A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.
القلب النامي هو هيكل معقد يحتوي على خلايا سلفية مختلفة تتحكم فيها آليات تنظيمية معقدة. يسمح فحص التعبير الجيني وحالة الكروماتين للخلايا الفردية بتحديد نوع الخلية وحالتها. كشفت مناهج تسلسل الخلية الواحدة عن عدد من الخصائص المهمة لعدم تجانس الخلايا السلفية القلبية. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرق بشكل عام على الأنسجة الطازجة ، مما يحد من الدراسات ذات الظروف التجريبية المتنوعة ، حيث يجب معالجة الأنسجة الطازجة مرة واحدة في نفس الجري لتقليل التباين التقني. لذلك ، هناك حاجة إلى إجراءات سهلة ومرنة لإنتاج البيانات من طرق مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) في هذا المجال. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى بسرعة للنواة المزدوجة أحادية النوى اللاحقة (الجمع بين snRNA-seq و snATAC-seq). تسمح هذه الطريقة بعزل النوى من العينات المجمدة للخلايا السلفية القلبية ويمكن دمجها مع المنصات التي تستخدم غرف الموائع الدقيقة.
من بين العيوب الخلقية ، عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي الأكثر شيوعا ، وتحدث في حوالي 1٪ من المواليد الأحياء كلعام 1,2. يتم تحديد الطفرات الجينية في أقلية فقط من الحالات ، مما يعني أن الأسباب الأخرى ، مثل التشوهات في تنظيم الجينات ، متورطة في مسببات أمراض القلبالتاجية 2,3. تطور القلب هو عملية معقدة من أنواع الخلايا المتنوعة والمتفاعلة ، مما يجعل تحديد الطفرات السببية غير المشفرة وتأثيراتها على تنظيم الجينات أمرا صعبا. يبدأ تكوين الأعضاء في القلب بالسلف الخلوي الذي يؤدي إلى ظهور أنواع فرعية مختلفة من خلايا القلب ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب والخلايا الليف....
تمت الموافقة على الإجراء الحيواني المعتمد في هذه الدراسة من قبل لجان أخلاقيات الحيوان بجامعة إيكس مرسيليا (C2EA-14) وتم تنفيذه وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية الوطنية المعينة للتجارب على الحيوانات (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; تفويض Apafis رقم 33927-2021111715507212).
1. إعداد التزاوج الموقوت قبل التشريح
بالمقارنة مع إعداد معلقات أحادية الخلية لنهج الخلية الواحدة ، فإن إعداد معلقات أحادية النوى أكثر صعوبة ويتطلب درجة أعلى من الدقة والمعالجة. العامل الرئيسي لنجاح snRNA-seq و snATAC-seq هو تعليق نوى نظيف وسليم. يجب تكييف بروتوكول عزل النوى الفعال مع كل نوع من الأنسجة وحالتها (طازجة أو مجمدة). هنا ، يت?.......
يوفر تحليل التركيب الخلوي للقلب النامي من خلال دراسات snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة فهما أعمق لأصل أمراض القلب الخلقية26. درست العديد من مختبرات الأبحاث آثار حفظ أنسجة القلب بالتبريد على snRNA-seq27. يمكن أن يكون إجراء snRNA-seq و snATAC-seq باستخدام أنسجة تشريح دقيقة جديدة من نماذج الفئ.......
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا البحث من قبل ERA-CVD-2019 و ANR-JCJC-2020 إلى SS. نشكر مرفق علم الجينوم والمعلوماتية الحيوية (GBiM) من مختبر U 1251 / Marseille Medical Genetics والمراجعين المجهولين على تقديم تعليقات قيمة.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ISSN 2578-2746
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.