי משרד הפנים, ועם הצו הנשיאותי 56/2013 של הרפובליקה ההלנית, שנבחן על ידי גופי רווחת בעלי החיים והביקורת האתית של אוניברסיטאות קיימברידג 'ופטרס, וכן אושר ונבדק על ידי הוועדה המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מספר פרוטוקול: 5675/39/18-01-2021). נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley, Wistar ו-Long-Evans, שגילן נע בין חודשיים לארבעה חודשים ומשקלי הגוף שלהן בין 150 גרם ל-250 גרם. הפרוטוקול מסוכם באופן גרפי באיור 1.

1. שחרור הכנת קוקטייל

הערה: יש להכין טרי ביום ההליך ולשמור על קרח. הכמויות ניתנות לכל 2 μL שיוזרקו i.c.v בכל חדר לטרלי. יש להכין 1 מיקרוליטר נוספים לכל זריקה מיועדת.

  1. הכינו 0.5 μL של 500 mU neuraminidase מ Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
    הערה: אחסן אותו כמלאי U/μL 1 מדולל במים סטריליים בטמפרטורה של -20°C. סוגים אחרים של neuraminidases לא נבדקו.
  2. הכינו 1 μL המכיל 1 מיקרוגרם של נוגדן חוסם integrin-β1.
    הערה: אחסן אותו בטמפרטורה של 4°C.
  3. הכינו 0.5 מיקרוליטר המכיל 0.5 מיקרוגרם של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF-בסיסי אנושי רקומביננטי).
    הערה: יש לאחסן אותו כציר של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר מדולל במים סטריליים בטמפרטורה של -20°C.

2. הזרקת קוקטייל שחרור

הערה: ניתן לבצע את התהליך כולו תוך 20 דקות. יש להקפיד לבצע את הניתוח בתנאים אספטיים. נקו את כל המשטחים עם חומר חיטוי (למשל, 3% או 6% מי חמצן). השתמשו בכלים, כפפות, חלוקים ווילונות אוטומטיים או סטריליים בקלות.

  1. מרדימים את חיית הניסוי בשאיפת איזופלורן (2.5% לאינדוקציה ו-2% לתחזוקה). אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הקרנית, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת הגפה האחורית והזנב) ואופן הנשימה.
    הערה: ניתן לבצע הליכים כירורגיים בהרדמה כללית המושרה על ידי הרדמה תוך צפקית (למשל, קטמין [40 מ"ג / ק"ג] וקסילזין [10 מ"ג / ק"ג]). הרדמה עמוקה אושרה על ידי בדיקת רפלקס הקרנית, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת הגפיים האחוריות והזנב) ואופן הנשימה.
  2. מתן שיכוך כאבים תת עורי (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine) עם השראת הרדמה.
  3. הרכיבו את החולדה על המסגרת הסטריאוטקסית.
  4. לגלח את הפרווה של הראש עם סכין גילוח ולנקות את העור עם חיטוי, כגון 10% povidone-יוד פתרון ולאחר מכן אלכוהול. החל את החיטוי שלוש פעמים באמצעות צמר גפן סטרילי. שפשפו בתנועה מעגלית במשך 3-5 שניות בכל פעם. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש.
  5. בצע חתך של 2 ס"מ בעור הראש לאורך קו האמצע באמצעות אזמל סטרילי.
  6. יש לנקות את הגולגולת בקפידה באמצעות מקלונים סטריליים ומלוחים סטריליים.
  7. זהה את הברגמה באמצעות קצה המחט של מזרק המילטון 10 μL המותקן על המכשיר הסטריאוטקסי. הגדר את הברגמה כ"נקודה 0,0".
    הערה: הברגמה מזוהה כנקודת ההצטלבות בין התפרים הסגיטליים והעטרה. פרטים נוספים ניתן למצוא באטלס המוח של החולדות של פקסינוס וווטסון5.
  8. העבר את ההתקן לקואורדינטות anterioposterior (AP) = 0.3 מ"מ, לרוחב (L) = +1.2 מ"מ (כדי לכוון ל-SEZ), או AP = 1.5 מ"מ, L = +2.0 מ"מ (כדי לכוון ל-CC).
  9. קדח חור בור בקוטר 1 מ"מ באמצעות מקדחה דנטלית.
    הערה: בעת קידוח ידני, יש להיזהר שלא לפגוע במשטח קליפת המוח. הדימום לא צפוי להיות משמעותי. נקה כל דם עם מלוחים ולהפעיל לחץ כדי לעצור דימום מתמשך יותר.
  10. לטעון 4 μL של קוקטייל שחרור מזרק 10 μL המילטון.
  11. הורידו את המחט (רצוי קצה קהה או חרוט) של מזרק המילטון על מנת ליצור קשר עם הדורה.
  12. הכנס את המחט בעומק הרצוי (D = 3.5 מ"מ).
    הערה: שפכו מי מלח על פני השטח של הדורה כדי לשמור על הרקמה רוויה.
  13. יש להחדיר 2 μL של קוקטייל השחרור בקצב של 1 μL/min.
  14. השאירו את המחט במקומה עוד 2 דקות לפני שליפה איטית כדי למנוע גלישה של קוקטייל השחרור.
  15. חזור על שלבים 2.8-2.14 עבור חצי הכדור השני בקואורדינטות AP = 0.3 מ"מ, L = -1.2 מ"מ (כדי לכוון לאזור הכלכלי הכלכלי), או AP = 1.5 מ"מ, L = -2.0 מ"מ (כדי לכוון ל-CC).
  16. תפרו את החתך בניילון 5-0 (קוטר 0.1 מ"מ) ונקו את האזור שנתפר בחומר חיטוי.
  17. הסירו את המסכה המספקת את חומר ההרדמה והעבירו את בעל החיים לאזור הניטור שלאחר הניתוח.
    הערה: התאוששות מהרדמה ושמירה על שכיבה צריכה להתרחש תוך 5-10 דקות, והתאוששות מלאה (התנהגות רגילה) תוך 25 דקות.
    1. עקוב מקרוב אחר ההתאוששות (תנועה חיה וללא הפרעה, גישה תכופה למים) בחלל מחומם היטב (24-25 מעלות צלזיוס), שקט ללא מצעים חלקיקים קטנים, שיכולים לחסום את דרכי הנשימה. להחזיר את החיה לחברה של חבריה לכלוב (לא לבעלי חיים חדשים) רק לאחר אישור התאוששות מלאה.
    2. יש לעקוב אחר בעל החיים במתקן התחזוקה במשך 48 שעות לפחות לאחר הניתוח. לטפל בסימני כאב (הסתרת ראש, תנוחת ראש או גוף לא תקינה, רגישות יתר ורגישות יתר לטיפול) על ידי מתן שיכוך כאבים (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine, תת עורית). יש להפנות בעלי חיים עם פרווה דהויה או זקופה לווטרינר האחראי.

3. ביופסיה נוזלית של נוזל מוחי שדרתי (CSF)

הערה: ניתן לבצע את התהליך כולו תוך 10 דקות. הביופסיה הנוזלית המתוארת כאן מבוצעת 3 ימים לאחר הזרקת קוקטייל השחרור אך ניתן לבצעה בדיוק באותו אופן בעת הצורך. יש להקפיד לבצע את הניתוח בתנאים אספטיים. נקו את כל המשטחים עם חומר חיטוי (למשל, 3% או 6% מי חמצן). השתמשו בכלים, כפפות, חלוקים ווילונות אוטומטיים או סטריליים בקלות.

