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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.

Resumen

El corazón en desarrollo es una estructura compleja que contiene varias células progenitoras controladas por mecanismos reguladores complejos. El examen de la expresión génica y el estado de cromatina de las células individuales permite la identificación del tipo y estado celular. Los enfoques de secuenciación de células individuales han revelado una serie de características importantes de la heterogeneidad de las células progenitoras cardíacas. Sin embargo, estos métodos generalmente están restringidos al tejido fresco, lo que limita los estudios con diversas condiciones experimentales, ya que el tejido fresco debe procesarse de inmediato en la misma ejecución para reducir la variabilidad técnica. Por lo tanto, se necesitan procedimientos fáciles y flexibles para producir datos de métodos como la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) en esta área. Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente núcleos para posteriores dualómicas de núcleos únicos (snRNA-seq y snATAC-seq combinados). Este método permite el aislamiento de núcleos a partir de muestras congeladas de células progenitoras cardíacas y puede combinarse con plataformas que utilizan cámaras microfluídicas.

Introducción

Entre los defectos congénitos, los defectos cardíacos congénitos (CHD) son los más comunes, que ocurren en aproximadamente el 1% de los nacidos vivos cada año 1,2. Las mutaciones genéticas se identifican sólo en una minoría de casos, lo que implica que otras causas, como las anomalías en la regulación génica, están implicadas en la etiología de la cardiopatía coronaria 2,3. El desarrollo cardíaco es un proceso complejo de diversos tipos de células que interactúan, lo que dificulta la identificación de mutaciones causales no codificantes y sus efectos sobre la regulación génica. La organogénesis del corazón comienza con progenitores celulares que dan lugar a diferentes subtipos de células cardíacas, incluyendo células miocárdicas, fibroblásticas, epicárdicas y endocárdicas 4,5. La genómica unicelular está emergiendo como un método clave para estudiar el desarrollo del corazón y evaluar el impacto de la heterogeneidad celular en la salud y la enfermedad6. El desarrollo de métodos multiómicos para la medición simultánea de diferentes parámetros y la expansión de pipelines computacionales ha facilitado el descubrimiento de tipos y subtipos celulares en el corazón normal y enfermo6. Este artículo describe un protocolo fiable de aislamiento de núcleo único para células progenitoras cardíacas congeladas obtenidas de embriones de ratón que es compatible con snRNA-seq y snATAC-seq aguas abajo (así como snRNA-seq y snATAC-seq combinados)7,8,9.

ATAC-seq es un método robusto que permite la identificación de regiones reguladoras de cromatina abierta y el posicionamiento de nucleosomas10,11. Esta información se utiliza para sacar conclusiones sobre la ubicación, identidad y actividad de los factores de transcripción. La actividad de los factores de cromatina, incluidos los remodeladores, así como la actividad transcripcional de la ARN polimerasa, pueden, por lo tanto, ser analizadas ya que el método es altamente sensible para medir cambios cuantitativos en la estructura de la cromatina 1,2. Por lo tanto, ATAC-seq proporciona un enfoque robusto e imparcial para descubrir los mecanismos que controlan la regulación transcripcional en un tipo de célula específico. Los protocolos ATAC-seq también han sido validados para medir la accesibilidad de la cromatina en células individuales, revelando variabilidad en la arquitectura de la cromatina dentro de las poblaciones celulares10,12,13.

Aunque ha habido avances notables en el campo de las células individuales en los últimos años, la principal dificultad es el procesamiento de las muestras frescas necesarias para realizar estos experimentos14. Para evitar esta dificultad, se han realizado diversas pruebas con el objetivo de realizar análisis como snRNA-seq y snATAC-seq con células o tejido cardíaco congelado15,16.

Se han utilizado varias plataformas para analizar datos genómicos unicelulares17. Las plataformas ampliamente utilizadas para la expresión génica unicelular y el perfil ATAC son plataformas para la encapsulación de gotas microfluídicas múltiples17. Como estas plataformas utilizan cámaras microfluídicas, los desechos o agregados pueden obstruir el sistema, lo que resulta en datos no utilizables. Por lo tanto, el éxito de los estudios de células individuales depende del aislamiento preciso de células / núcleos individuales.

El protocolo presentado aquí utiliza un enfoque similar a estudios recientes que utilizan snRNA-seq y snATAC-seq para comprender los defectos cardíacos congénitos 18,19,20,21,22,23. Este procedimiento utiliza la disociación enzimática de tejido cardíaco recién microdiseccionado seguido de la criopreservación de células progenitoras cardíacas de ratón. Después de la descongelación, las células viables se purifican y procesan para el aislamiento nuclear. En este trabajo, este protocolo se utilizó con éxito para obtener datos de snRNA-seq y snATAC-seq de la misma preparación nuclear de células progenitoras cardíacas de ratón.

Protocolo

El procedimiento animal adoptado en este estudio fue aprobado por los comités de ética animal de la Universidad de Aix-Marsella (C2EA-14) y se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité nacional de ética designado para la experimentación animal (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorización Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Configuración del apareamiento cronometrado antes de la disección

  1. Para generar embriones de ratón, realice un apareamiento cronometrado entre ratones adultos 9,5 días antes del aislamiento de la región cardíaca. En este procedimiento, se utilizaron ratones C57BL / 6J de tipo salvaje de 2 a 6 meses, y el apareamiento cronometrado se realizó durante la noche.
  2. A la mañana siguiente, verifique si los ratones hembra tienen un tapón vaginal. Considere el día en que el tapón se identifica como día embrionario (E) 0.5.

2. Preparación de tejidos y aislamiento celular

  1. Eutanasia a la mujer embarazada de 2-6 meses de edad C57BL / 6J en el día 9.5 después de la concepción a través deCO2 con una concentración creciente seguida de luxación cervical. Limpie la parte inferior del abdomen con etanol al 70%.
    NOTA: No se recomienda el uso de anestésicos antes de la luxación cervical ya que esto expondría a los embriones a cambios ambientales que podrían afectar los estudios transcriptómicos y epigenómicos posteriores.
  2. Abra el abdomen y el peritoneo con tijeras. Visualice los cuernos uterinos y use fórceps para extirpar ambos cuernos.
  3. Coloque los cuernos en una placa de Petri que contenga medio completo frío con 1% de FBS. Si bien no se requiere un volumen específico, se debe tener cuidado para garantizar que los embriones estén completamente inmersos en el medio. Un volumen aproximado de 10 mL por placa de Petri de 10 cm es apropiado.
  4. Bajo el microscopio estereoscópico ajustado a un aumento de 5x y usando fórceps, retire el tejido endometrial, la placenta y el saco vitelino de cada embrión.
  5. Coloque los embriones en una placa de Petri con medio completo frío con 1% de FBS. Diseccionar la región cardíaca embrionaria, como se describe en el embrión esquemático ilustrado en la Figura 1, en medio completo frío.
  6. Agrupe las regiones cardíacas diseccionadas de cinco embriones de ratón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugadoras de cucharón oscilante Prechill a 4 °C.
  7. Centrífuga a 300x g durante 1 min en RT en una centrífuga de cucharón oscilante. Retire el sobrenadante y lave los pañuelos agregando 1 ml de PBS de grado de cultivo de tejidos.
  8. Centrifugar a 300 x g durante 1 minuto a RT. Retire el sobrenadante y repita los pasos de lavado para un total de dos lavados. Repita el lavado dos veces, reemplazando el PBS con tripsina/EDTA al 0,05% (1x).
  9. Para la digestión de tejidos, añadir 50 μL de tripsina/EDTA al 0,25% durante 10 min a 37 °C. Aplique una disociación mecánica suave después de 5 minutos con gestos hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta de filtro de orificio ancho.
  10. Inactivar la actividad digestiva de tripsina añadiendo 350 μL de medio completo a las células disociadas. Pasar las células resuspendidas a través de un filtro celular de 40 μm.

3. Recuento celular y evaluación de viabilidad

NOTA: El recuento de células y la viabilidad son parámetros críticos para el éxito de los experimentos de una sola célula. El enfoque snATAC-seq es sensible a variaciones menores en el número de células. Muy pocas células conducen a la digestión excesiva de la cromatina, lo que resulta en un mayor número de lecturas y el mapeo de regiones de cromatina inaccesibles (ruido). Del mismo modo, tener demasiadas células genera fragmentos de alto peso molecular que son difíciles de secuenciar. Para la determinación precisa de las concentraciones de células y núcleos, el recuento de células y la viabilidad se evaluaron mediante dos métodos diferentes.

  1. Realice un ensayo de azul de tripano para el recuento celular, como se describe a continuación.
    1. Solución de tinción de azul de tripano al 0,4% de vórtice, centrifugar durante 10 s a temperatura ambiente a 2.000 x g y transferir 10 μL a un microtubo.
    2. Con una pipeta, mezclar la suspensión celular y añadir 10 μL de suspensión a los 10 μL de solución de azul de tripano ya alistados. Mezclar cuidadosamente 10 veces con una pipeta.
    3. Transfiera 10 μL de las células teñidas a un portaobjetos de conteo. Coloque la corredera en el contador para calcular automáticamente la concentración y viabilidad de la célula.
  2. Realizar una evaluación de mortalidad basada en fluorescencia como se describe a continuación.
    NOTA: Este ensayo se basa en el uso de colorantes fluorescentes (ethidium homodimer-1, EthD-1 y calcein AM) para evaluar la viabilidad celular. Se utilizó un kit disponible comercialmente y se siguieron las instrucciones del proveedor para la preparación y el uso apropiados.
    1. Prepare una solución de EthD-1 de 10 μM agregando 5 μL de la solución madre de 2 mM de EthD-1 suministrada a 1 ml de D-PBS estéril de grado de cultivo tisular, y vórtice durante 5 s para garantizar una mezcla completa.
    2. Transfiera 2,5 μL de la solución madre de calceína AM de 4 mM suministrada a la solución EthD-1 ya preparada. Vórtice durante 5 s para asegurar una mezcla completa.
    3. Añadir 10 μL de la solución de trabajo resultante de 10 μM EthD-1 y 10 μM de calceína AM a 10 μL de suspensión celular.
      NOTA: La calceína es altamente susceptible a la hidrólisis en soluciones acuosas, así que use esta solución de trabajo dentro de 1 día.
    4. Transfiera 10 μL de las células teñidas a un portaobjetos de conteo. Inserte la diapositiva en el contador automático de células fluorescentes. Cuente las celdas vivas con un filtro GFP y las celdas muertas con un filtro RFP.
      NOTA: Los dos métodos de conteo dieron recuentos celulares y viabilidad similares, y se estimó que el número total de células recién disociadas promedió alrededor de 20,000 células por región cardíaca embrionaria (0.06 mm3).

4. Congelación celular

  1. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante sin tocar el fondo del tubo y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio de congelación refrigerado.
  2. Transfiera la suspensión celular a un criovial preenfriado y coloque el criovial en un recipiente de congelación preenfriado.
  3. Colocar el envase a −80 ◦C durante 4 h a 8 h. Transfiera el criovial al nitrógeno líquido para experimentos de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC aguas abajo.
    NOTA: El criovial debe ser transportado en hielo seco antes de su uso. En nuestra experiencia, las células pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante al menos 6 meses sin pérdida de viabilidad celular. La temperatura de almacenamiento debe mantenerse por debajo de -150 ° C en todo momento para evitar la formación de cristales de hielo.

5. Descongelación celular y eliminación de células muertas

  1. Coloque los crioviales en un baño maría a 37 °C durante 1-2 min. Retírelo cuando quede un pequeño cristal en el criovial.
  2. Añadir 1 ml de medio completo precalentado (37 °C). Mezclar con una pipeta tres veces. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de medio completo caliente.
  3. Pasar toda la suspensión celular sobre un colador de 30 μm. Enjuague el colador con 1-2 ml de medio completo tibio y recoja el flujo en el mismo tubo cónico.
  4. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Lave una vez con PBS y transfiera la suspensión celular a un microtubo de 1,5 ml.
  5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, y retirar el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular.
  6. Agregue 100 μL de las microperlas magnéticas proporcionadas a las células peletizadas y homogeneice cinco veces con una punta de pipeta de diámetro ancho. Incubar durante 15 min en RT.
  7. Mientras tanto, enjuague la columna de separación magnética (capacidad: 1 x 107 a 2 x 108 celdas) con 500 μL de 1x tampón de unión.
  8. Una vez completada la incubación, diluir la suspensión celular que contiene las microperlas con 500 μL de tampón de unión 1x.
  9. Aplique la suspensión celular (0,6 μL) a la columna de separación magnética preparada. El flujo es la fracción de células vivas seleccionadas negativamente, y la fracción retenida magnéticamente son las células muertas seleccionadas positivamente.
  10. Recoger el efluente de células vivas en un tubo de centrífuga de 15 ml. Enjuague el microtubo de 1,5 ml que contenía la suspensión celular y la columna con 2 ml de tampón de unión 1x, y recoja el efluente en el mismo tubo de 15 ml.
  11. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular.
  12. Añadir 1 ml de la solución de PBS-BSA y mezclar suavemente pipeteando cinco veces con una punta de pipeta de orificio ancho. Transfiera la suspensión celular a un microtubo de 1,5 ml.
  13. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular.
  14. Agregue 1 ml de PBS-BSA para resuspender el pellet y repita el paso de lavado para un total de dos lavados.
  15. Resuspender las células en 100 μL de solución PBS-BSA. Mezclar suavemente pipeteando 10 veces.
  16. Determinar la concentración y viabilidad de las células utilizando los métodos descritos anteriormente (paso 3.1 y paso 3.2). Para continuar con el siguiente paso, asegúrese de un recuento de células de ≥100.000 celdas. Consulte la figura 2 para obtener resultados representativos.
    NOTA: La criopreservación resulta en una pérdida de aproximadamente el 40% del material de partida inicial de las células vivas. Dependiendo del número inicial de células, la separación de cuentas en una columna magnética da como resultado una alta viabilidad celular, pero divide el número total de células por dos a cinco veces. La utilización de un kit magnético basado en columnas para eliminar las células muertas se recomienda solo cuando se dispone de suficiente material de partida.

6. Aislamiento de núcleos

NOTA: snATAC y snRNA-seq combinados se realizan con una suspensión de núcleos limpios e intactos. Se recomienda la optimización de las condiciones de lisis (tiempo de lisis y concentración de NP40) para el tipo de célula utilizada. El punto de tiempo óptimo de lisis y la concentración de detergente son aquellos que resultan en el número máximo de células que se lisan sin interrumpir la morfología nuclear. La pérdida de células/núcleos se puede reducir utilizando una centrífuga de cucharón oscilante en lugar de una centrífuga de ángulo fijo. Para minimizar la retención de núcleos en los plásticos, se recomienda utilizar puntas de pipeta de baja retención y tubos de centrífuga. Esto puede aumentar la recuperación de los núcleos. El recubrimiento de las puntas de pipeta y los tubos de centrífuga con BSA al 5% es una alternativa menos costosa pero que requiere más tiempo.

  1. Limpie el lugar de trabajo y los materiales con etanol al 70% y solución de eliminación de RNasa.
  2. Centrifugadoras de cucharón oscilante Prechill a 4 °C. Tampón de lisis recién preparado, tampón de dilución de lisis, tampón de lisis 0.1x y tampón de lavado (ver Tabla 1). Mantenga los tampones en hielo.
  3. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga de cucharón oscilante. Retire suavemente todo el sobrenadante sin tocar el fondo del tubo para evitar desalojar el pellet celular.
  4. Añadir 100 μL de tampón de lisis 0,1x refrigerado. Mezclar suavemente pipeteando 10 veces. Incubar durante 5 minutos en hielo.
  5. Agregue 1 ml de tampón de lavado refrigerado y mezcle suavemente pipeteando cinco veces. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante sin interrumpir el pellet del núcleo.
  6. Repita los lavados con tampón de lavado refrigerado para un total de tres lavados. Prepare el tampón de núcleos diluidos. Después de la resuspensión, mantenga la solución madre de núcleos en hielo.

7. Evaluaciones cualitativas y cuantitativas de los núcleos aislados

NOTA: Sobre la base del recuento inicial de células y la estimación de aproximadamente el 50% de pérdida de núcleos durante la lisis celular, resuspender el número apropiado de células en tampón de núcleos diluidos en frío. El cálculo del volumen de resuspensión con tampón de núcleos diluidos refrigerados se basa en la recuperación de núcleos prevista y las concentraciones correspondientes de núcleos recomendadas por la guía del usuario del fabricante. Véase un ejemplo de este cálculo en el Protocolo suplementario 1.

  1. Sobre la base del recuento inicial de células y la estimación de aproximadamente el 50% de pérdida de núcleos durante la lisis celular, resuspender el número apropiado de células en tampón de núcleos diluidos en frío.
  2. Determine la concentración real de núcleos. Mezclar 2 μL de solución madre de núcleos con 8 μL de tampón de núcleos diluidos y añadir la mezcla a los 10 μL prealistados de azul de tripano o solución de trabajo EthD-1/calceinAM. Cuente los núcleos usando un contador de celdas automatizado. Menos del 5% de las células deberían ser viables. Consulte la figura 3 para obtener resultados representativos.
  3. Calcular el volumen de existencias de núcleos y el volumen de tampón de núcleos diluidos para obtener un volumen total de 5 μL a la concentración recomendada para la reacción de transposición (consulte la guía del usuario del fabricante). Proceda inmediatamente a la reacción de transposición de acuerdo con la guía del usuario17.
    NOTA: Todos los pasos desde la reacción de transposición hasta la construcción de las bibliotecas ATAC y GEX se realizaron de acuerdo con la guía del usuario del kit utilizado para snRNA-seq y snATAC-seq combinados17.

8. Análisis de calidad de las bibliotecas snRNA-seq y snATAC-seq

  1. Antes de proceder a la secuenciación de próxima generación, valide la calidad y la distribución de tamaño de las bibliotecas finales snATAC-seq y GEX de expresión génica. Evaluar la calidad y cantidad de secuencias identificadas en las bibliotecas utilizando sistemas de análisis de fragmentos. Consulte la Figura 4 para obtener resultados representativos de la evaluación de la calidad.
    NOTA: La traza final de las bibliotecas snATAC-seq debe mostrar la periodicidad del devanado nucleosomal, y los tamaños deben variar de 200 pb a varios Kbp, mientras que los tamaños en la biblioteca de expresión génica deben variar de 300 pb a 600 pb.

Resultados

En comparación con la preparación de suspensiones unicelulares para enfoques unicelulares, la preparación de suspensiones de un solo núcleo es mucho más desafiante y requiere un mayor grado de resolución y procesamiento. El factor clave para el éxito combinado de snRNA-seq y snATAC-seq es una suspensión de núcleos limpia e intacta. El protocolo para el aislamiento eficiente de los núcleos debe adaptarse a cada tipo de tejido y condición (fresco o congelado). Aquí, se describe un protocolo optimizado para el a...

Discusión

El análisis de la composición celular del corazón en desarrollo por estudios combinados de snRNA-seq y snATAC-seq proporciona una comprensión más profunda del origen de la cardiopatía congénita26. Varios laboratorios de investigación han estudiado los efectos de la criopreservación del tejido cardíaco en snRNA-seq27. La realización de snRNA-seq y snATAC-seq utilizando tejido fresco microdisecado de modelos de ratón de enfermedades humanas puede ser un desafío l...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por ERA-CVD-2019 y ANR-JCJC-2020 a SS. Agradecemos a la instalación de Genómica y Bioinformática (GBiM) del laboratorio de Genética Médica U 1251 / Marsella y a los revisores anónimos por proporcionar valiosos comentarios.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentNo catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo catalog number
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSNo catalog number

Referencias

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