Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Zusammenfassung

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Zusammenfassung

Gewebespezifische neurale Stammzellen (NSCs) bleiben im postnatalen Gehirn von Säugetieren aktiv. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen, wo sie neue Neuronen und Gliazellen erzeugen. Eine solche Nische ist die subependymale Zone (SEZ; auch ventrikulär-subventrikuläre Zone genannt), die sich quer über die lateralen Wände der lateralen Ventrikel neben der ependymalen Zellschicht befindet. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind reichlich im zentralen Nervensystem verteilt und bilden einen Pool proliferativer Vorläuferzellen, die Oligodendrozyten erzeugen können.

Sowohl NSCs als auch OPCs weisen ein Selbsterneuerungspotenzial und Ruhe-/Aktivierungszyklen auf. Aufgrund ihrer Lage erfolgt die Isolierung und experimentelle Untersuchung dieser Zellen postmortal. Hier beschreiben wir ausführlich das "Brain Milking", eine Methode zur Isolierung von NSCs und OPCs, unter anderem von Zellen, aus lebenden Tieren. Dabei handelt es sich um ein zweistufiges Protokoll, das für den Einsatz bei Nagetieren entwickelt und an Ratten getestet wurde. Zunächst werden die Zellen durch stereotaktische intrazerebroventrikuläre (i.c.v.) Injektion eines "Freisetzungscocktails" aus dem Gewebe "freigesetzt". Die Hauptbestandteile sind die Neuraminidase, die auf Ependymzellen abzielt und die Denudation der Ventrikelwand induziert, ein Integrin-β1-blockierender Antikörper und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. In einem zweiten Schritt der "Entnahme" werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis aus der Cisterna magna durchgeführt, bei anästhesierten Ratten, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass isolierte Zellen ihr endogenes Profil beibehalten und dass NSCs der Sonderwirtschaftszone ihre Ruhe bewahren. Die Denudation der Ependymschicht ist auf die anatomische Ebene der Injektion beschränkt und das Protokoll (Freisetzung und Entnahme) wird von den Tieren gut vertragen. Dieser neuartige Ansatz ebnet den Weg für die Durchführung von Längsschnittstudien zur endogenen Neurogenese und Gliogenese bei Versuchstieren.

Einleitung

Gewebespezifische Stammzellen sind teilweise gebundene Zellen, aus denen alle Zellpopulationen hervorgehen können, aus denen die jeweiligen Gewebe bestehen. Abgesehen davon, dass sie multipotent sind, sind sie selbsterneuernde Zellen und entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Regenerationsfähigkeit von Geweben¹. Einige gewebespezifische Stammzellen verbleiben in einem aktiven, stark proliferativen Zustand, wie z. B. intestinale oder hämatopoetische Stammzellen. Andere, wie z. B. Hirnstammzellen, bleiben weitgehend ruhend oder ruhend². Im erwachsenen Gehirn befinden sich neurale Stammzellen (NSCs) i....

Protokoll

Die Zucht-, Pflege- und Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt, der vom Innenministerium genehmigt wurde, und mit dem Präsidialdekret 56/2013 der Hellenischen Republik, das von den Tierschutz- und Ethikprüfungsgremien der Universitäten Cambridge und Patras sowie vom örtlichen Präfekturausschuss für Tierpflege und -verwendung genehmigt und geprüft wurde (Protokollnummer: 5675/39/18-01-2021). Es wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-, Wistar- und Long-Evans-Ratten mit einem Alter zwischen 2 und 4 Monaten und einem Körpergewicht zwischen 150 g und 250 g verwendet. Das Protokoll ist in

Diskussion

Stamm- und Vorläuferzellen sind im Hirngewebe von Säugetieren relativ spärlich. Darüber hinaus befinden sich NSCs in Bereichen, die für einfache und sichere Biopsien unzugänglich sind (Ventrikelwände, Hippocampus). Daher war die einzige Möglichkeit, mit solchen Zellen experimentell zu arbeiten, bisher ihre postmortale Isolierung. Eine Methode, die die einmalige oder wiederholte Entnahme von NSCs und OPCs von lebenden Ratten ermöglicht, das sogenannte Melken, wird hier Schritt für Schritt beschrieben. Die Method.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX