A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

Abstract

הלב המתפתח הוא מבנה מורכב המכיל תאי אב שונים הנשלטים על ידי מנגנוני בקרה מורכבים. בחינת ביטוי הגנים ומצב הכרומטין של תאים בודדים מאפשרת זיהוי סוג התא ומצבו. גישות ריצוף חד-תאי חשפו מספר מאפיינים חשובים של הטרוגניות תאי אב לבביים. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות בדרך כלל לרקמה טרייה, מה שמגביל מחקרים עם תנאי ניסוי מגוונים, מכיוון שיש לעבד את הרקמה הטרייה בבת אחת באותה ריצה כדי להפחית את השונות הטכנית. לכן, יש צורך בהליכים קלים וגמישים להפקת נתונים משיטות כגון ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNA-seq) ובדיקת גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (snATAC-seq) בתחום זה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד מהיר של גרעינים עבור אומיקה דואלית של גרעינים בודדים (snRNA-seq משולב ו-snATAC-seq). שיטה זו מאפשרת בידוד גרעינים מדגימות קפואות של תאי אב לבביים וניתן לשלב אותה עם פלטפורמות המשתמשות בתאים מיקרופלואידים.

Introduction

בקרב מומים מולדים, מומי לב מולדים (CHDs) הם הנפוצים ביותר, המתרחשים בכ -1% מלידות החי בכל שנה 1,2. מוטציות גנטיות מזוהות רק במיעוט מהמקרים, מה שמרמז על כך שגורמים אחרים, כגון חריגות בבקרת גנים, מעורבים באטיולוגיה של CHD 2,3. התפתחות הלב היא תהליך מורכב של סוגי תאים מגוונים ומקיימים אינטראקציה, מה שהופך את זיהוי מוטציות סיבתיות לא מקודדות והשפעותיהן על בקרת גנים למאתגר. אורגנוגנזה של הלב מתחילה באבות תאיים שיוצרים תת-סוגים שונים של תאי לב, כולל תאי מיוקרדיאל, פיברובלסט, אפיקרדיאלי ואנדוקרדיאלי 4,5

Protocol

נוהל בעלי החיים שאומץ במחקר זה אושר על ידי ועדות האתיקה של בעלי החיים באוניברסיטת אקס-מרסיי (C2EA-14) ובוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית הלאומית שמונתה לניסויים בבעלי חיים (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; אישור Apafis N°33927-20211111715507212).

1. הגדרת ההזדווגות המתוזמנת לפני הנתיחה

  1. כדי ליצור עוברי עכברים, בצעו הזדווגות מתוזמנת בין עכברים בוגרים 9.5 ימים לפני בידוד אזור הלב. בהליך זה נעשה שימוש בעכברי בר מסוג C57BL/6J בגילאי 2-6 חודשים, והזדווגות מתוזמנת בוצעה במהלך הלילה.
  2. למחרת בבוקר, בדוק אם לנקבות העכברים יש פקק בנרתיק. שקול את היום ....

תוצאות

בהשוואה להכנת מתלים חד-תאיים לגישות חד-תאיות, הכנת מתלים חד-גרעיניים מאתגרת הרבה יותר ודורשת רמה גבוהה יותר של רזולוציה ועיבוד. גורם המפתח לשילוב מוצלח של snRNA-seq ו-snATAC-seq הוא מתלה גרעינים נקי ושלם. יש להתאים את הפרוטוקול לבידוד גרעינים יעיל לכל סוג ומצב רקמה (טרי או קפוא). כאן מתואר פרוטוקול א?.......

Discussion

ניתוח ההרכב התאי של הלב המתפתח על ידי מחקרים משולבים של snRNA-seq ו- snATAC-seq מספק הבנה עמוקה יותר של מקור מחלת הלב המולדת26. מספר מעבדות מחקר חקרו את ההשפעות של שימור בהקפאה של רקמת הלב על snRNA-seq27. ביצוע snRNA-seq ו- snATAC-seq באמצעות רקמות מיקרו-חתוכות טריות ממודלים עכבריים של מחלו.......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי ERA-CVD-2019 ו- ANR-JCJC-2020 ל- SS. אנו מודים למתקן הגנומיקה והביואינפורמטיקה (GBiM) מהמעבדה לגנטיקה רפואית U 1251/מרסיי ולסוקרים האנונימיים על מתן הערות חשובות.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentNo catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo catalog number
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSNo catalog number

References

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Re....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195snRNA seq snATAC seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved