Isolement de noyaux à partir de cellules progénitrices cardiaques de souris pour le profilage de l’épigénome et de l’expression génique à une résolution unicellulaire

Résumé

Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.

Résumé

Le cœur en développement est une structure complexe contenant diverses cellules progénitrices contrôlées par des mécanismes de régulation complexes. L’examen de l’expression génique et de l’état de chromatine des cellules individuelles permet d’identifier le type et l’état cellulaire. Les approches de séquençage unicellulaire ont révélé un certain nombre de caractéristiques importantes de l’hétérogénéité des cellules progénitrices cardiaques. Cependant, ces méthodes sont généralement limitées aux tissus frais, ce qui limite les études avec diverses conditions expérimentales, car les tissus frais doivent être traités immédiatement dans le même cycle pour réduire la variabilité technique. Par conséquent, des procédures simples et flexibles pour produire des données à partir de méthodes telles que le séquençage de l’ARN mononucléal (snRNA-seq) et le test mononucléal pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (snATAC-seq) sont nécessaires dans ce domaine. Ici, nous présentons un protocole pour isoler rapidement les noyaux pour les dual-omiques à noyaux simples suivants (snRNA-seq combiné et snATAC-seq). Cette méthode permet d’isoler des noyaux à partir d’échantillons congelés de cellules progénitrices cardiaques et peut être combinée avec des plates-formes utilisant des chambres microfluidiques.

Introduction

Parmi les malformations congénitales, les cardiopathies congénitales (CHD) sont les plus fréquentes, survenant dans environ 1% des naissances vivantes chaque année ^1,2. Les mutations génétiques ne sont identifiées que dans une minorité de cas, ce qui implique que d’autres causes, telles que des anomalies dans la régulation des gènes, sont impliquées dans l’étiologie de la coronaropathie ^2,3. Le développement cardiaque est un processus complexe de types cellulaires divers et en interaction, ce qui rend difficile l’identification des mutations causales n....

Protocole

La procédure animale adoptée dans cette étude a été approuvée par les comités d’éthique animale de l’Université d’Aix-Marseille (C2EA-14) et a été réalisée selon des protocoles approuvés par le comité national d’éthique de l’expérimentation animale (Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ; Autorisation Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Mise en place de l’accouplement programmé avant la dissection

1. Pour générer des embryons de souris, effectuez un accouplement chronométré entre souris adultes 9,5 jours avant l’isolement de la région cardiaque. Dans cette procédure, des ....

Discussion

L’analyse de la composition cellulaire du cœur en développement par des études combinées snRNA-seq et snATAC-seq permet de mieux comprendre l’origine des cardiopathies congénitales²⁶. Plusieurs laboratoires de recherche ont étudié les effets de la cryoconservation des tissus cardiaques sur le snRNA-seq²⁷. La réalisation de snRNA-seq et de snATAC-seq à l’aide de tissus micro-disséqués frais provenant de modèles murins de maladie humaine peut être difficile.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number