JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.

Abstract

القلب النامي هو هيكل معقد يحتوي على خلايا سلفية مختلفة تتحكم فيها آليات تنظيمية معقدة. يسمح فحص التعبير الجيني وحالة الكروماتين للخلايا الفردية بتحديد نوع الخلية وحالتها. كشفت مناهج تسلسل الخلية الواحدة عن عدد من الخصائص المهمة لعدم تجانس الخلايا السلفية القلبية. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرق بشكل عام على الأنسجة الطازجة ، مما يحد من الدراسات ذات الظروف التجريبية المتنوعة ، حيث يجب معالجة الأنسجة الطازجة مرة واحدة في نفس الجري لتقليل التباين التقني. لذلك ، هناك حاجة إلى إجراءات سهلة ومرنة لإنتاج البيانات من طرق مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) في هذا المجال. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى بسرعة للنواة المزدوجة أحادية النوى اللاحقة (الجمع بين snRNA-seq و snATAC-seq). تسمح هذه الطريقة بعزل النوى من العينات المجمدة للخلايا السلفية القلبية ويمكن دمجها مع المنصات التي تستخدم غرف الموائع الدقيقة.

Introduction

من بين العيوب الخلقية ، عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي الأكثر شيوعا ، وتحدث في حوالي 1٪ من المواليد الأحياء كلعام 1,2. يتم تحديد الطفرات الجينية في أقلية فقط من الحالات ، مما يعني أن الأسباب الأخرى ، مثل التشوهات في تنظيم الجينات ، متورطة في مسببات أمراض القلبالتاجية 2,3. تطور القلب هو عملية معقدة من أنواع الخلايا المتنوعة والمتفاعلة ، مما يجعل تحديد الطفرات السببية غير المشفرة وتأثيراتها على تنظيم الجينات أمرا صعبا. يبدأ تكوين الأعضاء في القلب بالسلف الخلوي الذي يؤدي إلى ظهور أنواع فرعية مختلفة من خلايا القلب ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب والخلايا الليفية وخلايا القلب والشغاف 4,5. يظهر علم الجينوم أحادي الخلية كطريقة رئيسية لدراسة نمو القلب وتقييم تأثير عدم التجانس الخلوي في الصحة والمرض6. سهل تطوير طرق متعددة الأوميكس للقياس المتزامن للمعلمات المختلفة وتوسيع خطوط الأنابيب الحسابية اكتشاف أنواع الخلايا والأنواع الفرعية في القلب الطبيعي والمريض6. توضح هذه المقالة بروتوكول عزل أحادي النواة موثوق به للخلايا السلفية القلبية المجمدة التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران المتوافقة مع snRNA-seq و snATAC-seq (بالإضافة إلى snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة)7،8،9.

ATAC-seq هي طريقة قوية تسمح بتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة التنظيمية ووضع النيوكليوسومات10,11. تستخدم هذه المعلومات لاستخلاص استنتاجات حول موقع عوامل النسخ وهويتها ونشاطها. وبالتالي ، يمكن تحليل نشاط عوامل الكروماتين ، بما في ذلك أجهزة إعادة التشكيل ، وكذلك نشاط النسخ لبوليميراز الحمض النووي الريبي ، لأن الطريقة حساسة للغاية لقياس التغيرات الكمية في بنية الكروماتين 1,2. وبالتالي ، يوفر ATAC-seq نهجا قويا ومحايدا للكشف عن الآليات التي تتحكم في تنظيم النسخ في نوع معين من الخلايا. كما تم التحقق من صحة بروتوكولات ATAC-seq لقياس إمكانية الوصول إلى الكروماتين في الخلايا المفردة ، مما يكشف عن التباين في بنية الكروماتين داخل مجموعات الخلايا10،12،13.

على الرغم من حدوث تقدم ملحوظ في مجال الخلايا المفردة في السنوات الأخيرة ، إلا أن الصعوبة الرئيسية تكمن في معالجة العينات الجديدة اللازمة لإجراء هذه التجارب14. للتحايل على هذه الصعوبة ، تم إجراء اختبارات مختلفة بهدف إجراء تحليلات مثل snRNA-seq و snATAC-seq مع أنسجة أو خلايا القلب المجمدة15,16.

تم استخدام العديد من المنصات لتحليل بيانات الجينوم أحادية الخلية17. المنصات المستخدمة على نطاق واسع للتعبير الجيني أحادي الخلية وتنميط ATAC هي منصات لتغليف قطرات الموائع الدقيقةالمتعددة 17. نظرا لأن هذه المنصات تستخدم غرف الموائع الدقيقة ، يمكن للحطام أو الركام أن يسد النظام ، مما يؤدي إلى بيانات غير قابلة للاستخدام. وبالتالي ، فإن نجاح دراسات الخلية الواحدة يعتمد على العزل الدقيق للخلايا / النوى الفردية.

يستخدم البروتوكول المقدم هنا نهجا مشابها للدراسات الحديثة باستخدام snRNA-seq و snATAC-seq لفهم عيوب القلب الخلقية18،19،20،21،22،23. يستخدم هذا الإجراء التفكك الأنزيمي لأنسجة القلب التي تم تشريحها حديثا متبوعا بالحفظ بالتبريد للخلايا السلفية القلبية للفئران. بعد ذوبان الجليد ، يتم تنقية الخلايا القابلة للحياة ومعالجتها للعزل النووي. في هذا العمل ، تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للحصول على بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من نفس التحضير النووي للخلايا السلفية القلبية للفأر.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراء الحيواني المعتمد في هذه الدراسة من قبل لجان أخلاقيات الحيوان بجامعة إيكس مرسيليا (C2EA-14) وتم تنفيذه وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية الوطنية المعينة للتجارب على الحيوانات (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; تفويض Apafis رقم 33927-2021111715507212).

1. إعداد التزاوج الموقوت قبل التشريح

  1. لتوليد أجنة الفئران ، قم بإجراء تزاوج محدد الوقت بين الفئران البالغة قبل 9.5 أيام من عزل منطقة القلب. في هذا الإجراء ، تم استخدام الفئران من النوع البري C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 2-6 أشهر ، وتم إجراء التزاوج الموقوت بين عشية وضحاها.
  2. في صباح اليوم التالي ، تحقق مما إذا كانت الفئران الإناث لديها سدادة مهبلية. ضع في اعتبارك اليوم الذي يتم فيه تحديد القابس على أنه يوم جنيني (E) 0.5.

2. تحضير الأنسجة وعزل الخلايا

  1. القتل الرحيم للإناث الحوامل C57BL / 6J البالغة من العمر 2-6 أشهر في اليوم 9.5 بعد الحمل عبر ثاني أكسيد الكربون2 مع تركيز متزايد يليه خلع عنق الرحم. تنظيف الجزء السفلي من البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.
    ملاحظة: لا ينصح باستخدام التخدير قبل خلع عنق الرحم لأن هذا من شأنه أن يعرض الأجنة للتغيرات البيئية التي يمكن أن تؤثر على الدراسات النسخية وفوق الجينية اللاحقة.
  2. افتح البطن والبريتوني بالمقص. تصور قرون الرحم ، واستخدام ملقط لاستئصال كلا القرنين.
  3. ضع القرون في طبق بتري يحتوي على وسط بارد كامل مع 1٪ FBS. على الرغم من عدم الحاجة إلى حجم محدد ، يجب توخي الحذر لضمان غمر الأجنة تماما في الوسط. حجم تقريبي من 10 مل لكل طبق بتري 10 سم مناسب.
  4. تحت المجهر المجسم المحدد عند التكبير 5x واستخدام الملقط ، قم بإزالة أنسجة بطانة الرحم والمشيمة وكيس الصفار من كل جنين.
  5. ضع الأجنة في طبق بتري مع وسط كامل بارد مع 1٪ FBS. تشريح منطقة القلب الجنينية ، كما هو موضح في الجنين التخطيطي الموضح في الشكل 1 ، في وسط كامل بارد.
  6. تجمع معا مناطق القلب التي تم تشريحها من خمسة أجنة فئران في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي دلو التأرجح Prechill إلى 4 °C.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 300× ز لمدة 1 دقيقة في RT في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح. إزالة طاف ، وغسل الأنسجة عن طريق إضافة 1 مل من PBS درجة زراعة الأنسجة.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 1 دقيقة في RT. قم بإزالة المادة الطافية ، وكرر خطوات الغسيل لما مجموعه غسلتين. كرر الغسيل مرتين ، مع استبدال PBS ب 0.05٪ تربسين / EDTA (1x).
  9. لهضم الأنسجة، أضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين/إيديتا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ضع تفككا ميكانيكيا لطيفا بعد 5 دقائق عن طريق الإيماءات لأعلى ولأسفل باستخدام طرف مرشح واسع الفتحة.
  10. قم بتعطيل نشاط هضم التربسين عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الخلايا المنفصلة. مرر الخلايا المعاد تعليقها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.

3. عد الخلايا وتقييم الجدوى

ملاحظة: يعد عدد الخلايا وقابليتها للحياة معلمات حاسمة لنجاح تجارب الخلية الواحدة. نهج snATAC-seq حساس للاختلافات الطفيفة في رقم الخلية. يؤدي عدد قليل جدا من الخلايا إلى الإفراط في هضم الكروماتين ، مما يؤدي إلى عدد أكبر من القراءات ورسم خرائط لمناطق الكروماتين التي يتعذر الوصول إليها (الضوضاء). وبالمثل ، فإن وجود عدد كبير جدا من الخلايا يولد شظايا عالية الوزن الجزيئي يصعب تسلسلها. من أجل التحديد الدقيق لتركيزات الخلية والنوى ، تم تقييم عدد الخلايا وصلاحيتها بطريقتين مختلفتين.

  1. قم بإجراء اختبار التريبان الأزرق لعد الخلايا ، كما هو موضح أدناه.
    1. دوامة 0.4٪ محلول تلطيخ أزرق تريبان ، تدور لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة عند 2000 × جم ، وتنقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب صغير.
    2. باستخدام ماصة ، امزج تعليق الخلية ، وأضف 10 ميكرولتر من التعليق إلى 10 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق المقتبس بالفعل. تخلط بعناية 10 مرات مع ماصة.
    3. نقل 10 ميكرولتر من الخلايا الملطخة إلى شريحة العد. ضع الشريحة في العداد لحساب تركيز الخلية وصلاحيتها تلقائيا.
  2. قم بإجراء تقييم قائم على التألق للوفيات كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يعتمد هذا الفحص على استخدام الأصباغ الفلورية (ethidium homodimer-1 و EthD-1 و calcein AM) لتقييم صلاحية الخلية. واستخدمت مجموعة أدوات متاحة تجاريا، واتبعت تعليمات مقدم الخدمة من أجل الإعداد والاستخدام المناسبين.
    1. قم بإعداد محلول EthD-1 10 ميكرومتر عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من محلول مخزون EthD-1 2 mM المزود إلى 1 مل من D-PBS من درجة زراعة الأنسجة المعقمة ، ودوامة لمدة 5 ثوان لضمان الخلط الكامل.
    2. انقل 2.5 ميكرولتر من محلول مخزون الكالسيين AM 4 مللي متر المزود إلى محلول EthD-1 المعد بالفعل. دوامة لمدة 5 ثوان لضمان الخلط الكامل.
    3. أضف 10 ميكرولتر من محلول العمل الناتج 10 ميكرومتر EthD-1 و 10 ميكرومتر Calcein AM إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
      ملاحظة: الكالسيين شديد التأثر بالتحلل المائي في المحاليل المائية ، لذلك استخدم محلول العمل هذا في غضون 1 يوم.
    4. انقل 10 ميكرولتر من الخلايا الملطخة إلى شريحة العد. أدخل الشريحة في عداد الخلايا الفلورية الآلي. عد الخلايا الحية باستخدام مرشح GFP والخلايا الميتة باستخدام مرشح RFP.
      ملاحظة: أعطت طريقتا العد عددا مماثلا للخلايا وقابلية للحياة ، وقدر العدد الإجمالي للخلايا المنفصلة حديثا بحوالي 20000 خلية لكل منطقة قلب جنينية (0.06 مم3).

4. تجميد الخلايا

  1. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون لمس قاع الأنبوب ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط التجميد المبرد.
  2. انقل تعليق الخلية إلى كريوفيال مبرد مسبقا ، وضع المبرد في وعاء تجميد مبرد مسبقا.
  3. ضع الحاوية في -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات إلى 8 ساعات. نقل cryovial إلى النيتروجين السائل لتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة و ATAC.
    ملاحظة: يجب نقل المبرد على الثلج الجاف قبل الاستخدام. في تجربتنا ، يمكن تخزين الخلايا في النيتروجين السائل لمدة 6 أشهر على الأقل دون فقدان صلاحية الخلية. يجب أن تبقى درجة حرارة التخزين أقل من -150 درجة مئوية في جميع الأوقات لمنع تكوين بلورات الثلج.

5. ذوبان الخلايا وإزالة الخلايا الميتة

  1. ضع الكريوفيال في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة. قم بإزالته عندما تبقى بلورة صغيرة في cryovial.
  2. أضف 1 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). تخلط مع ماصة ثلاث مرات. انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من الوسط الكامل الدافئ.
  3. مرر تعليق الخلية بالكامل على مصفاة 30 ميكرومتر. شطف مصفاة مع 1-2 مل من وسط كامل دافئ ، وجمع التدفق في نفس الأنبوب المخروطي.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، وإزالة طاف. اغسل مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية دون تعطيل بيليه الخلية.
  6. أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات المغناطيسية المتوفرة إلى الخلايا المحببة ، وقم بالتجانس خمس مرات باستخدام طرف ماصة عريض التجويف. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  7. في غضون ذلك ، شطف عمود الفصل المغناطيسي (السعة: 1 × 107 إلى 2 × 108 خلايا) مع 500 ميكرولتر من 1x عازلة ملزمة.
  8. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بتخفيف تعليق الخلية الذي يحتوي على الميكروبيدات ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1x.
  9. ضع تعليق الخلية (0.6 ميكرولتر) على عمود الفصل المغناطيسي المعد. التدفق من خلال هو جزء الخلية الحية المختار سالبا ، والجزء المحتفظ به مغناطيسيا هو الخلايا الميتة المختارة بشكل إيجابي.
  10. اجمع النفايات السائلة للخلايا الحية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اشطف الأنبوب الصغير سعة 1.5 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية والعمود ب 2 مل من المخزن المؤقت للربط 1x ، واجمع النفايات السائلة في نفس الأنبوب سعة 15 مل.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الخلية.
  12. أضف 1 مل من محلول PBS-BSA ، واخلطه برفق عن طريق سحب خمس مرات باستخدام طرف ماصة عريض الفتحة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
  13. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الخلية.
  14. أضف 1 مل من PBS-BSA لإعادة تعليق الحبيبات ، وكرر خطوة الغسيل لما مجموعه غسلتين.
  15. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول PBS-BSA. تخلط برفق عن طريق سحب الماصة 10 مرات.
  16. تحديد تركيز الخلايا وصلاحيتها باستخدام الطرق الموصوفة سابقا (الخطوة 3.1 والخطوة 3.2). للمتابعة إلى الخطوة التالية ، تأكد من أن عدد الخلايا يبلغ ≥100000 خلية. انظر الشكل 2 للاطلاع على النتائج التمثيلية.
    ملاحظة: يؤدي الحفظ بالتبريد إلى فقدان ما يقرب من 40٪ من المواد الأولية الأولية للخلايا الحية. اعتمادا على عدد الخلايا الأولية ، يؤدي فصل الخرزة على عمود مغناطيسي إلى قابلية عالية للبقاء للخلية ولكنه يقسم العدد الإجمالي للخلايا بمقدار ضعفين إلى خمسة أضعاف. ينصح باستخدام مجموعة مغناطيسية قائمة على العمود لإزالة الخلايا الميتة فقط عند توفر مواد أولية كافية.

6. عزل النوى

ملاحظة: يتم تنفيذ snATAC و snRNA-seq مجتمعة مع تعليق نوى نظيفة وسليمة. يوصى بتحسين ظروف التحلل (وقت التحلل وتركيز NP40) لنوع الخلية المستخدم. النقطة الزمنية المثلى للتحلل وتركيز المنظفات هي تلك التي تؤدي إلى تحليل أكبر عدد ممكن من الخلايا دون تعطيل التشكل النووي. يمكن تقليل فقدان الخلايا / النوى باستخدام جهاز طرد مركزي دلو متأرجح بدلا من جهاز طرد مركزي ثابت الزاوية. لتقليل احتباس النوى على البلاستيك ، يوصى باستخدام أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظ وأنابيب الطرد المركزي. هذا يمكن أن يزيد من استعادة النوى. يعد طلاء أطراف الماصة وأنابيب الطرد المركزي بنسبة 5٪ BSA بديلا أقل تكلفة ولكنه يستغرق وقتا طويلا.

  1. نظف مكان العمل والمواد باستخدام 70٪ من الإيثانول ومحلول إزالة RNase.
  2. أجهزة الطرد المركزي دلو التأرجح Prechill إلى 4 °C. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل حديثا ، والمخزن المؤقت لتخفيف التحلل ، والمخزن المؤقت للتحلل 0.1x ، والمخزن المؤقت للغسيل (انظر الجدول 1). الحفاظ على المخازن المؤقتة على الجليد.
  3. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. قم بإزالة كل المادة الطافية برفق دون لمس قاع الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات الخلية.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل المبرد 0.1x. تخلط بلطف عن طريق سحب 10 مرات. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
  5. أضف 1 مل من محلول الغسيل المبرد ، واخلطه برفق عن طريق السحب خمس مرات. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل حبيبات النوى.
  6. كرر الغسلات باستخدام عازل غسيل مبرد لما مجموعه ثلاث غسلات. تحضير العازلة نوى مخففة. بعد التعليق ، احتفظ بمحلول مخزون النوى على الجليد.

7. تقييمات الجودة والكمية للنوى المعزولة

ملاحظة: استنادا إلى العدد الأولي للخلايا وتقدير فقدان النوى بنسبة 50٪ تقريبا أثناء تحلل الخلية، أعد تعليق العدد المناسب من الخلايا في المخزن المؤقت للنوى المخففة على البارد. يعتمد حساب حجم إعادة التعليق باستخدام المخزن المؤقت للنوى المخففة المبردة على استعادة النوى المستهدفة وتركيزات مخزون النوى المقابلة الموصى بها في دليل مستخدم الشركة المصنعة. انظر مثالا على هذا الحساب في البروتوكول التكميلي 1.

  1. استنادا إلى عدد الخلايا الأولي وتقدير ما يقرب من 50٪ من فقدان النوى أثناء تحلل الخلية ، أعد تعليق العدد المناسب من الخلايا في المخزن المؤقت للنوى المخففة على البارد.
  2. تحديد تركيز النوى الفعلي. امزج 2 ميكرولتر من محلول مخزون النوى مع 8 ميكرولتر من محلول النوى المخفف وأضف المزيج إلى 10 ميكرولتر من محلول العمل الأزرق المريبان أو EthD-1 / calceinAM. عد النوى باستخدام عداد خلية آلي. أقل من 5٪ من الخلايا يجب أن تكون قابلة للحياة. انظر الشكل 3 للاطلاع على النتائج التمثيلية.
  3. احسب حجم مخزون النوى وحجم المخزن المؤقت للنوى المخففة للحصول على حجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر عند التركيز الموصى به لتفاعل التبديل (راجع دليل مستخدم الشركة المصنعة). انتقل فورا إلى تفاعل التحويل وفقا لدليل المستخدم17.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات من تفاعل التحويل إلى إنشاء مكتبات ATAC و GEX وفقا لدليل المستخدم للمجموعة المستخدمة في snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة17.

8. تحليل جودة مكتبات snRNA-seq و snATAC-seq

  1. قبل الانتقال إلى تسلسل الجيل التالي ، تحقق من صحة توزيع الجودة والحجم لمكتبات snATAC-seq النهائية والتعبير الجيني GEX. تقييم جودة وكمية التسلسلات المحددة في المكتبات باستخدام أنظمة تحليل الشظايا. انظر الشكل 4 للاطلاع على نتائج تقييم الجودة التمثيلية.
    ملاحظة: يجب أن يظهر التتبع النهائي لمكتبات snATAC-seq دورية لف النيوكليوسوم ، ويجب أن تتراوح الأحجام من 200 bp إلى عدة Kbp ، بينما يجب أن تتراوح الأحجام في مكتبة التعبير الجيني من 300 bp إلى 600 bp.

النتائج

بالمقارنة مع إعداد معلقات أحادية الخلية لنهج الخلية الواحدة ، فإن إعداد معلقات أحادية النوى أكثر صعوبة ويتطلب درجة أعلى من الدقة والمعالجة. العامل الرئيسي لنجاح snRNA-seq و snATAC-seq هو تعليق نوى نظيف وسليم. يجب تكييف بروتوكول عزل النوى الفعال مع كل نوع من الأنسجة وحالتها (طازجة أو مجمدة). هنا ، يت?...

Discussion

يوفر تحليل التركيب الخلوي للقلب النامي من خلال دراسات snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة فهما أعمق لأصل أمراض القلب الخلقية26. درست العديد من مختبرات الأبحاث آثار حفظ أنسجة القلب بالتبريد على snRNA-seq27. يمكن أن يكون إجراء snRNA-seq و snATAC-seq باستخدام أنسجة تشريح دقيقة جديدة من نماذج الفئ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل ERA-CVD-2019 و ANR-JCJC-2020 إلى SS. نشكر مرفق علم الجينوم والمعلوماتية الحيوية (GBiM) من مختبر U 1251 / Marseille Medical Genetics والمراجعين المجهولين على تقديم تعليقات قيمة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentNo catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo catalog number
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSNo catalog number

References

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195 snRNA seq snATAC seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved