JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

Abstract

הלב המתפתח הוא מבנה מורכב המכיל תאי אב שונים הנשלטים על ידי מנגנוני בקרה מורכבים. בחינת ביטוי הגנים ומצב הכרומטין של תאים בודדים מאפשרת זיהוי סוג התא ומצבו. גישות ריצוף חד-תאי חשפו מספר מאפיינים חשובים של הטרוגניות תאי אב לבביים. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות בדרך כלל לרקמה טרייה, מה שמגביל מחקרים עם תנאי ניסוי מגוונים, מכיוון שיש לעבד את הרקמה הטרייה בבת אחת באותה ריצה כדי להפחית את השונות הטכנית. לכן, יש צורך בהליכים קלים וגמישים להפקת נתונים משיטות כגון ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNA-seq) ובדיקת גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (snATAC-seq) בתחום זה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד מהיר של גרעינים עבור אומיקה דואלית של גרעינים בודדים (snRNA-seq משולב ו-snATAC-seq). שיטה זו מאפשרת בידוד גרעינים מדגימות קפואות של תאי אב לבביים וניתן לשלב אותה עם פלטפורמות המשתמשות בתאים מיקרופלואידים.

Introduction

בקרב מומים מולדים, מומי לב מולדים (CHDs) הם הנפוצים ביותר, המתרחשים בכ -1% מלידות החי בכל שנה 1,2. מוטציות גנטיות מזוהות רק במיעוט מהמקרים, מה שמרמז על כך שגורמים אחרים, כגון חריגות בבקרת גנים, מעורבים באטיולוגיה של CHD 2,3. התפתחות הלב היא תהליך מורכב של סוגי תאים מגוונים ומקיימים אינטראקציה, מה שהופך את זיהוי מוטציות סיבתיות לא מקודדות והשפעותיהן על בקרת גנים למאתגר. אורגנוגנזה של הלב מתחילה באבות תאיים שיוצרים תת-סוגים שונים של תאי לב, כולל תאי מיוקרדיאל, פיברובלסט, אפיקרדיאלי ואנדוקרדיאלי 4,5. גנומיקה של תא בודד מתגלה כשיטת מפתח לחקר התפתחות הלב ולהערכת ההשפעה של הטרוגניות תאית על בריאות ומחלות6. פיתוח שיטות מולטי-אומיות למדידה סימולטנית של פרמטרים שונים והרחבת צינורות חישוביים הקל על גילוי סוגי תאים ותת-סוגים בלב תקין וחולה6. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידוד אמין של גרעין יחיד עבור תאי אב לבביים קפואים המתקבלים מעוברי עכברים, התואם ל- snRNA-seq ו- snATAC-seq במורד הזרם (כמו גם snRNA-seq ו- snATAC-seq בשילוב)7,8,9.

ATAC-seq היא שיטה חזקה המאפשרת זיהוי של אזורי כרומטין פתוחים רגולטוריים ומיקום של נוקלאוזומים10,11. מידע זה משמש להסקת מסקנות לגבי המיקום, הזהות והפעילות של גורמי שעתוק. ניתן לנתח את הפעילות של גורמי הכרומטין, כולל משפצים, כמו גם את פעילות השעתוק של RNA פולימראז, מכיוון שהשיטה רגישה מאוד למדידת שינויים כמותיים במבנה הכרומטין 1,2. לפיכך, ATAC-seq מספק גישה חזקה ונטולת פניות לחשיפת המנגנונים השולטים בוויסות שעתוק בסוג תא מסוים. פרוטוקולי ATAC-seq אומתו גם למדידת נגישות הכרומטין בתאים בודדים, וחשפו שונות בארכיטקטורת הכרומטין בתוך אוכלוסיות תאים10,12,13.

למרות שבשנים האחרונות חלה התקדמות ניכרת בתחום התאים הבודדים, הקושי העיקרי הוא עיבוד הדגימות הטריות הדרושות לביצוע ניסויים אלה14. כדי לעקוף קושי זה, בדיקות שונות בוצעו במטרה לבצע ניתוחים כגון snRNA-seq ו snATAC-seq עם רקמת לב קפואה או תאים15,16.

מספר פלטפורמות שימשו לניתוח נתוני גנומיקה של תא בודד17. הפלטפורמות הנפוצות לביטוי גנים של תא בודד ופרופיל ATAC הן פלטפורמות לאנקפסולציה של טיפות מיקרופלואידיות מרובות17. מכיוון שפלטפורמות אלה משתמשות בתאים מיקרופלואידים, פסולת או אגרגטים יכולים לסתום את המערכת, וכתוצאה מכך נתונים שאינם שמישים. לפיכך, הצלחתם של מחקרים חד-תאיים תלויה בבידוד מדויק של תאים/גרעינים בודדים.

הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בגישה דומה למחקרים אחרונים המשתמשים ב- snRNA-seq ו- snATAC-seq כדי להבין מומי לב מולדים 18,19,20,21,22,23. הליך זה משתמש בדיסוציאציה אנזימטית של רקמת לב טרייה שנותחה במיקרודיסקציה ואחריה שימור בהקפאה של תאי אב לבביים של עכברים. לאחר ההפשרה, התאים בני קיימא מטוהרים ומעובדים לבידוד גרעיני. בעבודה זו, פרוטוקול זה שימש בהצלחה להשגת נתוני snRNA-seq ו- snATAC-seq מאותה הכנה גרעינית של תאי אב לבביים של עכברים.

Protocol

נוהל בעלי החיים שאומץ במחקר זה אושר על ידי ועדות האתיקה של בעלי החיים באוניברסיטת אקס-מרסיי (C2EA-14) ובוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית הלאומית שמונתה לניסויים בבעלי חיים (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; אישור Apafis N°33927-20211111715507212).

1. הגדרת ההזדווגות המתוזמנת לפני הנתיחה

  1. כדי ליצור עוברי עכברים, בצעו הזדווגות מתוזמנת בין עכברים בוגרים 9.5 ימים לפני בידוד אזור הלב. בהליך זה נעשה שימוש בעכברי בר מסוג C57BL/6J בגילאי 2-6 חודשים, והזדווגות מתוזמנת בוצעה במהלך הלילה.
  2. למחרת בבוקר, בדוק אם לנקבות העכברים יש פקק בנרתיק. שקול את היום שבו התקע מזוהה כיום עוברי (E) 0.5.

2. הכנת רקמות ובידוד תאים

  1. הרדימו נקבה C57BL/6J בת 2-6 חודשים בהריון ביום 9.5 לאחר ההתעברות באמצעות CO2 עם ריכוז מוגבר ואחריו פריקת צוואר הרחם. נקה את החלק התחתון של הבטן עם 70% אתנול.
    הערה: השימוש בחומרי הרדמה לפני פריקת צוואר הרחם אינו מומלץ מכיוון שהדבר יחשוף את העוברים לשינויים סביבתיים שעלולים להשפיע על מחקרים שעתוק ואפיגנומיים עוקבים.
  2. פתח את הבטן ואת הצפק עם מספריים. דמיינו את קרני הרחם, והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את שתי הקרניים.
  3. מניחים את הקרניים בכלי פטרי המכיל מדיום שלם קר עם 1% FBS. אמנם אין צורך בנפח ספציפי, אך יש להקפיד על כך שהעוברים יהיו שקועים לחלוטין בתווך. נפח משוער של 10 מ"ל לכל צלחת פטרי 10 ס"מ מתאים.
  4. תחת הסטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 5 ובאמצעות מלקחיים, הסירו את רקמת רירית הרחם, השליה ושק החלמון מכל עובר.
  5. מניחים את העוברים בצלחת פטרי עם מדיום שלם קר עם 1% FBS. נתחו את אזור הלב העוברי, כפי שמתואר בעובר הסכמטי המתואר באיור 1, בתווך שלם וקר.
  6. אגוד אזורי הלב שנותחו מחמישה עוברי עכברים בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. צנטריפוגות דלי מתנדנדות מראש ל -4 מעלות צלזיוס.
  7. צנטריפוגה ב 300x גרם למשך דקה אחת ב- RT בצנטריפוגת דלי מתנדנדת. הסר את supernatant, ולשטוף את הרקמות על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS כיתה תרבית רקמה.
  8. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 1 דקות ב RT. להסיר את supernatant, ולחזור על שלבי הכביסה עבור סך של שתי כביסות. יש לחזור על השטיפה פעמיים, ולהחליף את PBS ב-0.05% טריפסין/EDTA (1x).
  9. לעיכול רקמות, יש להוסיף 50 μL של 0.25% טריפסין/EDTA למשך 10 דקות ב-37°C. החל דיסוציאציה מכנית עדינה לאחר 5 דקות על ידי מחוות למעלה ולמטה באמצעות קצה מסנן רחב פתח.
  10. להשבית את פעילות העיכול של טריפסין על ידי הוספת 350 μL של תווך מלא לתאים מנותקים. העבירו את התאים המרחפים מחדש דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.

3. ספירת תאים והערכת כדאיות

הערה: ספירת התאים והכדאיות הם פרמטרים קריטיים להצלחת ניסויים חד-תאיים. גישת snATAC-seq רגישה לשינויים קלים במספר התא. מעט מדי תאים מובילים לעיכול יתר של הכרומטין, מה שגורם למספר גבוה יותר של קריאות ולמיפוי של אזורי כרומטין בלתי נגישים (רעש). באופן דומה, ריבוי תאים יוצר מקטעים בעלי משקל מולקולרי גבוה שקשה לרצף אותם. לצורך קביעה מדויקת של ריכוזי התא והגרעינים, ספירת התאים ויכולת הקיום שלהם הוערכו בשתי שיטות שונות.

  1. בצע בדיקת טריפאן כחול לספירת תאים, כמתואר להלן.
    1. מערבולת 0.4% תמיסת צביעה כחולה טריפאן, מסתובבת במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר ב 2,000 x גרם, ומעבירה 10 μL לתוך מיקרו-צינור.
    2. בעזרת פיפטה, מערבבים את תרחיף התא, ומוסיפים 10 μL של תרחיף ל-10 μL של תמיסת טריפאן כחולה. מערבבים בזהירות 10 פעמים עם פיפטה.
    3. העבר 10 μL של התאים המוכתמים לשקופית ספירה. מקם את השקופית בדלפק כדי לחשב באופן אוטומטי את ריכוז התא ואת הכדאיות.
  2. לבצע הערכה מבוססת פלואורסצנטיות של התמותה כמתואר להלן.
    הערה: בדיקה זו מבוססת על שימוש בצבעים פלואורסצנטיים (ethidium homodimer-1, EthD-1 ו-calcein AM) כדי להעריך את כדאיות התא. נעשה שימוש בערכה מסחרית, והוראות הספק מולאו לצורך הכנה ושימוש מתאימים.
    1. הכן תמיסת EthD-1 של 10 מיקרומטר על ידי הוספת 5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי EthD-1 של 2 mM שסופקה ל- 1 מ"ל של D-PBS סטרילי בדרגת תרבית רקמה, ומערבולת למשך 5 שניות כדי להבטיח ערבוב מלא.
    2. העבר 2.5 μL של פתרון מלאי AM של 4 mM calcein המסופק לפתרון EthD-1 שכבר הוכנה. מערבולת במשך 5 שניות כדי להבטיח ערבוב מלא.
    3. הוסף 10 μL של 10 μM EthD-1 ו 10 μM calcein AM פתרון עבודה ל 10 μL של השעיית התא.
      הערה: קלצאין רגיש מאוד להידרוליזה בתמיסות מימיות, לכן השתמש בתמיסת עבודה זו תוך יום אחד.
    4. העבר 10 μL של התאים המוכתמים לשקופית ספירה. הכנס את השקופית למונה התאים הפלואורסצנטיים האוטומטי. ספור את התאים החיים באמצעות מסנן GFP ואת התאים המתים באמצעות מסנן RFP.
      הערה: שתי שיטות הספירה נתנו ספירת תאים דומה וכדאיות, והמספר הכולל של תאים מנותקים טריים הוערך בממוצע בסביבות 20,000 תאים לכל אזור לב עוברי (0.06 מ"מ3).

4. הקפאת תאים

  1. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות להסיר את supernatant מבלי לגעת בתחתית הצינור, ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום הקפאה צונן.
  2. מעבירים את תרחיף התא לקריובל מקורר מראש, ומניחים את הקריוביאל במיכל הקפאה מקורר מראש.
  3. מניחים את המיכל על −80 ◦C במשך 4 שעות עד 8 שעות. העבר את הקריוביאל לחנקן נוזלי עבור ניסויי RNA של גרעין יחיד במורד הזרם וריצוף ATAC.
    הערה: יש להעביר את ההקפאה על קרח יבש לפני השימוש. מניסיוננו, התאים עשויים להיות מאוחסנים בחנקן נוזלי למשך 6 חודשים לפחות ללא אובדן יכולת הקיום של התא. טמפרטורת האחסון צריכה להישמר מתחת ל -150 מעלות צלזיוס כל הזמן כדי למנוע היווצרות גבישי קרח.

5. הפשרת תאים וסילוקם של תאים מתים

  1. הכניסו את הקריובלים לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 דקות. הסר אותו כאשר גביש זעיר נשאר בהקפאה.
  2. יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום שלם שחומם מראש (37°C). מערבבים עם פיפטה שלוש פעמים. מעבירים את המתלה לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום שלם חם.
  3. מעבירים את כל מתלה התא מעל מסננת של 30 מיקרומטר. שוטפים את המסננת עם 1-2 מ"ל של מדיום שלם חם, ואוספים את הזרימה באותו צינור חרוט.
  4. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולהסיר supernatant. שטפו פעם אחת עם PBS, והעבירו את תרחיף התא למיקרו-צינור בנפח 1.5 מ"ל.
  5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את כדור התא.
  6. הוסף 100 μL של מיקרו-כדוריות מגנטיות שסופקו לתאים הכדוריים, והומוגניזציה חמש פעמים באמצעות קצה פיפטה רחב. דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
  7. בינתיים, שטפו את עמוד ההפרדה המגנטי (קיבולת: 1 x 107 עד 2 x 108 תאים) עם 500 μL של 1x מאגר קשירה.
  8. לאחר השלמת הדגירה, לדלל את תרחיף התא המכיל את microbeads עם 500 μL של 1x חיץ קשירה.
  9. החל את תרחיף התא (0.6 μL) על עמודת ההפרדה המגנטית המוכנה. הזרימה היא מקטע התא החי שנבחר באופן שלילי, והמקטע השמור מגנטית הוא התאים המתים שנבחרו באופן חיובי.
  10. לאסוף את שפכי התא החי בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שטפו את המיקרו-צינור בנפח 1.5 מ"ל שהכיל את תרחיף התא ואת העמוד ב-2 מ"ל של חיץ מחייב 1x, ואספו את השפכים באותו צינור של 15 מ"ל.
  11. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.
  12. הוסף 1 מ"ל של תמיסת PBS-BSA, וערבב בעדינות על ידי פיפטציה חמש פעמים באמצעות קצה פיפטה רחב פתח. העבר את תרחיף התא לתוך microtube 1.5 מ"ל.
  13. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.
  14. הוסף 1 מ"ל של PBS-BSA כדי להשעות מחדש את הכדורית, וחזור על שלב הכביסה בסך הכל שתי כביסות.
  15. להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של תמיסת PBS-BSA. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג 10 פעמים.
  16. לקבוע את הריכוז ואת הכדאיות של התאים באמצעות השיטות שתוארו לעיל (שלב 3.1 ושלב 3.2). כדי להמשיך לשלב הבא, ודא ספירת תאים של ≥100,000 תאים. ראו איור 2 לקבלת תוצאות מייצגות.
    הערה: שימור בהקפאה גורם לאובדן של כ-40% מחומר המוצא הראשוני של תאים חיים. בהתאם למספר התאים ההתחלתי, הפרדת חרוזים על עמוד מגנטי גורמת לכדאיות גבוהה של התא, אך מחלקת את מספר התאים הכולל פי שניים עד פי חמישה. מומלץ להשתמש בערכה מגנטית מבוססת עמוד כדי להסיר את התאים המתים רק כאשר יש מספיק חומר מוצא זמין.

6. בידוד גרעינים

הערה: snATAC ו- snRNA-seq משולבים מבוצעים עם תרחיף של גרעינים נקיים ושלמים. מומלץ לבצע אופטימיזציה של תנאי הליזיס (זמן ליזה וריכוז NP40) עבור סוג התא המשומש. נקודת הזמן האופטימלית של הליזה וריכוז הדטרגנטים הם אלה שמביאים למספר המרבי של תאים להיות lysed מבלי לשבש את המורפולוגיה הגרעינית. ניתן להפחית את אובדן התאים / גרעינים באמצעות צנטריפוגת דלי מתנדנדת במקום צנטריפוגה בעלת זווית קבועה. כדי למזער את שימור הגרעינים על פלסטיק, מומלץ להשתמש בקצוות פיפטה בעלי שימור נמוך ובצינורות צנטריפוגה. זה יכול להגביר את התאוששות הגרעינים. ציפוי קצות הפיפטה ושפופרות הצנטריפוגות ב-5% BSA הוא חלופה זולה יותר אך גוזלת יותר זמן.

  1. נקו את מקום העבודה והחומרים עם 70% אתנול ותמיסת הסרת RNase.
  2. צנטריפוגות דלי מתנדנדות מראש ל -4 מעלות צלזיוס. הכינו טרייה של חיץ ליזיס, חיץ דילול ליזיס, חיץ ליזיס 0.1x ומאגר כביסה (ראו טבלה 1). שמור את החוצצים על קרח.
  3. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגת דלי מתנדנדת. הסר בעדינות את כל הסופרנאטנט מבלי לגעת בתחתית הצינור כדי למנוע תזוזה של גלולת התא.
  4. הוסף 100 μL של חיץ ליזיס 0.1x מקורר. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג 10 פעמים. דוגרים במשך 5 דקות על קרח.
  5. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ כביסה צונן, ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג חמש פעמים. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. מוציאים את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית הגרעינים.
  6. חזרו על השטיפות עם חיץ כביסה צונן במשך שלוש כביסות בסך הכל. הכינו את מאגר הגרעינים המדולל. לאחר ההשעיה, שמור את תמיסת מלאי הגרעינים על קרח.