  1. מרדימים את בעל החיים בשאיפת איזופלורן (2.5% לזירוז ו-2% לתחזוקה). לאשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הקרנית
    רפלקס, התגובה לגירויים (בדיקת צביטת גפה אחורית וזנב), ואופן הנשימה.
    הערה: ניתן לבצע את ההליכים הכירורגיים בהרדמה כללית המושרה על ידי הרדמה תוך צפקית (למשל, קטמין [40 מ"ג/ק"ג] וקסילזין [10 מ"ג/ק"ג]). עם זאת, זה לא מומלץ כמו ההליך הוא קצר, במיוחד אם ביופסיות יבוצעו מספר פעמים בימים רצופים.
  2. מתן שיכוך כאבים תת עורי (למשל, 0.3 מ"ג / מ"ל buprenorphine) עם השראת הרדמה.
  3. הרכיבו את חיית הניסוי על המסגרת הסטריאוטקסית. השתמשו במוטות אוזניים כדי לקבע את הראש מבלי להפריע לתנועה הסיבובית לכיוון החלק הקדמי והאחורי.
  4. ייצבו את הראש בזווית של 40 מעלות כלפי מטה, כך שניתן יהיה להשיג הארכה טובה של העורף.
    הערה: אחת הדרכים לעשות זאת היא באמצעות סרגל הפה של המכשיר6.
  5. לגלח את הפרווה באזור הצוואר באמצעות סכין גילוח ולנקות את העור עם חיטוי, כגון 10% פובידון-יוד פתרון ולאחר מכן אלכוהול. החל את החיטוי שלוש פעמים באמצעות צמר גפן סטרילי. שפשפו בתנועה מעגלית במשך 3-5 שניות בכל פעם.
  6. בעזרת קצה האצבע, מצאו את האזור הדיכאוני בצורת מעוין הממוקם בין הבליטה העורפית לעמוד השדרה של האטלס6.
  7. ציירו סימן נקודה (למשל, באמצעות סמן).
  8. תקן מזרק 1 מ"ל או 0.5 מ"ל על המסגרת הסטריאוטקסית.
    הערה: מומלץ להשתמש מזרקים עם מחטים שאינן ניתנות להסרה מכיוון שהם מייצרים יניקה טובה יותר ויש להם פחות נפח מת.
  9. הביאו את המחט בנקודת המגע עם העור בנקודת הנקודה.
  10. בעזרת זוג מלקחיים, הרימו את העור תוך הורדת המזרק דרך שכבות העור.
  11. אחזר את הבוכנה מעט כדי ליצור לחץ שלילי במזרק.
  12. הפעל מחדש כדי לטבול את המחט לאט מאוד עד שנוזל (CSF) מופיע במזרק.
  13. ליישב את המחט במיקום זה ולאפשר זרימה איטית של CSF.
    הערה: ניתן להוריד או להגביה מעט את המחט אם זרימת CSF איטית מאוד.
  14. התחל להסיר את CSF באיטיות (בצעדים של 40 μL / min) עד 120 μL.
  15. שלפו לאט את המזרק.
  16. מתן תוך-צפקי של 1 מ"ל של סרום רגיל לתמיכה בחידוש הנוזלים של חיית הניסוי.
  17. מערבבים את הביופסיה הנוזלית (CSF) עם 400 μL של מדיום NSC ושומרים על צינור המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
    הערה: יש לעבד ביופסיות נוזליות תוך 3 שעות אם לא להקפיא.
  18. הסירו את המסכה המספקת את חומר ההרדמה והעבירו את בעל החיים לאזור הניטור שלאחר הניתוח.
    הערה: התאוששות מהרדמה ושמירה על שכיבה צריכה להתרחש תוך 5-10 דקות, והתאוששות מלאה (התנהגות רגילה) תוך 25 דקות.
    1. עקוב מקרוב אחר ההתאוששות (תנועה חיה וללא הפרעה, גישה תכופה למים) בחלל מחומם היטב (24-25 מעלות צלזיוס), שקט ללא מצעים חלקיקים קטנים, שיכולים לחסום את דרכי הנשימה. החזירו את בעל החיים לחברתם של חבריו לכלוב (לא לבעלי חיים חדשים) רק לאחר אישור החלמה מלאה.
    2. יש לעקוב אחר בעל החיים במתקן התחזוקה במשך 48 שעות לפחות לאחר הניתוח. אם נצפים סימני כאב (הסתרת ראש, תנוחת ראש או גוף לא תקינה, רגישות יתר ורגישות יתר לטיפול), יש לבצע שיכוך כאבים (למשל, 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין תת עורית). יש להפנות בעלי חיים עם פרווה דהויה או זקופה לווטרינר האחראי.

4. עיבוד רקמה עבור immunofluorescence

  1. להרדים את החיה על ידי עירוי תוך לבבי של 20 מ"ל של מלוחים קרים כקרח, ואחריו 50 מ"ל של 4% paraformaldehyde קר כקרח (PFA; במי מלח חוצצים פוספט [PBS] של pH = 7.4).
  2. לנתח את רקמת המוח.
    1. להפריד את הראש מהגוף באמצעות מספריים כדי לבצע חתך באזור צוואר הרחם. השתמש במספריים כדי להסיר את העור ולאחר מכן לחתוך את עצם הגולגולת לאורך קו האמצע של קשת, כאשר קצות המספריים מצביעים כלפי מעלה כדי לא לפגוע ברקמת המוח. המטרה היא להמשיך לחתוך ככל האפשר, לעבור את קו האמצע העטרה.
    2. השתמש מלקחיים כדי להסיר את העצמות, החל מן העצמות supraoccipital ואת הקודקוד ולבסוף את העצמות הקדמיות.
    3. ברגע שרקמת המוח נחשפת, השתמשו במלקחיים או במרית כדי להרים אותה מהגולגולת. כדי להקל על כך, לחתוך את העצבים בבסיס המוח ואת נורות הריח, אם לא רצוי.
  3. לאחר לתקן את הרקמה לילה ב 2% PFA ב 4 ° C.
  4. Cryo-להגן על הרקמה ב 30% סוכרוז (ב PBS) לפחות 48 שעות ב 4 ° C עד הרקמה שוקעת לתחתית.
  5. להקפיא את הרקמה ב -80 ° C.
  6. חתכו את רקמת המוח לחלקים קורונליים בעובי 14 מיקרומטר בעזרת קריוסטט.
  7. ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 3,7
    1. יש לדגור על המקטעים עם חיץ חוסם (אלבומין בסרום בקר 3% [BSA], 0.1% Triton X-100, ב-PBS) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    2. בצע שליפת אנטיגן (רותח במשך 15 דקות במאגר ציטראט 10 mM, pH = 6.0, באמצעות צנצנות זכוכית).
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אך הכרחי עבור אנטיגנים גרעיניים.
    3. יש להגיע לטמפרטורת החדר ולדגור עם נוגדנים ראשוניים נגד חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), דו-קורטין (Dcx), S100β ו-β-catenin (ראו טבלת חומרים) בחסימת חיץ למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    4. דגירה במשך שעתיים עם נוגדנים משניים ב- PBS עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור צביעה נגדית גרעינית בטמפרטורת החדר (ראה טבלת חומרים).
    5. הרכיבו את הכיסויים.

5. עיבוד תאים מבודדים עבור immunofluorescence

  1. לוחים את התאים ללוחות 96 בארות תואמות מיקרוסקופיה, מצופות בפולי-D-ליזין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
  2. תקן את התאים ב-2% PFA קר כקרח למשך 10 דקות ושטוף 3x עם PBS.
  3. בצע immunofluorescence באמצעות הליכים סטנדרטיים3,7 עבור PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 ו- ID3 (ראה טבלת חומרים).
  4. שמור את התאים PBS + NaN3 (0.1%) ב 4 ° C בחושך.

6. מיקרוסקופיה וניתוח תמונה

  1. צלם תמונות באמצעות אפיפלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי ובצע ספירת תאים באמצעות כלי תוכנה סטנדרטיים לניתוח תמונה, כגון מוני תאים.

תוצאות

שחרור ואיסוף של NSCs
NSCs של SEZ מופרדים מן CSF רק על ידי monolayer של תאים ependymal, אם כי הם נשארים בקשר ישיר עם התוכן החדר באמצעות intercalating mono-ciliated תהליכים 8,9. Neuraminidase פועל באופן ספציפי על תאים ependymal באמצעות מחשוף של שאריות חומצה sialic והוא יכול לגרום denudatio...

Discussion

תאי גזע ותאי אב דלילים יחסית ברקמת המוח של יונקים. בנוסף, NSCs ממוקמים באזורים שאינם נגישים לביופסיות קלות ובטוחות (קירות חדר, היפוקמפוס). לכן, הדרך היחידה לעבוד באופן ניסיוני עם תאים כאלה, עד כה, הייתה הבידוד שלהם לאחר המוות. שיטה המאפשרת איסוף יחיד או חוזר של NSCs ו-OPC מחולדות חיות, הנקראת חליבה,...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים להצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר רפואי פעולה (בריטניה) (GN2291) ל- R.J.M.F. ו- I.K. עבודת המחקר נתמכה גם באופן חלקי (עלויות בעלי חיים ותמיכה ל- D.D) על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (H.F.R.I.) תחת "קול קורא ראשון לפרויקטי מחקר של H.F.R.I לתמיכה בחברי סגל וחוקרים ורכישת מענק ציוד מחקר בעלות גבוהה" (מספר פרויקט: 3395).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibodyBD Biosciences#555002purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)Sigma-Aldrich#N2876Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech#100-18Bkept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL SyringeHamilton#80330Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringesBD biosciences04085-0029 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30MLLAVIPHARM-CASTALIASKU: 5201048131168
BupaqRICHTERPHARMA1021854AF10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and MouseStoelting51500D
Homeothermic Monitoring SystemHarvard Apparatus55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquidVetpharma Animal Health32509/4031
KetamidorRICHTER PHARMASKU: 9004114002531Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, EthilonEthiconD9635Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical TrimmersStoeltingItem:51472
Scalpel blades, sterileSwann MortonAW050
Scopettes Jr.  8-inch SwabsBirchwood Laboratories34-7021-12P
Stereotaxic High Speed DrillForedom1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument KitStoeltingItem: 52189
Xylan 2%Chanelle Pharmaceuticals13764/03/19-5-2004Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopyGreiner#655866Screen star microplate
B27 supplementThermoFisher ScientificA1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)MerckP06-1391100Fraction V, heat shock
CitrateMerck71497Sodium citrate monobasic
CryostatLeicaCM1510S
DAPIMerck, Calbiochem28718-90-3Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEMThermoFisher Scientific11995065High glucose, pyruvate
donkey anti-goatBiotium20016 or 20106 or 20048Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouseBiotium20014 or 20105 or 20046Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbitBiotium20015 or 20098 or 20047Dilution: 1/1,000
EGFPeprotech315-09
FGF-2 (or bFGF)Peprotech100-18B
goat anti-GFAPAbcamab53554Dilution: 1/500
goat anti-SOX2Santa Cruz Biotecnologysc-17320Dilution: 1/200
mouse anti-ID3Santa Cruz Biotecnologysc-56712Dilution: 1/200
mouse anti-S100βSigmaS2532Dilution: 1/200
MowiolMerck, Calbiochem475904Mounting medium
N2 supplementThermoFisher Scientific17502048
ParafolmadehydeMerck158127
Poly-D-LysineMerck, MilliporeA-003-ESolution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)Abcamab18723Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRαAbcamab51875Dilution: 1/200
rabbit anti-β- cateninAbcamab16051Dilution: 1/500
Triton X-100MerckX100
Microscopy and image analysis
Confocal microscopeLeicaSP6 and SP8
Image analysisNIH, USAImageJ
Image analysisLeicaLasX

References

  1. Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
  2. Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
  3. Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
  4. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
  5. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
  6. Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
  7. McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
  8. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
  9. Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
  10. Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
  11. Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
  12. Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
  13. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
  14. Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
  15. Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
  16. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  17. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  18. Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
  19. Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  20. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
  21. Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved