Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

Abstract

Il cuore in via di sviluppo è una struttura complessa contenente varie cellule progenitrici controllate da complessi meccanismi di regolazione. L'esame dell'espressione genica e dello stato della cromatina delle singole cellule consente l'identificazione del tipo e dello stato cellulare. Gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno rivelato una serie di importanti caratteristiche dell'eterogeneità delle cellule progenitrici cardiache. Tuttavia, questi metodi sono generalmente limitati al tessuto fresco, il che limita gli studi con diverse condizioni sperimentali, poiché il tessuto fresco deve essere trattato contemporaneamente nello stesso ciclo per ridurre la variabilità tecnica. Pertanto, in quest'area sono necessarie procedure semplici e flessibili per produrre dati da metodi quali il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (snATAC-seq). Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei per i successivi nuclei singoli dual-omici (combinati snRNA-seq e snATAC-seq). Questo metodo consente l'isolamento di nuclei da campioni congelati di cellule progenitrici cardiache e può essere combinato con piattaforme che utilizzano camere microfluidiche.

Introduzione

Tra i difetti alla nascita, i difetti cardiaci congeniti (CHD) sono i più comuni, che si verificano in circa l'1% dei nati vivi ogni anno ^1,2. Le mutazioni genetiche sono identificate solo in una minoranza di casi, il che implica che altre cause, come anomalie nella regolazione genica, sono coinvolte nell'eziologia della CHD ^2,3. Lo sviluppo cardiaco è un processo complesso di tipi cellulari diversi e interagenti, che rende difficile l'identificazione delle mutazioni causali non codificanti e dei loro effetti sulla regolazione genica. L'organogenesi del cuore inizia con progenitori cellulari che danno origine a diversi sottotipi di cellule cardiache, tra cui cellule miocardiche, fibroblasti, epicardiche ed endocardiche ^4,5. La genomica unicellulare sta emergendo come metodo chiave per studiare lo sviluppo del cuore e valutare l'impatto dell'eterogeneità cellulare nella salute e nella malattia⁶. Lo sviluppo di metodi multi-omici per la misurazione simultanea di diversi parametri e l'espansione di pipeline computazionali ha facilitato la scoperta di tipi e sottotipi cellulari nel cuore normale e malato⁶. Questo articolo descrive un protocollo affidabile di isolamento a singolo nucleo per cellule progenitrici cardiache congelate ottenute da embrioni di topo che è compatibile con snRNA-seq e snATAC-seq a valle (così come snRNA-seq e snATAC-seq combinati)^7,8,9.

ATAC-seq è un metodo robusto che consente l'identificazione delle regioni regolatorie della cromatina aperta e il posizionamento dei nucleosomi^10,11. Queste informazioni vengono utilizzate per trarre conclusioni sulla posizione, l'identità e l'attività dei fattori di trascrizione. L'attività dei fattori cromatinici, compresi i rimodellatori, così come l'attività trascrizionale della RNA polimerasi, possono quindi essere analizzate poiché il metodo è altamente sensibile per misurare i cambiamenti quantitativi nella struttura della cromatina ^1,2. Pertanto, ATAC-seq fornisce un approccio robusto e imparziale per scoprire i meccanismi che controllano la regolazione trascrizionale in un tipo specifico di cellula. I protocolli ATAC-seq sono stati anche validati per misurare l'accessibilità della cromatina in singole cellule, rivelando variabilità nell'architettura della cromatina all'interno delle popolazioni cellulari^10,12,13.

Sebbene negli ultimi anni vi siano stati notevoli progressi nel campo delle singole cellule, la difficoltà principale è l'elaborazione dei campioni freschi necessari per eseguire questi esperimenti¹⁴. Per aggirare questa difficoltà, sono stati effettuati vari test con l'obiettivo di condurre analisi come snRNA-seq e snATAC-seq con tessuto cardiaco congelato o cellule^15,16.

Diverse piattaforme sono state utilizzate per analizzare i dati genomici di singole cellule¹⁷. Le piattaforme ampiamente utilizzate per l'espressione genica di singole cellule e il profilo ATAC sono piattaforme per l'incapsulamento multiplo di goccioline microfluidiche¹⁷. Poiché queste piattaforme utilizzano camere microfluidiche, detriti o aggregati possono ostruire il sistema, con conseguente inutilizzabilità dei dati. Pertanto, il successo degli studi su singole cellule dipende dall'isolamento accurato delle singole cellule / nuclei.

Il protocollo qui presentato utilizza un approccio simile a studi recenti che utilizzano snRNA-seq e snATAC-seq per comprendere i difetti cardiaci congeniti 18,19,20,21,22,23. Questa procedura utilizza la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco appena microdissecato seguito dalla crioconservazione delle cellule progenitrici cardiache di topo. Dopo lo scongelamento, le cellule vitali vengono purificate e lavorate per l'isolamento nucleare. In questo lavoro, questo protocollo è stato utilizzato con successo per ottenere dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione nucleare di cellule progenitrici cardiache di topo.

Protocollo

La procedura animale adottata in questo studio è stata approvata dai comitati etici animali dell'Università di Aix-Marseille (C2EA-14) ed è stata eseguita secondo protocolli approvati dal comitato etico nazionale per la sperimentazione animale (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorizzazione Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Impostare l'accoppiamento temporizzato prima della dissezione

1. Per generare embrioni di topo, eseguire un accoppiamento temporizzato tra topi adulti 9,5 giorni prima dell'isolamento della regione cardiaca. In questa procedura, sono stati utilizzati topi selvatici C57BL / 6J di età compresa tra 2 e 6 mesi e l'accoppiamento temporizzato è stato eseguito durante la notte.
2. La mattina dopo, controlla se i topi femmina hanno un tappo vaginale. Si consideri il giorno in cui la spina viene identificata come giorno embrionale (E) 0,5.

2. Preparazione dei tessuti e isolamento cellulare

1. Eutanasia C57BL/6J femmina incinta di 2-6 mesi al giorno 9,5 post-concepimento tramite CO₂ con una concentrazione crescente seguita da lussazione cervicale. Pulire la parte inferiore dell'addome con etanolo al 70%.
   NOTA: L'uso di anestetici prima della lussazione cervicale non è raccomandato in quanto ciò esporrebbe gli embrioni a cambiamenti ambientali che potrebbero influire sui successivi studi trascrittomici ed epigenomici.
2. Apri l'addome e il peritoneo con le forbici. Visualizza le corna uterine e usa una pinza per asportare entrambe le corna.
3. Mettere le corna in una capsula di Petri contenente mezzo completo freddo con 1% FBS. Sebbene non sia richiesto un volume specifico, è necessario prestare attenzione per garantire che gli embrioni siano completamente immersi nel mezzo. Un volume approssimativo di 10 ml per capsula di Petri di 10 cm è appropriato.
4. Sotto lo stereomicroscopio impostato a ingrandimento 5x e usando una pinza, rimuovere il tessuto endometriale, la placenta e il sacco vitellino da ciascun embrione.
5. Mettere gli embrioni in una capsula di Petri con mezzo completo freddo con 1% FBS. Sezionare la regione cardiaca embrionale, come descritto sull'embrione schematico illustrato nella Figura 1, in mezzo completo a freddo.
6. Raggruppa insieme le regioni cardiache sezionate da cinque embrioni di topo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Prechill centrifughe a tazze oscillanti a 4 °C.
7. Centrifugare a 300x g per 1 minuto a RT in una centrifuga a secchio oscillante. Rimuovere il surnatante e lavare i tessuti aggiungendo 1 ml di PBS per coltura tissutale.
8. Centrifugare a 300 x g per 1 minuto a RT. Rimuovere il surnatante e ripetere i passaggi di lavaggio per un totale di due lavaggi. Ripetere il lavaggio due volte, sostituendo il PBS con tripsina/EDTA allo 0,05% (1x).
9. Per la digestione dei tessuti, aggiungere 50 μL di tripsina/EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C. Applicare una leggera dissociazione meccanica dopo 5 minuti con gesti su e giù utilizzando una punta del filtro a orifizio largo.
10. Inattivare l'attività di digestione della tripsina aggiungendo 350 μL di mezzo completo alle cellule dissociate. Far passare le cellule risospese attraverso un filtro cellulare da 40 μm.

3. Conteggio delle cellule e valutazione della vitalità

NOTA: Il conteggio delle cellule e la vitalità sono parametri critici per il successo degli esperimenti su singole cellule. L'approccio snATAC-seq è sensibile a piccole variazioni nel numero di cellule. Troppe poche cellule portano a un'eccessiva digestione della cromatina, che si traduce in un numero maggiore di letture e nella mappatura di regioni di cromatina inaccessibili (rumore). Allo stesso modo, avere troppe cellule genera frammenti ad alto peso molecolare che sono difficili da sequenziare. Per la determinazione accurata delle concentrazioni di cellule e nuclei, il conteggio delle cellule e la vitalità sono stati valutati con due diversi metodi.

1. Eseguire un test del blu tripano per il conteggio delle cellule, come descritto di seguito.
   1. Soluzione colorante al blu tripano allo 0,4%, centrifugare per 10 s a temperatura ambiente a 2.000 x g e trasferire 10 μL in un microtubo.
   2. Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare e aggiungere 10 μL di sospensione ai 10 μL di soluzione di tripano blu già aliquotati. Mescolare accuratamente 10 volte con una pipetta.
   3. Trasferire 10 μL delle cellule colorate in un vetrino di conteggio. Posizionare il vetrino nel contatore per calcolare automaticamente la concentrazione e la vitalità della cella.
2. Eseguire una valutazione della mortalità basata sulla fluorescenza come descritto di seguito.
   NOTA: Questo test si basa sull'uso di coloranti fluorescenti (omodimero di etidio-1, EthD-1 e calceina AM) per valutare la vitalità cellulare. È stato utilizzato un kit disponibile in commercio e sono state seguite le istruzioni del fornitore per la preparazione e l'uso appropriati.
   1. Preparare una soluzione di EthD-1 da 10 μM aggiungendo 5 μL della soluzione madre di 2 mM EthD-1 fornita a 1 mL di D-PBS sterile di grado di coltura tissutale e vortice per 5 s per garantire una miscelazione completa.
   2. Trasferire 2,5 μL della soluzione madre di calceina AM da 4 mM fornita alla soluzione di EthD-1 già preparata. Vortice per 5 s per garantire una miscelazione completa.
   3. Aggiungere 10 μL della soluzione di lavoro risultante di EthD-1 e 10 μM di calceina AM a 10 μL di sospensione cellulare.
      NOTA: La calceina è altamente suscettibile all'idrolisi in soluzioni acquose, quindi utilizzare questa soluzione di lavoro entro 1 giorno.
   4. Trasferire 10 μL delle cellule colorate su un vetrino di conteggio. Inserire il vetrino nel contatore automatico delle celle fluorescenti. Contare le celle vive usando un filtro GFP e le celle morte con un filtro RFP.
      NOTA: I due metodi di conteggio hanno fornito conteggi cellulari e vitalità simili, e il numero totale di cellule appena dissociate è stato stimato in media intorno a 20.000 cellule per regione cardiaca embrionale (0,06 mm³).

4. Congelamento delle cellule

1. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante senza toccare il fondo del tubo e risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di congelamento refrigerato.
2. Trasferire la sospensione cellulare in un crioviale pre-raffreddato e posizionare il crioviale in un contenitore di congelamento pre-raffreddato.
3. Posizionare il contenitore a -80 ^◦C per 4-8 ore. Trasferire il crioviale in azoto liquido per esperimenti di sequenziamento a valle di RNA a singolo nucleo e ATAC.
   NOTA: Il crioviale deve essere trasportato su ghiaccio secco prima dell'uso. Nella nostra esperienza, le cellule possono essere conservate in azoto liquido per almeno 6 mesi senza perdita di vitalità cellulare. La temperatura di conservazione deve essere mantenuta sempre al di sotto di -150 °C per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio.

5. Scongelamento delle cellule e rimozione delle cellule morte

1. Mettere i crioviali a bagnomaria a 37 °C per 1-2 min. Rimuoverlo quando un piccolo cristallo rimane nel crioviale.
2. Aggiungere 1 mL di mezzo completo preriscaldato (37 °C). Mescolare con una pipetta tre volte. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di mezzo completo caldo.
3. Far passare l'intera sospensione cellulare su un filtro da 30 μm. Risciacquare il filtro con 1-2 ml di mezzo completo caldo e raccogliere il flusso nello stesso tubo conico.
4. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare una volta con PBS e trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da 1,5 ml.
5. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
6. Aggiungere 100 μL delle microsfere magnetiche fornite alle celle pellettate e omogeneizzare cinque volte utilizzando una punta di pipetta ad ampio foro. Incubare per 15 minuti a RT.
7. Nel frattempo, sciacquare la colonna di separazione magnetica (capacità: 1 x 10^{da 7} a 2 x 10⁸ celle) con 500 μL di 1x tampone legante.
8. Una volta completata l'incubazione, diluire la sospensione cellulare contenente le microsfere con 500 μL di tampone legante 1x.
9. Applicare la sospensione cellulare (0,6 μL) alla colonna di separazione magnetica preparata. Il flow-through è la frazione di cellule vive selezionata negativamente e la frazione trattenuta magneticamente è costituita dalle cellule morte selezionate positivamente.
10. Raccogliere l'effluente della cella viva in una provetta da centrifuga da 15 ml. Risciacquare il microtubo da 1,5 mL che conteneva la sospensione cellulare e la colonna con 2 mL di tampone legante 1x e raccogliere l'effluente nello stesso tubo da 15 ml.
11. Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
12. Aggiungere 1 mL della soluzione PBS-BSA e mescolare delicatamente mediante pipettaggio cinque volte utilizzando una punta per pipetta a orifizio largo. Trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da 1,5 ml.
13. Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
14. Aggiungere 1 mL di PBS-BSA per risospendere il pellet e ripetere la fase di lavaggio per un totale di due lavaggi.
15. Risospendere le cellule in 100 μL di soluzione PBS-BSA. Mescolare delicatamente pipettando 10 volte.
16. Determinare la concentrazione e la vitalità delle cellule utilizzando i metodi precedentemente descritti (fase 3.1 e fase 3.2). Per procedere al passaggio successivo, assicurarsi di un conteggio delle cellule di ≥100.000 cellule. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi.
    NOTA: La crioconservazione comporta una perdita di circa il 40% del materiale di partenza iniziale delle cellule vive. A seconda del numero iniziale di celle, la separazione delle perle su una colonna magnetica si traduce in un'elevata vitalità cellulare, ma divide il numero totale di cellule da due a cinque volte. L'utilizzo di un kit magnetico a colonna per rimuovere le cellule morte è consigliato solo quando è disponibile materiale di partenza sufficiente.

6. Isolamento dei nuclei

NOTA: snATAC e snRNA-seq combinati vengono eseguiti con una sospensione di nuclei puliti e intatti. Si raccomanda l'ottimizzazione delle condizioni di lisi (tempo di lisi e concentrazione di NP40) per il tipo di cellula utilizzato. Il timepoint ottimale di lisi e la concentrazione del detergente sono quelli che determinano il massimo numero di cellule in lisatura senza interrompere la morfologia nucleare. La perdita di cellule/nuclei può essere ridotta utilizzando una centrifuga a secchio oscillante invece di una centrifuga ad angolo fisso. Per ridurre al minimo la ritenzione dei nuclei sulle materie plastiche, si consiglia di utilizzare puntali per pipette a bassa ritenzione e provette da centrifuga. Questo può aumentare il recupero dei nuclei. Il rivestimento delle punte delle pipette e delle provette da centrifuga con BSA al 5% è un'alternativa meno costosa ma più dispendiosa in termini di tempo.

1. Pulire il luogo di lavoro e i materiali con una soluzione di rimozione di etanolo e RNasi al 70%.
2. Prechill centrifughe a tazze oscillanti a 4 °C. Preparare il tampone di lisi, il tampone di diluizione di lisi, il tampone di lisi 0,1x e il tampone di lavaggio (vedere Tabella 1). Mantenere i buffer sul ghiaccio.
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C in una centrifuga a secchio oscillante. Rimuovere delicatamente tutto il surnatante senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il pellet cellulare.
4. Aggiungere 100 μL di tampone di lisi raffreddato 0,1x. Mescolare delicatamente pipettando 10 volte. Incubare per 5 minuti su ghiaccio.
5. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio refrigerato e mescolare delicatamente mediante pipettaggio cinque volte. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet dei nuclei.
6. Ripetere i lavaggi con tampone refrigerato per un totale di tre lavaggi. Preparare il tampone dei nuclei diluiti. Dopo la risospensione, mantenere la soluzione madre di nuclei su ghiaccio.

7. Valutazioni qualitative e quantitative dei nuclei isolati

NOTA: Sulla base della conta iniziale delle cellule e stimando circa il 50% della perdita di nuclei durante la lisi cellulare, risospendere il numero appropriato di cellule nel tampone dei nuclei diluiti a freddo. Il calcolo del volume di risospensione con tampone per nuclei diluiti refrigerati si basa sul recupero mirato dei nuclei e sulle corrispondenti concentrazioni di scorte di nuclei raccomandate dalla guida per l'utente del produttore. Si veda un esempio di questo calcolo nel protocollo addizionale 1.

1. Sulla base del conteggio iniziale delle cellule e stimando circa il 50% della perdita di nuclei durante la lisi cellulare, risospendere il numero appropriato di cellule nel tampone dei nuclei diluiti a freddo.
2. Determinare la concentrazione effettiva dei nuclei. Mescolare 2 μL di soluzione madre di nuclei con 8 μL di tampone per nuclei diluiti e aggiungere la miscela ai 10 μL pre-aliquotati di soluzione di lavoro di tripano blu o EthD-1/calceinAM. Contare i nuclei utilizzando un contatore di celle automatico. Meno del 5% delle cellule dovrebbe essere vitale. Vedere la Figura 3 per i risultati rappresentativi.
3. Calcolare il volume dello stock di nuclei e il volume del tampone di nuclei diluiti per ottenere un volume totale di 5 μL alla concentrazione raccomandata per la reazione di trasposizione (fare riferimento alla guida per l'utente del produttore). Procedere immediatamente alla reazione di trasposizione secondo la guida per l'utente¹⁷.
   NOTA: Tutte le fasi dalla reazione di trasposizione alla costruzione delle librerie ATAC e GEX sono state eseguite secondo la guida utente del kit utilizzato per snRNA-seq e snATAC-seq combinati¹⁷.

8. Analisi di qualità delle librerie snRNA-seq e snATAC-seq

1. Prima di procedere al sequenziamento di nuova generazione, convalidare la qualità e la distribuzione dimensionale delle librerie finali snATAC-seq e GEX di espressione genica. Valutare la qualità e la quantità delle sequenze identificate nelle librerie utilizzando sistemi di analisi dei frammenti. Vedere la Figura 4 per i risultati rappresentativi della valutazione della qualità.
   NOTA: La traccia finale delle librerie snATAC-seq dovrebbe mostrare la periodicità dell'avvolgimento del nucleosoma e le dimensioni dovrebbero variare da 200 bp a diversi Kbp, mentre le dimensioni nella libreria di espressione genica dovrebbero variare da 300 bp a 600 bp.

Risultati

Rispetto alla preparazione di sospensioni a singola cellula per approcci a singola cellula, la preparazione di sospensioni a nucleo singolo è molto più impegnativa e richiede un grado più elevato di risoluzione ed elaborazione. Il fattore chiave per il successo combinato di snRNA-seq e snATAC-seq è una sospensione di nuclei puliti e intatti. Il protocollo per un isolamento efficiente dei nuclei deve essere adattato a ciascun tipo di tessuto e condizione (fresco o congelato). Qui viene descritto un protocollo ottimizz...

Discussione

L'analisi della composizione cellulare del cuore in via di sviluppo mediante studi combinati snRNA-seq e snATAC-seq fornisce una comprensione più profonda dell'origine della cardiopatia congenita²⁶. Diversi laboratori di ricerca hanno studiato gli effetti della crioconservazione dei tessuti cardiaci sull'snRNA-seq²⁷. Condurre snRNA-seq e snATAC-seq utilizzando tessuto fresco micro-sezionato da modelli murini di malattia umana può essere logisticamente impegnativo quando s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number