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要約

ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。

要約

発達中の心臓は、複雑な調節機構によって制御される様々な前駆細胞を含む複雑な構造である。個々の細胞の遺伝子発現とクロマチン状態の検査は、細胞の種類と状態の識別を可能にします。シングルセルシーケンシングアプローチは、心臓前駆細胞の不均一性の多くの重要な特性を明らかにしました。ただし、これらの方法は一般に新鮮な組織に限定されており、技術的なばらつきを減らすために新鮮な組織を同じ実行で一度に処理する必要があるため、多様な実験条件での研究が制限されます。したがって、この分野では、一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、ハイスループットシーケンシングを備えたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンの一核アッセイ(snATAC-seq)などの方法からデータを生成するための簡単で柔軟な手順が必要です。ここでは、後続の単一核デュアルオミクス(snRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)のために核を迅速に分離するためのプロトコルを紹介します。この方法は、心臓前駆細胞の凍結サンプルからの核の単離を可能にし、マイクロ流体チャンバーを使用するプラットフォームと組み合わせることができます。

概要

先天性欠損症の中で、先天性心疾患(CHD)が最も一般的であり、毎年出生の約1%で発生します1,2。遺伝子変異は少数の症例でしか特定されておらず、遺伝子調節の異常などの他の原因がCHD 2,3の病因に関与していることを意味します。心臓の発生は、多様で相互作用する細胞型の複雑なプロセスであり、原因となる非コード変異と遺伝子制御への影響を特定することは困難です。心臓の器官形成は、心筋細胞、線維芽細胞、心外膜細胞、心内膜細胞など、さまざまなサブタイプの心臓細胞を生じさせる細胞前駆細胞から始まります4,5。シングルセルゲノミクスは、心臓の発達を研究し、健康と病気における細胞の不均一性の影響を評価するための重要な方法として浮上しています6。異なるパラメータの同時測定のためのマルチオミクス法の開発と計算パイプラインの拡大により、正常および病気の心臓における細胞タイプとサブタイプの発見が容易になりました6。本稿では、マウス胚から得られた凍結心臓前駆細胞について、下流のsnRNA-seqおよびsnATAC-seq(およびsnRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)と互換性のある信頼性の高い単核単細胞分離プロトコルについて説明します7,8,9。

ATAC-seqは、調節オープンクロマチン領域の同定とヌクレオソームの位置決めを可能にする堅牢な方法です10,11。この情報は、転写因子の位置、同一性、および活性に関する結論を引き出すために使用されます。リモデリング剤を含むクロマチン因子の活性、およびRNAポリメラーゼの転写活性は、クロマチン構造の定量的変化を測定するのに非常に感度が高いため、分析することができます1,2。したがって、ATAC-seqは、特定の細胞型における転写調節を制御するメカニズムを明らかにするための堅牢で公平なアプローチを提供します。ATAC-seqプロトコルは、単一細胞におけるクロマチンアクセシビリティを測定するためにも検証されており、細胞集団内のクロマチン構造のばらつきを明らかにしています10、12、13。

近年、単一細胞の分野で顕著な進歩がありましたが、主な困難は、これらの実験を実行するために必要な新鮮なサンプルの処理です14。この困難を回避するために、凍結心臓組織または細胞を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqなどの分析を行うことを目的として様々な試験が実施されてきた15,16。

シングルセルゲノミクスデータを解析するために、いくつかのプラットフォームが使用されてきた17。単一細胞遺伝子発現およびATACプロファイリングに広く使用されているプラットフォームは、複数のマイクロ流体液滴カプセル化のためのプラットフォームです17。これらのプラットフォームはマイクロ流体チャンバーを使用しているため、破片や凝集物がシステムを詰まらせ、データが使用できなくなる可能性があります。したがって、単一細胞研究の成功は、個々の細胞/核の正確な分離にかかっています。

ここで紹介するプロトコルは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqを使用した最近の研究と同様のアプローチを使用して、先天性心疾患を理解しています18、19、20、21、22、23。この手順では、新たにマイクロ解剖された心臓組織の酵素解離とそれに続くマウス心臓前駆細胞の凍結保存を利用します。解凍後、生細胞は精製され、核分離のために処理されます。この研究では、このプロトコルを使用して、マウス心臓前駆細胞の同じ核製剤からsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータを取得することに成功しました。

プロトコル

この研究で採用された動物の手順は、エクスマルセイユ大学の動物倫理委員会(C2EA-14)によって承認され、指定された動物実験のための国家倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。認可アパフィスN°33927-2021111715507212)。

1.解剖前の時限交配の設定

  1. マウス胚を作製するには、心臓領域単離の9.5日前に成体マウス間で時限交配を行う。この手順では、生後2〜6か月の野生型C57BL/6Jマウスを使用し、一晩で時限交配を行いました。
  2. 翌朝、雌のマウスに膣栓があるかどうかを確認します。プラグが胎児の日(E)0.5として識別された日を考えてみましょう。

2.組織調製と細胞分離

  1. 妊娠後9.5日目に生後2〜6か月の妊娠中の女性C57BL / 6JをCO2を介して安楽死させ、濃度を上げてから子宮頸部脱臼を行います。腹部の下部を70%エタノールできれいにします。
    注:子宮頸部脱臼の前に麻酔薬を使用することは、その後のトランスクリプトームおよびエピゲノム研究に影響を与える可能性のある環境変化に胚をさらすため、推奨されません。
  2. 腹部と腹膜をハサミで開きます。子宮角を視覚化し、鉗子を使用して両方の角を切除します。
  3. 1%FBSを含む冷たい完全培地を含むペトリ皿に角を置きます。特定の容量は必要ありませんが、胚が培地に完全に浸されるように注意する必要があります。10cmのペトリ皿あたり約10mLの容量が適切です。
  4. 倍率5倍に設定した実体顕微鏡下で、鉗子を使用して、各胚から子宮内膜組織、胎盤、および卵黄嚢を取り除きます。
  5. 胚を1%FBSを含む冷たい完全培地を含むペトリ皿に入れる。胚性心臓領域を、 図1に例示した概略胚に記載されるように、低温完全培地中で解剖する。
  6. 5匹のマウス胚から解剖した心臓領域を1.5 mLの微量遠心チューブにまとめてプールします。スイングバケット遠心分離機を4°Cにプレチルします。
  7. スイングバケット遠心分離機でRTで1分間、300x g で遠心分離します。上清を除去し、組織培養グレードのPBSを1 mL加えて組織を洗浄します。
  8. 300 x g でRTで1分間遠心分離し、上清を取り除き、洗浄手順を繰り返して合計2回の洗浄を行います。洗浄を2回繰り返し、PBSを0.05%トリプシン/ EDTA(1x)に置き換えます。
  9. 組織消化のために、50 μLの0.25%トリプシン/EDTAを37°Cで10分間加えます。 ワイドオリフィスフィルターチップを使用した上下のジェスチャーにより、5分後に穏やかな機械的解離を適用します。
  10. トリプシン消化活性を不活性化するには、解離した細胞に350 μLの完全培地を添加します。再懸濁した細胞を40 μmの細胞ストレーナーに通します。

3.細胞カウントと生存率評価

注:細胞数と生存率は、単一細胞実験の成功にとって重要なパラメータです。snATAC-seqアプローチは、細胞数のわずかな変動に敏感です。細胞が少なすぎるとクロマチンが過剰に消化され、リード数が多くなり、アクセスできないクロマチン領域(ノイズ)がマッピングされます。同様に、細胞が多すぎると、配列決定が困難な高分子量の断片が生成されます。細胞および核濃度を正確に決定するために、細胞数および生存率を2つの異なる方法で評価した。

  1. 以下に説明するように、細胞計数のためのトリパンブルーアッセイを実行します。
    1. 0.4%トリパンブルー染色溶液をボルテックスし、室温2,000 x gで10秒間スピンし、10 μLをマイクロチューブに移します。
    2. ピペットを使用して細胞懸濁液を混合し、すでに分注された10 μLのトリパンブルー溶液に10 μLの懸濁液を加えます。ピペットで10回慎重に混合します。
    3. 染色した細胞10 μLをカウントスライドに移します。スライドをカウンターに入れると、細胞濃度と生存率が自動的に計算されます。
  2. 以下に説明するように、蛍光ベースの死亡率評価を実行します。
    注:このアッセイは、細胞生存率を評価するための蛍光色素(エチジウムホモ二量体-1、EthD-1、およびカルセインAM)の使用に基づいています。市販のキットを使用し、適切な準備と使用のためにプロバイダーの指示に従っていました。
    1. 付属の2 mM EthD-1ストック溶液5 μLを滅菌組織培養グレードD-PBS1 mLに加え、5秒間ボルテックスして完全に混合することにより、10 μM EthD-1溶液を調製します。
    2. 付属の4 mMカルセインAMストック溶液2.5 μLを、すでに調製したEthD-1溶液に移します。完全な混合を確実にするために5秒間ボルテックス。
    3. 得られた10 μM EthD-1および10 μMカルセインAM作業溶液10 μLを10 μLの細胞懸濁液に加えます。
      注:カルセインは水溶液中での加水分解の影響を非常に受けやすいため、この作業溶液を1日以内に使用してください。
    4. 染色した細胞10 μLをカウントスライドに移します。スライドを自動蛍光セルカウンターに挿入します。GFPフィルターを使用して生細胞をカウントし、RFPフィルターを使用して死細胞をカウントします。
      注:2つの計数法は同様の細胞数と生存率を与え、新たに解離した細胞の総数は、胚性心臓領域(0.06 mm3)あたり平均約20,000細胞と推定されました。

4.細胞凍結

  1. 細胞懸濁液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 チューブの底に触れずに上清を注意深く取り除き、ペレットを1 mLの冷やした凍結培地に再懸濁します。
  2. 細胞懸濁液を予冷したクライオバイアルに移し、クライオバイアルを予冷した凍結容器に入れます。
  3. 容器を-80 °Cで4時間から8時間置きます。クライオバイアルを液体窒素に移して、下流の単核RNAおよびATACシーケンシング実験を行います。
    注意: クライオバイアルは、使用前にドライアイスで輸送する必要があります。私たちの経験では、細胞は細胞生存率を失うことなく、少なくとも6か月間液体窒素に保存することができます。氷晶の形成を防ぐために、保管温度は常に-150°C未満に保つ必要があります。

5.細胞の融解と死細胞の除去

  1. クライオバイアルを37°Cの水浴に1〜2分間入れます。小さな結晶がクライオバイアルに残っているときにそれを取り除きます。
  2. 予熱した(37°C)完全培地を1 mL加えます。ピペットで3回混ぜます。懸濁液を、10 mLの温かい完全培地を含む15 mLのコニカルチューブに移します。
  3. 細胞懸濁液全体を30 μmのストレーナーに通します。ストレーナーを1〜2 mLの温かい完全培地ですすぎ、フロースルーを同じ円錐形のチューブに集めます。
  4. 300 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。PBSで1回洗浄し、細胞懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移します。
  5. 300 x g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを破壊することなく上清を除去します。
  6. 付属の磁気マイクロビーズ100 μLをペレットセルに加え、ワイドボアピペットチップを使用して5回ホモジナイズします。RTで15分間インキュベートします。
  7. その間に、磁気分離カラム(容量:1 x 107 〜2 x 108 セル)を500 μLの1x結合バッファーですすいでください。
  8. インキュベーションが完了したら、マイクロビーズを含む細胞懸濁液を500 μLの1x結合バッファーで希釈します。
  9. 細胞懸濁液(0.6 μL)を調製した磁気分離カラムに塗布します。フロースルーは負に選択された生細胞画分であり、磁気的に保持された画分は正に選択された死細胞です。
  10. 生細胞流出液を15 mL遠沈管に回収します。細胞懸濁液とカラムが入っていた1.5 mLマイクロチューブを2 mLの1x結合バッファーですすぎ、同じ15 mLチューブに流出液を回収します。
  11. 300 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。
  12. PBS-BSA溶液を1 mL加え、ワイドオリフィスピペットチップを使用して5回ピペッティングして穏やかに混合します。細胞懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移します。
  13. 300 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。
  14. 1 mLのPBS-BSAを加えてペレットを再懸濁し、洗浄ステップを繰り返して合計2回の洗浄を行います。
  15. 細胞を100 μLのPBS-BSA溶液に再懸濁します。10回ピペッティングして穏やかに混合します。
  16. 前述の方法を用いて細胞の濃度および生存率を決定する(ステップ3.1およびステップ3.2)。次の手順に進むには、セル数が ≥100,000 であることを確認します。代表的な結果については 、図2 を参照してください。
    注:凍結保存は、生細胞の最初の出発物質の約40%の損失をもたらします。開始細胞数に応じて、磁気カラム上でビーズを分離すると細胞生存率が高くなりますが、細胞の総数は2倍から5倍に分割されます。死細胞を除去するためのカラムベースの磁気キットの利用は、十分な出発物質が利用可能な場合にのみ推奨されます。

6. 核の分離

注:snATACとsnRNA-seqの組み合わせは、清潔で無傷の核の懸濁液で行われます。使用する細胞タイプの溶解条件(溶解時間とNP40濃度)の最適化が推奨されます。最適な溶解時点と界面活性剤濃度は、核形態を乱すことなく溶解される細胞の最大数をもたらすものです。細胞/核の損失は、固定角度遠心分離機の代わりにスイングバケット遠心分離機を使用することで減らすことができます。プラスチックの核保持を最小限に抑えるために、低保持ピペットチップと遠心チューブを使用することをお勧めします。これにより、核の回収率を高めることができます。ピペットチップと遠心チューブを5%BSAでコーティングすることは、より安価ですが、より時間のかかる代替手段です。

  1. 作業場所と材料を70%エタノールとRNase除去溶液で洗浄します。
  2. スイングバケット遠心分離機を4°Cにプレチルします。 溶解バッファー、溶解希釈バッファー、0.1x 溶解バッファー、および洗浄バッファーを新たに調製します( 表1を参照)。氷上でバッファーを維持します。
  3. 細胞懸濁液をスイングバケット遠心分離機で4°Cで500 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットが外れないように、チューブの底に触れずにすべての上清をそっと取り除きます。
  4. 100 μLの冷却0.1x溶解バッファーを加えます。ピペッティングで10回穏やかに混ぜます。氷上で5分間インキュベートします。
  5. 冷やした洗浄バッファー1 mLを加え、ピペッティングで5回穏やかに混ぜます。500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 核ペレットを乱すことなく上清を除去する。
  6. 冷やした洗浄バッファーで洗浄を繰り返し、合計3回の洗浄を行います。希釈した核緩衝液を調製する。再懸濁後、核ストック溶液を氷上に置いておきます。

7. 単離核の質と量の評価

注:初期細胞数に基づいて、細胞溶解中の核損失の約50%を推定し、適切な数の細胞を冷希釈核バッファーに再懸濁します。冷却希釈核バッファーによる再懸濁量の計算は、ターゲット核回収率と、メーカーのユーザーガイドが推奨する対応する核ストック濃度に基づいています。この計算の例については、 補足プロトコル 1 を参照してください。

  1. 初期細胞数に基づいて、細胞溶解中の核損失の約50%を推定し、適切な数の細胞を冷希釈核バッファーに再懸濁します。
  2. 実際の核濃度を決定します。2 μLの核ストック溶液を8 μLの希釈核バッファーと混合し、事前に分注した10 μLのトリパンブルーまたはEthD-1/calceinAM作業溶液に加えます。自動セルカウンターを使用して核をカウントします。細胞の5%未満が生存可能であるはずです。代表的な結果については 、図3 を参照してください。
  3. 核ストックの容量と希釈された核バッファーの容量を計算して、転位反応の推奨濃度で5 μLの総容量を取得します(メーカーのユーザーガイドを参照)。直ちにユーザガイド17に従って転置反応に進む。
    注:転位反応からATACおよびGEXライブラリの構築までのすべてのステップは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqの組み合わせ17に使用したキットのユーザーガイドに従って実行されました。

8. snRNA-seqおよびsnATAC-seqライブラリの品質解析

  1. 次世代シーケンシングに進む前に、最終的なsnATAC-seqおよび遺伝子発現GEXライブラリの品質とサイズ分布を検証してください。フラグメント解析システムを使用して、ライブラリで同定された配列の質と量を評価します。代表的な品質評価結果については 、図4 を参照してください。
    注:snATAC-seqライブラリの最終的なトレースは、ヌクレオソーム巻上げの周期性を示す必要があり、サイズは200 bpから数Kbpの範囲である必要がありますが、遺伝子発現ライブラリのサイズは300 bpから600 bpの範囲である必要があります。

結果

シングルセルアプローチ用のシングルセル懸濁液の調製と比較して、単一核懸濁液の調製ははるかに困難であり、より高いレベルの分離と処理が必要です。snRNA-seqとsnATAC-seqの結合を成功させるための重要な要素は、クリーンで無傷の核懸濁液です。効率的な核分離のためのプロトコルは、各組織の種類と状態(新鮮または凍結)に適合させる必要があります。ここでは、凍結マウス胚性心臓細?...

ディスカッション

snRNA-seqとsnATAC-seqを組み合わせた研究による発達中の心臓の細胞組成の分析は、先天性心疾患の起源のより深い理解を提供します26。いくつかの研究所は、snRNA-seq27に対する心臓組織の凍結保存の効果を研究しています。ヒト疾患のマウスモデルから得られた新鮮な微小解剖組織を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqを実施することは、異なる実験条件を比較する際?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

本研究は、ERA-CVD-2019およびANR-JCJC-2020からSSの支援を受けて行われました。貴重なコメントを提供してくれたU 1251 /Marseille Medical Geneticsラボのゲノミクスおよびバイオインフォマティクスファシリティ(GBiM)と匿名のレビューアに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentNo catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo catalog number
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSNo catalog number

参考文献

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