7. הערכות איכות וכמות של הגרעינים המבודדים

הערה: בהתבסס על ספירת התאים הראשונית והערכת אובדן גרעינים של כ-50% במהלך ליזה של התא, יש להשהות מחדש את מספר התאים המתאים במאגר גרעינים מדוללים קרים. חישוב נפח המתלה עם חיץ גרעינים מדוללים מקורר מבוסס על שחזור גרעינים ממוקד וריכוזי מלאי הגרעינים המתאימים המומלצים על ידי מדריך המשתמש של היצרן. ראה דוגמה לחישוב זה בפרוטוקול משלים 1.

  1. בהתבסס על ספירת התאים הראשונית ואומדן אובדן גרעינים של כ-50% במהלך ליזה של התא, יש להשהות מחדש את מספר התאים המתאים במאגר גרעינים מדוללים קרים.
  2. לקבוע את ריכוז הגרעינים בפועל. ערבבו 2 μL של תמיסת מלאי גרעינים עם 8 μL של מאגר גרעינים מדולל והוסיפו את התערובת לתמיסת העבודה 10 μL של טריפאן כחול או EthD-1/calceinAM. ספור את הגרעינים באמצעות מונה תאים אוטומטי. פחות מ -5% מהתאים צריכים להיות בני קיימא. ראו איור 3 לקבלת תוצאות מייצגות.
  3. חשב את נפח מלאי הגרעינים ואת נפח מאגר הגרעינים המדולל כדי לקבל נפח כולל של 5 μL בריכוז המומלץ לתגובת הטרנספוזיציה (עיין במדריך למשתמש של היצרן). המשך מיד לתגובת הטרנספוזיציה על פי המדריך למשתמש17.
    הערה: כל השלבים מתגובת הטרנספוזיציה לבניית ספריות ATAC ו- GEX בוצעו בהתאם למדריך למשתמש של הערכה המשמשת עבור snRNA-seq ו- snATAC-seq בשילוב17.

8. ניתוח איכות של ספריות snRNA-seq ו- snATAC-seq

  1. לפני שתמשיך לריצוף הדור הבא, אמת את התפלגות האיכות והגודל של ספריות ה- GEX הסופיות של snATAC-seq וביטוי גנים. להעריך את האיכות והכמות של רצפים שזוהו בספריות באמצעות מערכות ניתוח מקטעים. ראה איור 4 לקבלת תוצאות הערכת איכות מייצגות.
    הערה: העקבות הסופיות של ספריות snATAC-seq צריכות להראות את המחזוריות של פיתול נוקלאוזומים, והגדלים צריכים לנוע בין 200 bp למספר Kbp, בעוד שהגדלים בספריית ביטוי הגנים צריכים לנוע בין 300 bp ל- 600 bp.

תוצאות

בהשוואה להכנת מתלים חד-תאיים לגישות חד-תאיות, הכנת מתלים חד-גרעיניים מאתגרת הרבה יותר ודורשת רמה גבוהה יותר של רזולוציה ועיבוד. גורם המפתח לשילוב מוצלח של snRNA-seq ו-snATAC-seq הוא מתלה גרעינים נקי ושלם. יש להתאים את הפרוטוקול לבידוד גרעינים יעיל לכל סוג ומצב רקמה (טרי או קפוא). כאן מתואר פרוטוקול א?...

Discussion

ניתוח ההרכב התאי של הלב המתפתח על ידי מחקרים משולבים של snRNA-seq ו- snATAC-seq מספק הבנה עמוקה יותר של מקור מחלת הלב המולדת26. מספר מעבדות מחקר חקרו את ההשפעות של שימור בהקפאה של רקמת הלב על snRNA-seq27. ביצוע snRNA-seq ו- snATAC-seq באמצעות רקמות מיקרו-חתוכות טריות ממודלים עכבריים של מחלו...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי ERA-CVD-2019 ו- ANR-JCJC-2020 ל- SS. אנו מודים למתקן הגנומיקה והביואינפורמטיקה (GBiM) מהמעבדה לגנטיקה רפואית U 1251/מרסיי ולסוקרים האנונימיים על מתן הערות חשובות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentNo catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo catalog number
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSNo catalog number

References

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195snRNA seq snATAC seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved