La méthode de « traite cérébrale » pour l’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes provenant de rats vivants

Résumé

Une méthode d’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes à partir du cerveau de rats vivants est présentée ici en détail expérimental. Il permet de multiples prélèvements de ces cellules chez les mêmes animaux sans compromettre leur bien-être.

Résumé

Les cellules souches neurales (CSN) spécifiques aux tissus restent actives dans le cerveau postnatal des mammifères. Ils résident dans des niches spécialisées, où ils génèrent de nouveaux neurones et des cellules gliales. L’une de ces niches est la zone sous-épendymaire (ZES, également appelée zone ventriculaire-sous-ventriculaire), qui est située à travers les parois latérales des ventricules latéraux, adjacentes à la couche de cellules épendymaires. Les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) sont abondamment réparties dans tout le système nerveux central, constituant un pool de cellules progénitrices prolifératives capables de générer des oligodendrocytes.

Les NSC et les OPC présentent tous deux un potentiel d’auto-renouvellement et des cycles de quiescence/activation. En raison de leur emplacement, l’isolement et l’investigation expérimentale de ces cellules sont effectués post-mortem. Nous décrivons ici en détail la « traite cérébrale », une méthode d’isolement des NSC et des OPCs, entre autres cellules, à partir d’animaux vivants. Il s’agit d’un protocole en deux étapes conçu pour être utilisé chez les rongeurs et testé chez les rats. Tout d’abord, les cellules sont « libérées » du tissu par injection intra-intra-ventriculaire stéréotaxique (i.c.v.) d’un « cocktail de libération ». Les principaux composants sont la neuraminidase, qui cible les cellules épendymaires et induit la dénudation de la paroi ventriculaire, un anticorps bloquant l’intégrine-β1, et le facteur de croissance des fibroblastes-2. Lors d’une deuxième étape de « prélèvement », des biopsies liquides du liquide céphalorachidien sont réalisées à partir de la citerne magna, chez des rats anesthésiés sans avoir besoin d’une incision.

Les résultats présentés ici montrent que les cellules isolées conservent leur profil endogène et que les CSN de la ZES préservent leur quiescence. La dénudation de la couche épendymaire est limitée au niveau anatomique de l’injection et le protocole (libération et prélèvement) est bien toléré par les animaux. Cette nouvelle approche ouvre la voie à la réalisation d’études longitudinales de la neurogenèse endogène et de la gliogenèse chez les animaux de laboratoire.

Introduction

Les cellules souches tissulaires spécifiques sont des cellules partiellement engagées qui peuvent donner naissance à toutes les populations cellulaires qui constituent les tissus respectifs. En plus d’être multipotentes, ce sont des cellules auto-renouvelables et cruciales pour le maintien de l’homéostasie et de la capacité de régénération des tissus¹. Certaines cellules souches tissulaires restent actives et fortement prolifératives, comme les cellules souches intestinales ou hématopoïétiques. D’autres, comme les cellules souches cérébrales, restent en grande partie au repos ou dormantes². Dans le cerveau adulte, les ce....

Protocole

Les procédures d’élevage, d’entretien et d’expérimentation des animaux ont été menées conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques), autorisée par le ministère de l’Intérieur, et au décret présidentiel 56/2013 de la République hellénique, examinées par les organismes de bien-être animal et d’éthique des universités de Cambridge et de Patras, ainsi qu’approuvées et examinées par le comité préfectoral local de protection et d’utilisation des animaux (numéro de protocole : 5675/39/18-01-2021). Des rats Sprague-Dawley, Wistar et Long-Evans mâles et femelles, âgés de 2 à 4 mois et pesant entre 150 g et 250 g, ont été utilisés. Le pro....

Discussion

Les cellules souches et progénitrices sont relativement rares dans les tissus cérébraux des mammifères. De plus, les CSN sont situés dans des zones inaccessibles pour des biopsies faciles et sûres (parois ventriculaires, hippocampe). Par conséquent, la seule façon de travailler expérimentalement avec de telles cellules, jusqu’à présent, a été leur isolement post-mortem. Une méthode permettant la collecte unique ou répétée de NSC et d’OPC sur des rats vivants, appelée traite, est décrite ici étape .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Release cocktail
β1-integrin-blocking antibody	BD Biosciences	#555002	purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.
Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C
Surgical procedures
10 µL Syringe	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2
BD Micro-fine 1 mL insulin syringes	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU: 5201048131168
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Homeothermic Monitoring System	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU: 9004114002531	Ketamine 100 mg/mL
Nylon suture, Ethilon	Ethicon	D9635	Clear , size 5-0
Rechargeable Cordless Surgical Trimmers	Stoelting	Item:51472
Scalpel blades, sterile	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-inch Swabs	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaxic High Speed Drill	Foredom	1474w/o1464
Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xylazine, 25 mL
Tissue and cells handling and immunostainings
96-well plates appropriate for microscopy	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	A1486701
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraction V, heat shock
Citrate	Merck	71497	Sodium citrate monobasic
Cryostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nuclear staining, Dilution: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	High glucose, pyruvate
donkey anti-goat	Biotium	20016 or 20106 or 20048	Dilution: 1/1,000
donkey anti-mouse	Biotium	20014 or 20105 or 20046	Dilution: 1/1,000
donkey anti-rabbit	Biotium	20015 or 20098 or 20047	Dilution: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (or bFGF)	Peprotech	100-18B
goat anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilution: 1/500
goat anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilution: 1/200
mouse anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilution: 1/200
mouse anti-S100β	Sigma	S2532	Dilution: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Mounting medium
N2 supplement	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poly-D-Lysine	Merck, Millipore	A-003-E	Solution, 1.0 mg/mL
rabbit anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilution: 1/500
rabbit anti-PDGFRα	Abcam	ab51875	Dilution: 1/200
rabbit anti-β- catenin	Abcam	ab16051	Dilution: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopy and image analysis
Confocal microscope	Leica	SP6 and SP8
Image analysis	NIH, USA	ImageJ
Image analysis	Leica	LasX