Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Özet

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Özet

Gelişmekte olan kalp, karmaşık düzenleyici mekanizmalar tarafından kontrol edilen çeşitli progenitör hücreleri içeren karmaşık bir yapıdır. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonunun ve kromatin durumunun incelenmesi, hücre tipinin ve durumunun tanımlanmasını sağlar. Tek hücreli dizileme yaklaşımları, kardiyak progenitör hücre heterojenitesinin bir dizi önemli özelliğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle taze doku ile sınırlıdır, bu da farklı deneysel koşullara sahip çalışmaları sınırlar, çünkü taze dokunun teknik değişkenliği azaltmak için aynı anda işlenmesi gerekir. Bu nedenle, bu alanda tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) ve yüksek verimli dizileme (snATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli test gibi yöntemlerden veri üretmek için kolay ve esnek prosedürlere ihtiyaç vardır. Burada, sonraki tek çekirdekli dual-omikler (kombine snRNA-seq ve snATAC-seq) için çekirdekleri hızlı bir şekilde izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çekirdeklerin kardiyak progenitör hücrelerin dondurulmuş örneklerinden izole edilmesine izin verir ve mikroakışkan odalar kullanan platformlarla birleştirilebilir.

Giriş

Doğum kusurları arasında, konjenital kalp kusurları (KKH'ler) en yaygın olanıdır ve her yıl canlı doğumların yaklaşık% 1'inde görülür ^1,2. Genetik mutasyonlar vakaların sadece küçük bir kısmında tanımlanmıştır, bu da gen regülasyonundaki anormallikler gibi diğer nedenlerin KKH ^2,3'ün etiyolojisinde rol oynadığını ima etmektedir. Kardiyak gelişim, çeşitli ve etkileşimli hücre tiplerinin karmaşık bir sürecidir ve nedensel kodlamayan mutasyonların tanımlanmasını ve gen regülasyonu üzerindeki etkilerini zorlaştırır. Kalbin organogenezi, miyokardiyal, fibro....

Protokol

Bu çalışmada benimsenen hayvan prosedürü, Aix-Marseille Üniversitesi (C2EA-14) hayvan etik kurulları tarafından onaylanmış ve hayvan deneyleri için atanmış ulusal etik kurul (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Yetkilendirme Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Diseksiyondan önce zamanlanmış çiftleşmenin ayarlanması

1. Fare embriyoları oluşturmak için, kalp bölgesi izolasyonundan 9,5 gün önce yetişkin fareler arasında zamanlanmış bir çiftleşme gerçekleştirin. Bu prosedürde, 2-6 aylık vahşi tip C57BL / 6J fareler kullanıldı ve gece boyunca zamanlanmış çiftleşme yapıldı.<....

Tartışmalar

Gelişmekte olan kalbin hücresel bileşiminin kombine snRNA-seq ve snATAC-seq çalışmaları ile analizi, konjenital kalp hastalığının kökeni hakkında daha derin bir anlayış sağlar²⁶. Birkaç araştırma laboratuvarı, kardiyak doku kriyoprezervasyonunun snRNA-seq²⁷ üzerindeki etkilerini incelemiştir. İnsan hastalığının fare modellerinden taze mikro-disseke edilmiş doku kullanarak snRNA-seq ve snATAC-seq iletmek, farklı deneysel koşulları karşılaşt?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number