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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.

Résumé

Le cœur en développement est une structure complexe contenant diverses cellules progénitrices contrôlées par des mécanismes de régulation complexes. L’examen de l’expression génique et de l’état de chromatine des cellules individuelles permet d’identifier le type et l’état cellulaire. Les approches de séquençage unicellulaire ont révélé un certain nombre de caractéristiques importantes de l’hétérogénéité des cellules progénitrices cardiaques. Cependant, ces méthodes sont généralement limitées aux tissus frais, ce qui limite les études avec diverses conditions expérimentales, car les tissus frais doivent être traités immédiatement dans le même cycle pour réduire la variabilité technique. Par conséquent, des procédures simples et flexibles pour produire des données à partir de méthodes telles que le séquençage de l’ARN mononucléal (snRNA-seq) et le test mononucléal pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (snATAC-seq) sont nécessaires dans ce domaine. Ici, nous présentons un protocole pour isoler rapidement les noyaux pour les dual-omiques à noyaux simples suivants (snRNA-seq combiné et snATAC-seq). Cette méthode permet d’isoler des noyaux à partir d’échantillons congelés de cellules progénitrices cardiaques et peut être combinée avec des plates-formes utilisant des chambres microfluidiques.

Introduction

Parmi les malformations congénitales, les cardiopathies congénitales (CHD) sont les plus fréquentes, survenant dans environ 1% des naissances vivantes chaque année 1,2. Les mutations génétiques ne sont identifiées que dans une minorité de cas, ce qui implique que d’autres causes, telles que des anomalies dans la régulation des gènes, sont impliquées dans l’étiologie de la coronaropathie 2,3. Le développement cardiaque est un processus complexe de types cellulaires divers et en interaction, ce qui rend difficile l’identification des mutations causales non codantes et de leurs effets sur la régulation des gènes. L’organogenèse du cœur commence par des progéniteurs cellulaires qui donnent naissance à différents sous-types de cellules cardiaques, notamment les cellules myocardiques, fibroblastiques, épicardiques et endocardiques 4,5. La génomique unicellulaire est en train de devenir une méthode clé pour étudier le développement cardiaque et évaluer l’impact de l’hétérogénéité cellulaire sur la santé et la maladie6. Le développement de méthodes multi-omiques pour la mesure simultanée de différents paramètres et l’expansion des pipelines de calcul a facilité la découverte de types et de sous-types cellulaires dans le cœur normal et malade6. Cet article décrit un protocole fiable d’isolement mononucléaire pour les cellules progénitrices cardiaques congelées obtenues à partir d’embryons de souris qui est compatible avec le snRNA-seq et le snATAC-seq en aval (ainsi qu’avec snRNA-seq et snATAC-seq combinés)7,8,9.

ATAC-seq est une méthode robuste qui permet l’identification des régions chromatiques ouvertes régulatrices et le positionnement des nucléosomes10,11. Cette information est utilisée pour tirer des conclusions sur l’emplacement, l’identité et l’activité des facteurs de transcription. L’activité des facteurs de chromatine, y compris les remodeurs, ainsi que l’activité transcriptionnelle de l’ARN polymérase, peuvent donc être analysées car la méthode est très sensible pour mesurer les changements quantitatifs de la structure de la chromatine 1,2. Ainsi, ATAC-seq fournit une approche robuste et impartiale pour découvrir les mécanismes contrôlant la régulation transcriptionnelle dans un type de cellule spécifique. Les protocoles ATAC-seq ont également été validés pour mesurer l’accessibilité de la chromatine dans des cellules individuelles, révélant une variabilité dans l’architecture de la chromatine au sein des populations cellulaires10,12,13.

Bien qu’il y ait eu des progrès notables dans le domaine des cellules individuelles ces dernières années, la principale difficulté est le traitement des échantillons frais nécessaires à la réalisation de ces expériences14. Pour contourner cette difficulté, divers tests ont été réalisés dans le but de réaliser des analyses telles que snRNA-seq et snATAC-seq avec du tissu cardiaque congelé ou des cellules15,16.

Plusieurs plateformes ont été utilisées pour analyser les données génomiques unicellulaires17. Les plateformes largement utilisées pour l’expression génique unicellulaire et le profilage ATAC sont des plateformes pour l’encapsulation de gouttelettes microfluidiques multiples17. Comme ces plates-formes utilisent des chambres microfluidiques, les débris ou les agrégats peuvent obstruer le système, ce qui rend les données inutilisables. Ainsi, le succès des études unicellulaires dépend de l’isolement précis des cellules/noyaux individuels.

Le protocole présenté ici utilise une approche similaire aux études récentes utilisant snRNA-seq et snATAC-seq pour comprendre les malformations cardiaques congénitales 18,19,20,21,22,23. Cette procédure utilise la dissociation enzymatique de tissus cardiaques fraîchement microdisséqués suivie de la cryoconservation de cellules progénitrices cardiaques de souris. Après décongélation, les cellules viables sont purifiées et traitées pour l’isolement nucléaire. Dans ce travail, ce protocole a été utilisé avec succès pour obtenir des données snRNA-seq et snATAC-seq à partir de la même préparation nucléaire de cellules progénitrices cardiaques de souris.

Protocole

La procédure animale adoptée dans cette étude a été approuvée par les comités d’éthique animale de l’Université d’Aix-Marseille (C2EA-14) et a été réalisée selon des protocoles approuvés par le comité national d’éthique de l’expérimentation animale (Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ; Autorisation Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Mise en place de l’accouplement programmé avant la dissection

  1. Pour générer des embryons de souris, effectuez un accouplement chronométré entre souris adultes 9,5 jours avant l’isolement de la région cardiaque. Dans cette procédure, des souris C57BL / 6J de type sauvage âgées de 2 à 6 mois ont été utilisées et un accouplement chronométré a été effectué pendant la nuit.
  2. Le lendemain matin, vérifiez si les souris femelles ont un plug vaginal. Considérez le jour où le bouchon est identifié comme jour embryonnaire (E) 0,5.

2. Préparation tissulaire et isolement cellulaire

  1. Euthanasier une femelle enceinte de 2 à 6 mois C57BL/6J au jour 9,5 après la conception via CO2 avec une concentration croissante suivie d’une luxation cervicale. Nettoyez la partie inférieure de l’abdomen avec de l’éthanol à 70%.
    REMARQUE : L’utilisation d’anesthésiques avant la luxation cervicale n’est pas recommandée, car cela exposerait les embryons à des changements environnementaux qui pourraient avoir une incidence sur les études transcriptomiques et épigénomiques ultérieures.
  2. Ouvrez l’abdomen et le péritoine avec des ciseaux. Visualisez les cornes utérines et utilisez des forceps pour exciser les deux cornes.
  3. Placer les cornes dans une boîte de Petri contenant un milieu complet froid avec 1% FBS. Bien qu’aucun volume spécifique ne soit requis, il faut veiller à ce que les embryons soient complètement immergés dans le milieu. Un volume approximatif de 10 mL par boîte de Petri de 10 cm est approprié.
  4. Sous le stéréomicroscope réglé à un grossissement de 5x et à l’aide de forceps, retirez le tissu endométrial, le placenta et le sac vitellin de chaque embryon.
  5. Placer les embryons dans une boîte de Petri avec un milieu complet froid avec 1% FBS. Disséquer la région du cœur embryonnaire, telle que décrite sur l’embryon schématique illustré à la figure 1, dans un milieu complet froid.
  6. Regrouper les régions cardiaques disséquées à partir de cinq embryons de souris dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifugeuses à godet oscillant avant le refroidissement à 4 °C.
  7. Centrifuger à 300x g pendant 1 min à TA dans une centrifugeuse à godet oscillant. Retirez le surnageant et lavez les mouchoirs en ajoutant 1 mL de PBS de qualité culture tissulaire.
  8. Centrifuger à 300 x g pendant 1 min à TA. Retirez le surnageant et répétez les étapes de lavage pour un total de deux lavages. Répétez le lavage deux fois, en remplaçant le PBS par 0,05% de trypsine/EDTA (1x).
  9. Pour la digestion des tissus, ajouter 50 μL de trypsine/EDTA à 0,25 % pendant 10 min à 37 °C. Appliquer une dissociation mécanique douce après 5 min par des gestes de haut en bas à l’aide d’une pointe filtrante à large orifice.
  10. Inactiver l’activité de digestion de la trypsine en ajoutant 350 μL de milieu complet aux cellules dissociées. Faire passer les cellules remises en suspension à travers une crépine cellulaire de 40 μm.

3. Comptage des cellules et évaluation de la viabilité

REMARQUE : Le nombre de cellules et la viabilité sont des paramètres essentiels au succès des expériences sur une seule cellule. L’approche snATAC-seq est sensible aux variations mineures du nombre de cellules. Trop peu de cellules conduisent à une sur-digestion de la chromatine, ce qui entraîne un nombre plus élevé de lectures et la cartographie des régions de chromatine inaccessibles (bruit). De même, avoir trop de cellules génère des fragments de poids moléculaire élevé qui sont difficiles à séquencer. Pour la détermination précise des concentrations de cellules et de noyaux, le nombre de cellules et la viabilité ont été évalués par deux méthodes différentes.

  1. Effectuer un test de trypan bleu pour le comptage cellulaire, comme décrit ci-dessous.
    1. Solution de coloration au bleu trypan à 0,4 % de vortex, faire tourner pendant 10 s à température ambiante à 2 000 x g et transférer 10 μL dans un microtube.
    2. À l’aide d’une pipette, mélanger la suspension cellulaire et ajouter 10 μL de suspension aux 10 μL déjà aliquotes de solution de bleu de trypan. Mélanger soigneusement 10 fois à la pipette.
    3. Transférer 10 μL des cellules colorées dans une lame de comptage. Placez la lame dans le compteur pour calculer automatiquement la concentration et la viabilité de la cellule.
  2. Effectuer une évaluation de la mortalité basée sur la fluorescence comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Ce test est basé sur l’utilisation de colorants fluorescents (éthidium homodimère-1, EthD-1 et calcéine AM) pour évaluer la viabilité cellulaire. Une trousse disponible dans le commerce a été utilisée et les instructions du fournisseur ont été suivies pour la préparation et l’utilisation appropriées.
    1. Préparer une solution mère d’EthD-1 de 10 μM en ajoutant 5 μL de la solution mère d’EthD-1 de 2 mM fournie à 1 mL de D-PBS de culture tissulaire stérile et vortex pendant 5 s pour assurer un mélange complet.
    2. Transférer 2,5 μL de la solution mère de calcéine AM à 4 mM fournie à la solution d’EthD-1 déjà préparée. Vortex pendant 5 s pour assurer un mélange complet.
    3. Ajouter 10 μL de la solution de travail résultant de 10 μM EthD-1 et 10 μM de calcéine AM à 10 μL de suspension cellulaire.
      REMARQUE: La calcéine est très sensible à l’hydrolyse dans les solutions aqueuses, alors utilisez cette solution de travail dans 1 jour.
    4. Transférer 10 μL des cellules colorées sur une lame de comptage. Insérez la lame dans le compteur automatisé de cellules fluorescentes. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un filtre GFP et les cellules mortes avec un filtre RFP.
      REMARQUE: Les deux méthodes de comptage ont donné un nombre de cellules et une viabilité similaires, et le nombre total de cellules fraîchement dissociées a été estimé en moyenne à environ 20 000 cellules par région cardiaque embryonnaire (0,06 mm3).

4. Congélation cellulaire

  1. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer délicatement le surnageant sans toucher le fond du tube et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de congélation réfrigéré.
  2. Transférer la suspension cellulaire dans un cryovial pré-refroidi et placer le cryovial dans un récipient de congélation pré-refroidi.
  3. Placer le récipient à −80 ◦C pendant 4 h à 8 h. Transférer le cryovial à l’azote liquide pour des expériences de séquençage de l’ARN mononoyau et de l’ATAC en aval.
    NOTE: Le cryovial doit être transporté sur de la glace sèche avant utilisation. D’après notre expérience, les cellules peuvent être stockées dans de l’azote liquide pendant au moins 6 mois sans perte de viabilité cellulaire. La température de stockage doit être maintenue en dessous de −150 °C en tout temps pour éviter la formation de cristaux de glace.

5. Décongélation cellulaire et élimination des cellules mortes

  1. Placer les cryoflacons dans un bain-marie à 37 °C pendant 1-2 min. Retirez-le lorsqu’il reste un minuscule cristal dans le cryovial.
  2. Ajouter 1 mL de milieu complet préchauffé (37 °C). Mélanger trois fois à la pipette. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de milieu complet chaud.
  3. Passez toute la suspension cellulaire sur une crépine de 30 μm. Rincer la passoire avec 1-2 mL de milieu complet chaud et recueillir l’écoulement dans le même tube conique.
  4. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, et enlever le surnageant. Laver une fois avec du PBS et transférer la suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 mL.
  5. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, et retirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule.
  6. Ajouter 100 μL des microbilles magnétiques fournies aux cellules granulées et homogénéiser cinq fois à l’aide d’une pointe de pipette de grand calibre. Incuber pendant 15 min à TA.
  7. En attendant, rincez la colonne de séparation magnétique (capacité : 1 x 107 à 2 x 108 cellules) avec 500 μL de tampon de liaison 1x.
  8. Une fois l’incubation terminée, diluer la suspension cellulaire contenant les microbilles avec 500 μL de tampon de liaison 1x.
  9. Appliquez la suspension cellulaire (0,6 μL) sur la colonne de séparation magnétique préparée. Le flux continu est la fraction de cellules vivantes sélectionnée négativement, et la fraction magnétiquement retenue est les cellules mortes sélectionnées positivement.
  10. Recueillir l’effluent de cellules vivantes dans un tube à centrifuger de 15 mL. Rincer le microtube de 1,5 mL qui contenait la suspension cellulaire et la colonne avec 2 mL de tampon de liaison 1x, et recueillir l’effluent dans le même tube de 15 mL.
  11. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant sans perturber la pastille de cellule.
  12. Ajouter 1 mL de la solution PBS-BSA et mélanger doucement en pipetant cinq fois à l’aide d’un embout de pipette à large orifice. Transférer la suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 mL.
  13. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant sans perturber la pastille de cellule.
  14. Ajouter 1 mL de PBS-BSA pour remettre en suspension la pastille et répéter l’étape de lavage pour un total de deux lavages.
  15. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL de solution PBS-BSA. Mélanger doucement en pipetant 10 fois.
  16. Déterminer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide des méthodes décrites précédemment (étape 3.1 et étape 3.2). Pour passer à l’étape suivante, assurez-vous d’un nombre de cellules de ≥ 100 000 cellules. Voir la figure 2 pour des résultats représentatifs.
    NOTE: La cryoconservation entraîne une perte d’environ 40% du matériel de départ initial des cellules vivantes. Selon le nombre de cellules de départ, la séparation des billes sur une colonne magnétique entraîne une viabilité cellulaire élevée, mais divise le nombre total de cellules par deux à cinq fois. L’utilisation d’un kit magnétique à colonne pour éliminer les cellules mortes n’est conseillée que lorsque suffisamment de matières premières sont disponibles.

6. Isolement des noyaux

REMARQUE: snATAC et snRNA-seq combinés sont réalisés avec une suspension de noyaux propres et intacts. L’optimisation des conditions de lyse (temps de lyse et concentration de NP40) pour le type de cellule utilisé est recommandée. Le point temporel optimal de lyse et la concentration de détergent sont ceux qui permettent de lyser le maximum de cellules sans perturber la morphologie nucléaire. La perte de cellules/noyaux peut être réduite en utilisant une centrifugeuse à godet oscillant au lieu d’une centrifugeuse à angle fixe. Pour minimiser la rétention des noyaux sur les plastiques, il est recommandé d’utiliser des pointes de pipettes à faible rétention et des tubes de centrifugation. Cela peut augmenter la récupération des noyaux. Le revêtement des embouts de pipettes et des tubes de centrifugation avec 5% de BSA est une alternative moins coûteuse mais plus longue.

  1. Nettoyez le lieu de travail et les matériaux avec de l’éthanol à 70% et une solution d’élimination de la RNase.
  2. Centrifugeuses à godet oscillant avant le refroidissement à 4 °C. Préparer fraîchement le tampon de lyse, le tampon de dilution de lyse, le tampon de lyse 0,1x et le tampon de lavage (voir tableau 1). Maintenez les tampons sur la glace.
  3. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5min à 4 °C dans une centrifugeuse à godet pivotant. Retirez délicatement tout le surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille de cellule.
  4. Ajouter 100 μL de tampon de lyse 0,1x refroidi. Mélanger doucement en pipetant 10 fois. Incuber pendant 5 min sur la glace.
  5. Ajouter 1 ml de tampon de lavage réfrigéré et mélanger délicatement en pipetant cinq fois. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant sans perturber la pastille de noyaux.
  6. Répétez les lavages avec un tampon de lavage réfrigéré pour un total de trois lavages. Préparer le tampon des noyaux dilués. Après la remise en suspension, conserver la solution mère de noyaux sur de la glace.

7. Évaluation de la qualité et de la quantité des noyaux isolés

REMARQUE : Sur la base du nombre initial de cellules et en estimant la perte de noyaux d’environ 50 % pendant la lyse cellulaire, remettre en suspension le nombre approprié de cellules dans un tampon de noyaux dilués à froid. Le calcul du volume de remise en suspension avec un tampon de noyaux dilués réfrigérés est basé sur la récupération ciblée des noyaux et les concentrations de noyaux correspondantes recommandées par le guide de l’utilisateur du fabricant. Voir un exemple de ce calcul dans le protocole additionnel n° 1.

  1. Sur la base du nombre initial de cellules et en estimant environ 50% de perte de noyaux pendant la lyse cellulaire, remettre en suspension le nombre approprié de cellules dans un tampon de noyaux dilués à froid.
  2. Déterminer la concentration réelle des noyaux. Mélanger 2 μL de solution mère de noyaux avec 8 μL de tampon de noyaux dilué et ajouter le mélange à la solution de travail pré-aliquote de 10 μL de bleu de trypan ou d’EthD-1/calceinAM. Comptez les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Moins de 5% des cellules devraient être viables. Voir la figure 3 pour des résultats représentatifs.
  3. Calculer le volume du stock de noyaux et le volume du tampon de noyaux dilués pour obtenir un volume total de 5 μL à la concentration recommandée pour la réaction de transposition (voir le guide de l’utilisateur du fabricant). Procéder immédiatement à la réaction de transposition conformément au guide d’utilisation17.
    NOTE: Toutes les étapes de la réaction de transposition à la construction des bibliothèques ATAC et GEX ont été effectuées conformément au guide de l’utilisateur du kit utilisé pour snRNA-seq et snATAC-seq combinés17.

8. Analyse de la qualité des bibliothèques snRNA-seq et snATAC-seq

  1. Avant de passer au séquençage de nouvelle génération, validez la qualité et la distribution de taille des bibliothèques finales snATAC-seq et GEX d’expression génique. Évaluer la qualité et la quantité des séquences identifiées dans les bibliothèques à l’aide de systèmes d’analyse de fragments. Voir la figure 4 pour des résultats représentatifs de l’évaluation de la qualité.
    NOTE: La trace finale des bibliothèques snATAC-seq devrait montrer la périodicité de l’enroulement des nucléosomes, et les tailles devraient aller de 200 bp à plusieurs Kbp, tandis que les tailles dans la bibliothèque d’expression génique devraient aller de 300 bp à 600 bp.

Résultats

Par rapport à la préparation de suspensions unicellulaires pour les approches unicellulaires, la préparation de suspensions mononucléiformes est beaucoup plus difficile et nécessite un degré plus élevé de résolution et de traitement. Le facteur clé du succès combiné snRNA-seq et snATAC-seq est une suspension de noyaux propre et intacte. Le protocole pour une isolation efficace des noyaux doit être adapté à chaque type de tissu et à chaque condition (frais ou congelé). Ici, un protocole optimisé est déc...

Discussion

L’analyse de la composition cellulaire du cœur en développement par des études combinées snRNA-seq et snATAC-seq permet de mieux comprendre l’origine des cardiopathies congénitales26. Plusieurs laboratoires de recherche ont étudié les effets de la cryoconservation des tissus cardiaques sur le snRNA-seq27. La réalisation de snRNA-seq et de snATAC-seq à l’aide de tissus micro-disséqués frais provenant de modèles murins de maladie humaine peut être difficile...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par ERA-CVD-2019 et ANR-JCJC-2020 à SS. Nous remercions l’installation de génomique et de bioinformatique (GBiM) du laboratoire U 1251/Marseille Medical Genetics et les examinateurs anonymes pour leurs précieux commentaires.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentNo catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo catalog number
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSNo catalog number

Références

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