从小鼠心脏祖细胞中分离细胞核，用于单细胞分辨率的表观基因组和基因表达谱分析

摘要

在这里，我们提出了一个描述细胞核制备的协议。在将心脏组织进行显微切割和酶解离成单细胞后，冷冻祖细胞，然后分离纯活细胞，用于单核RNA测序和单核测定，用于转座酶可接近染色质和高通量测序分析。

摘要

发育中的心脏是一个复杂的结构，包含由复杂调节机制控制的各种祖细胞。检查单个细胞的基因表达和染色质状态可以识别细胞类型和状态。单细胞测序方法揭示了心脏祖细胞异质性的许多重要特征。然而，这些方法通常仅限于新鲜组织，这限制了具有不同实验条件的研究，因为必须在同一次运行中立即处理新鲜组织以减少技术可变性。因此，该领域需要简单灵活的程序来生成来自单核RNA测序（snRNA-seq）和转座酶可接近染色质的高通量测序（snATAC-seq）等方法的数据。在这里，我们提出了一种快速分离细胞核的协议，用于随后的单核双组学（组合snRNA-seq和snATAC-seq）。该方法允许从心脏祖细胞的冷冻样品中分离细胞核，并且可以与使用微流体室的平台结合使用。

引言

在出生缺陷中，先天性心脏缺陷（CHD）是最常见的，每年约有1%的活产婴儿发生^1，2。仅在少数病例中发现基因突变，这意味着其他原因，例如基因调节异常，与冠心病^2，3的病因有关。心脏发育是多种多样和相互作用的细胞类型的复杂过程，使得鉴定因果非编码突变及其对基因调控的影响具有挑战性。心脏的器官发生始于产生不同亚型心脏细胞的细胞祖细胞，包括心肌细胞、成纤维细胞、心外细胞和心内膜细胞^4，5。单细胞基因组学正在成为研究心脏发育和评估细胞异质性对健康和疾病的影响的关键方法⁶。用于同时测量不同参数的多组学方法的发展和计算管道的扩展促进了正常和^{患病心脏中}细胞类型和亚型的发现6。本文描述了一种可靠的单核分离方案，用于从小鼠胚胎获得的冷冻心脏祖细胞，该方案与下游snRNA-seq和snATAC-seq（以及snRNA-seq和snATAC-seq组合）兼容7，^8，9。

ATAC-seq是一种稳健的方法，可以鉴定调节性开放染色质区域和定位核小体^10，11。该信息用于得出有关转录因子的位置、身份和活性的结论。因此，可以分析染色质因子（包括重塑剂）的活性以及RNA聚合酶的转录活性，因为该方法对于测量染色质结构^1，2的定量变化具有高度敏感性。因此，ATAC-seq提供了一种稳健而公正的方法来揭示控制特定细胞类型中转录调控的机制。ATAC-seq协议也已经过验证，可以测量单细胞中的染色质可及性，揭示细胞群中染色质结构的变异性¹⁰，^12，13。

尽管近年来在单细胞领域取得了显着进展，但主要困难是处理进行这些实验所需的新鲜样品¹⁴。为了规避这一困难，已经进行了各种测试，目的是用冷冻的心脏组织或细胞进行分析，例如snRNA-seq和snATAC-seq15^，16。

几个平台已被用于分析单细胞基因组学数据¹⁷。广泛使用的单细胞基因表达和ATAC分析平台是用于多个微流体液滴封装的平台¹⁷。由于这些平台使用微流体室，碎屑或聚集体会堵塞系统，导致数据不可用。因此，单细胞研究的成功取决于单个细胞/细胞核的准确分离。

这里介绍的方案使用与最近使用snRNA-seq和snATAC-seq的研究类似的方法来了解先天性心脏缺陷¹⁸，¹⁹，20，²¹，^22，23。该过程利用新鲜显微解剖的心脏组织的酶解离，然后冷冻保存小鼠心脏祖细胞。解冻后，活细胞被纯化并处理以进行核分离。在这项工作中，该协议成功地用于从小鼠心脏祖细胞的相同核制剂中获得snRNA-seq和snATAC-seq数据。

研究方案

本研究中采用的动物程序已获得艾克斯-马赛大学动物伦理委员会（C2EA-14）的批准，并根据指定的国家动物实验伦理委员会（国家教育部，高等和研究部;授权阿帕菲斯号33927-2021111715507212）。

1. 在解剖前设置定时交配

1. 为了产生小鼠胚胎，在心脏区域分离前9.5天在成年小鼠之间进行定时交配。在该过程中，使用2-6个月的野生型C57BL / 6J小鼠，并在夜间进行定时交配。
2. 第二天早上，检查雌性小鼠是否有阴道塞。考虑将插头确定为胚胎日（E）0.5的日期考虑。

2. 组织制备和细胞分离

1. 在受孕后第 9.5 天通过 CO 2 对 _2-6 个月大的孕妇 C57BL/6J 实施安乐死，浓度增加，然后颈椎脱位。用70%乙醇清洁腹部下部。
   注意:不建议在颈椎脱位前使用麻醉剂，因为这会使胚胎暴露于环境变化中，从而影响随后的转录组学和表观基因组学研究。
2. 用剪刀打开腹部和腹膜。可视化子宫角，并用镊子切除两个角。
3. 将角放入含有1%FBS的冷完全培养基的培养皿中。虽然不需要特定的体积，但必须注意确保胚胎完全浸入培养基中。每 10 cm 培养皿的大约体积为 10 mL 是合适的。
4. 在设置为5倍放大倍率的体视显微镜下，使用镊子，从每个胚胎中取出子宫内膜组织，胎盘和卵黄囊。
5. 将胚胎放入带有1%FBS的冷完全培养基的培养皿中。如 图1所示的示意图胚胎，在冷完全培养基中解剖胚胎心脏区域。
6. 将从1.5 mL微量离心管中解剖的五个小鼠胚胎的心脏区域汇集在一起。将摆动桶离心机预冷至4°C。
7. 在摆动桶离心机中以300×g 离心1分钟。除去上清液，并通过加入 1 mL 组织培养级 PBS 洗涤组织。
8. 在室温下以300× g 离心1分钟。 除去上清液，重复洗涤步骤，总共洗涤两次。重复洗涤两次，用0.05%胰蛋白酶/ EDTA（1x）代替PBS。
9. 对于组织消化，在37°C下加入50μL0.25%胰蛋白酶/ EDTA10分钟。 5 分钟后，使用宽孔过滤器尖端通过上下手势进行温和的机械解离。
10. 通过向解离细胞中加入 350 μL 完全培养基来灭活胰蛋白酶消化活性。将重悬的细胞通过40μm细胞过滤器。

3. 细胞计数和活力评估

注意:细胞计数和活力是单细胞实验成功的关键参数。snATAC-seq方法对细胞数的微小变化很敏感。细胞太少会导致染色质过度消化，从而导致更多的读取次数和难以接近的染色质区域的映射（噪音）。同样，拥有太多的细胞会产生难以测序的高分子量片段。为了准确测定细胞和细胞核浓度，通过两种不同的方法评估细胞计数和活力。

1. 进行台盼蓝测定以进行细胞计数，如下所述。
   1. 涡旋 0.4% 台盼蓝染色液，在室温下以 2，000 x g 离心 10 秒，然后将 10 μL 转移到微管中。
   2. 使用移液器混合细胞悬液，并将 10 μL 悬浮液添加到已等分的 10 μL 台盼蓝溶液中。用移液管仔细混合10次。
   3. 将 10 μL 染色细胞转移到计数玻片中。将载玻片放入计数器中以自动计算细胞浓度和活力。
2. 进行基于荧光的死亡率评估，如下所述。
   注意:该测定基于使用荧光染料（乙锭同源二聚体-1，EthD-1和钙黄绿素AM）来评估细胞活力。使用了市售试剂盒，并遵循了提供者的说明进行适当的制备和使用。
   1. 通过将 5 μL 提供的 2 mM EthD-1 储备溶液加入 1 mL 无菌组织培养级 D-PBS 中来制备 10 μM EthD-1 溶液，并涡旋 5 秒以确保完全混合。
   2. 将 2.5 μL 提供的 4 mM 钙黄绿素 AM 储备溶液转移到已制备的 EthD-1 溶液中。涡旋5秒以确保完全混合。
   3. 将 10 μL 所得的 10 μM EthD-1 和 10 μM 钙黄绿素 AM 工作溶液加入 10 μL 细胞悬液中。
      注意:钙黄绿素在水溶液中极易水解，因此请在1天内使用该工作溶液。
   4. 将 10 μL 染色细胞转移到计数载玻片上。将载玻片插入自动荧光细胞计数器。使用GFP过滤器计数活细胞，使用RFP过滤器计数死细胞。
      注意:两种计数方法给出了相似的细胞计数和活力，并且估计每个胚胎心脏区域新鲜解离的细胞总数平均约为20，000个细胞（0.06mm³）。

4. 细胞冷冻

1. 在4°C下以500× g 离心细胞悬液5分钟。 小心地除去上清液而不接触管底部，并将沉淀重悬于1mL冷冻培养基中。
2. 将细胞悬液转移到预冷的冷冻管中，并将冷冻管放入预冷的冷冻容器中。
3. 将容器置于-80 ^◦C下4小时至8小时。将冷冻管转移到液氮中，用于下游单核RNA和ATAC测序实验。
   注意:冷冻管应在使用前在干冰上运输。根据我们的经验，细胞可以在液氮中储存至少6个月，而不会损失细胞活力。储存温度应始终保持在-150°C以下，以防止形成冰晶。

5.细胞解冻和去除死细胞

1. 将冷冻管置于37°C水浴中1-2分钟。当冷冻管中残留微小晶体时将其取出。
2. 加入 1 mL 预热 （37 °C） 完全培养基。用移液管混合三次。将悬浮液转移到含有 10 mL 温完全培养基的 15 mL 锥形管中。
3. 将整个细胞悬液通过30μm过滤器。用 1-2 mL 温热的完全培养基冲洗过滤器，并将流出物收集在同一锥形管中。
4. 以300× g 离心5分钟，并除去上清液。用PBS洗涤一次，并将细胞悬液转移到1.5mL微管中。
5. 以300× g 离心5分钟，除去上清液而不破坏细胞沉淀。
6. 向沉淀细胞中加入 100 μL 提供的磁性微珠，并使用宽口径移液器吸头匀浆 5 次。在室温下孵育15分钟。
7. 同时，用 500 μL 1x 结合缓冲液冲洗磁性分离柱（容量:1 x 10⁷ 至 2 x 10⁸ 个细胞）。
8. 孵育完成后，用 500 μL 1x 结合缓冲液稀释含有微珠的细胞悬液。
9. 将细胞悬液（0.6μL）施加到制备的磁性分离柱上。流出部分是负选择的活细胞部分，磁性保留部分是正选择的死细胞。
10. 将活细胞流出物收集在 15 mL 离心管中。用 2 mL 1x 结合缓冲液冲洗含有细胞悬液的 1.5 mL 微管和色谱柱，并将流出物收集在同一 15 mL 管中。
11. 以300 x g 离心5分钟。在不破坏细胞沉淀的情况下除去上清液。
12. 加入 1 mL PBS-BSA 溶液，并使用宽孔移液器吸头移液 5 次轻轻混合。将细胞悬液转移到 1.5 mL 微管中。
13. 以300 x g 离心5分钟。在不破坏细胞沉淀的情况下除去上清液。
14. 加入 1 mL PBS-BSA 重悬沉淀，重复洗涤步骤共洗涤两次。
15. 将细胞重悬于 100 μL PBS-BSA 溶液中。通过移液 10 次轻轻混合。
16. 使用前面描述的方法（步骤3.1和步骤3.2）确定细胞的浓度和活力。要继续下一步，请确保细胞计数为 ≥100，000 个细胞。有关代表性结果，请参见 图2 。
    注意:冷冻保存导致活细胞初始起始物质损失约40%。根据起始细胞数量，磁柱上的磁珠分离可提高细胞活力，但细胞总数将增加两倍至五倍。仅当有足够的起始材料可用时，才建议使用基于色谱柱的磁性试剂盒去除死细胞。

6. 细胞核分离

注意:snATAC和snRNA-seq组合使用干净和完整的细胞核悬浮液进行。建议针对所用细胞类型优化裂解条件（裂解时间和NP40浓度）。最佳裂解时间点和去垢剂浓度是在不破坏核形态的情况下导致最大数量的细胞裂解的时间点和去垢剂浓度。通过使用摆动式斗式离心机而不是固定角度离心机，可以减少细胞/细胞核的损失。为了尽量减少塑料上的细胞核滞留，建议使用低滞留移液器吸头和离心管。这可以增加细胞核的恢复。用5%BSA包覆移液器吸头和离心管是一种更便宜但更耗时的替代方案。

1. 用70%乙醇和RNase去除溶液清洁工作场所和材料。
2. 将摆动桶离心机预冷至4°C。 新鲜制备裂解缓冲液、裂解稀释缓冲液、0.1x裂解缓冲液和洗涤缓冲液（见 表1）。将缓冲液保持在冰上。
3. 在摆动桶离心机中以500× g 离心细胞悬液在4°C下离心5分钟。轻轻除去所有上清液，不要接触管的底部，以避免细胞沉淀移位。
4. 加入 100 μL 冷藏的 0.1x 裂解缓冲液。通过移液 10 次轻轻混合。在冰上孵育5分钟。
5. 加入 1 mL 冷冻洗涤缓冲液，通过移液轻轻混合 5 次。在4°C下以500× g 离心5分钟。 在不破坏细胞核沉淀的情况下除去上清液。
6. 用冷却洗涤缓冲液重复洗涤，总共洗涤三次。准备稀释的细胞核缓冲液。重悬后，将细胞核储备溶液保持在冰上。

7. 分离细胞核的质量和数量评估

注意:根据初始细胞计数并估计细胞裂解期间约50%的细胞核损失，将适当数量的细胞重悬于冷稀释的细胞核缓冲液中。使用冷却稀释的细胞核缓冲液计算重悬体积基于目标细胞核回收率和制造商用户指南推荐的相应细胞核原液浓度。见 《补充议定书1》中这种计算的例子。

1. 根据初始细胞计数并估计细胞裂解期间约50%的细胞核损失，将适当数量的细胞重悬于冷稀释的细胞核缓冲液中。
2. 确定实际的细胞核浓度。将 2 μL 细胞核储备液与 8 μL 稀释的细胞核缓冲液混合，并将混合物添加到预先等分的 10 μL 台盼蓝或 EthD-1/钙黄绿素 AM 工作溶液中。使用自动细胞计数器计数细胞核。少于5%的细胞应该是活的。有关代表性结果，请参见 图3 。
3. 计算细胞核储备液的体积和稀释的细胞核缓冲液的体积，以获得转位反应推荐浓度下5μL的总体积（请参阅制造商的用户指南）。根据用户指南¹⁷立即进行转置反应。
   注意:从转位反应到构建ATAC和GEX文库的所有步骤均根据用于snRNA-seq和snATAC-seq组合的试剂盒的用户指南¹⁷执行。

8. snRNA-seq和snATAC-seq文库的质量分析

1. 在进行二代测序之前，请验证最终snATAC-seq和基因表达GEX文库的质量和大小分布。使用片段分析系统评估文库中鉴定的序列的质量和数量。具有代表性的质量评估结果见 图4 。
   注意:snATAC-seq文库的最终迹线应显示核小体缠绕的周期性，大小范围应为200 bp至几Kbp，而基因表达文库中的大小应为300 bp至600 bp。

结果

与用于单细胞方法的单细胞悬液制备相比，单核悬浮液的制备更具挑战性，并且需要更高的分辨率和处理。成功结合snRNA-seq和snATAC-seq的关键因素是干净且完整的细胞核悬浮液。高效细胞核分离的方案必须适应每种组织类型和条件（新鲜或冷冻）。在这里，描述了一种优化的方案，用于从冷冻小鼠胚胎心脏细胞中分离细胞核。从胚胎心脏区域解剖和心脏细胞解离到细胞核分离的所有步骤总结在

讨论

通过结合snRNA-seq和snATAC-seq研究对发育中心脏的细胞组成的分析，可以更深入地了解先天性心脏病的起源²⁶。一些研究实验室研究了心脏组织冷冻保存对snRNA-seq²⁷的影响。在比较不同的实验条件时，使用来自人类疾病小鼠模型的新鲜微解剖组织进行snRNA-seq和snATAC-seq在逻辑上可能具有挑战性。对于给定的开发阶段，一个困难是必须在同一次运行中处理对照组和实验?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number