A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.
הלב המתפתח הוא מבנה מורכב המכיל תאי אב שונים הנשלטים על ידי מנגנוני בקרה מורכבים. בחינת ביטוי הגנים ומצב הכרומטין של תאים בודדים מאפשרת זיהוי סוג התא ומצבו. גישות ריצוף חד-תאי חשפו מספר מאפיינים חשובים של הטרוגניות תאי אב לבביים. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות בדרך כלל לרקמה טרייה, מה שמגביל מחקרים עם תנאי ניסוי מגוונים, מכיוון שיש לעבד את הרקמה הטרייה בבת אחת באותה ריצה כדי להפחית את השונות הטכנית. לכן, יש צורך בהליכים קלים וגמישים להפקת נתונים משיטות כגון ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNA-seq) ובדיקת גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (snATAC-seq) בתחום זה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד מהיר של גרעינים עבור אומיקה דואלית של גרעינים בודדים (snRNA-seq משולב ו-snATAC-seq). שיטה זו מאפשרת בידוד גרעינים מדגימות קפואות של תאי אב לבביים וניתן לשלב אותה עם פלטפורמות המשתמשות בתאים מיקרופלואידים.
בקרב מומים מולדים, מומי לב מולדים (CHDs) הם הנפוצים ביותר, המתרחשים בכ -1% מלידות החי בכל שנה 1,2. מוטציות גנטיות מזוהות רק במיעוט מהמקרים, מה שמרמז על כך שגורמים אחרים, כגון חריגות בבקרת גנים, מעורבים באטיולוגיה של CHD 2,3. התפתחות הלב היא תהליך מורכב של סוגי תאים מגוונים ומקיימים אינטראקציה, מה שהופך את זיהוי מוטציות סיבתיות לא מקודדות והשפעותיהן על בקרת גנים למאתגר. אורגנוגנזה של הלב מתחילה באבות תאיים שיוצרים תת-סוגים שונים של תאי לב, כולל תאי מיוקרדיאל, פיברובלסט, אפיקרדיאלי ואנדוקרדיאלי 4,5
נוהל בעלי החיים שאומץ במחקר זה אושר על ידי ועדות האתיקה של בעלי החיים באוניברסיטת אקס-מרסיי (C2EA-14) ובוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית הלאומית שמונתה לניסויים בבעלי חיים (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; אישור Apafis N°33927-20211111715507212).
1. הגדרת ההזדווגות המתוזמנת לפני הנתיחה
בהשוואה להכנת מתלים חד-תאיים לגישות חד-תאיות, הכנת מתלים חד-גרעיניים מאתגרת הרבה יותר ודורשת רמה גבוהה יותר של רזולוציה ועיבוד. גורם המפתח לשילוב מוצלח של snRNA-seq ו-snATAC-seq הוא מתלה גרעינים נקי ושלם. יש להתאים את הפרוטוקול לבידוד גרעינים יעיל לכל סוג ומצב רקמה (טרי או קפוא). כאן מתואר פרוטוקול א?.......
ניתוח ההרכב התאי של הלב המתפתח על ידי מחקרים משולבים של snRNA-seq ו- snATAC-seq מספק הבנה עמוקה יותר של מקור מחלת הלב המולדת26. מספר מעבדות מחקר חקרו את ההשפעות של שימור בהקפאה של רקמת הלב על snRNA-seq27. ביצוע snRNA-seq ו- snATAC-seq באמצעות רקמות מיקרו-חתוכות טריות ממודלים עכבריים של מחלו.......
למחברים אין מה לחשוף.
מחקר זה נתמך על ידי ERA-CVD-2019 ו- ANR-JCJC-2020 ל- SS. אנו מודים למתקן הגנומיקה והביואינפורמטיקה (GBiM) מהמעבדה לגנטיקה רפואית U 1251/מרסיי ולסוקרים האנונימיים על מתן הערות חשובות.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved