Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

Abstract

Il cuore in via di sviluppo è una struttura complessa contenente varie cellule progenitrici controllate da complessi meccanismi di regolazione. L'esame dell'espressione genica e dello stato della cromatina delle singole cellule consente l'identificazione del tipo e dello stato cellulare. Gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno rivelato una serie di importanti caratteristiche dell'eterogeneità delle cellule progenitrici cardiache. Tuttavia, questi metodi sono generalmente limitati al tessuto fresco, il che limita gli studi con diverse condizioni sperimentali, poiché il tessuto fresco deve essere trattato contemporaneamente nello stesso ciclo per ridurre la variabilità tecnica. Pertanto, in quest'area sono necessarie procedure semplici e flessibili per produrre dati da metodi quali il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (snATAC-seq). Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei per i successivi nuclei singoli dual-omici (combinati snRNA-seq e snATAC-seq). Questo metodo consente l'isolamento di nuclei da campioni congelati di cellule progenitrici cardiache e può essere combinato con piattaforme che utilizzano camere microfluidiche.

Introduzione

Tra i difetti alla nascita, i difetti cardiaci congeniti (CHD) sono i più comuni, che si verificano in circa l'1% dei nati vivi ogni anno ^1,2. Le mutazioni genetiche sono identificate solo in una minoranza di casi, il che implica che altre cause, come anomalie nella regolazione genica, sono coinvolte nell'eziologia della CHD ^2,3. Lo sviluppo cardiaco è un processo complesso di tipi cellulari diversi e interagenti, che rende difficile l'identificazione delle mutazioni causali non codificanti e dei loro effetti sulla regolazione genica. L'organogenesi de....

Protocollo

La procedura animale adottata in questo studio è stata approvata dai comitati etici animali dell'Università di Aix-Marseille (C2EA-14) ed è stata eseguita secondo protocolli approvati dal comitato etico nazionale per la sperimentazione animale (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorizzazione Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Impostare l'accoppiamento temporizzato prima della dissezione

1. Per generare embrioni di topo, eseguire un accoppiamento temporizzato tra topi adulti 9,5 giorni prima dell'isolamento della regione cardiaca. In questa procedura, sono stati uti....

Discussione

L'analisi della composizione cellulare del cuore in via di sviluppo mediante studi combinati snRNA-seq e snATAC-seq fornisce una comprensione più profonda dell'origine della cardiopatia congenita²⁶. Diversi laboratori di ricerca hanno studiato gli effetti della crioconservazione dei tessuti cardiaci sull'snRNA-seq²⁷. Condurre snRNA-seq e snATAC-seq utilizzando tessuto fresco micro-sezionato da modelli murini di malattia umana può essere logisticamente impegnativo quando s.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number