从小鼠心脏祖细胞中分离细胞核，用于单细胞分辨率的表观基因组和基因表达谱分析

摘要

在这里，我们提出了一个描述细胞核制备的协议。在将心脏组织进行显微切割和酶解离成单细胞后，冷冻祖细胞，然后分离纯活细胞，用于单核RNA测序和单核测定，用于转座酶可接近染色质和高通量测序分析。

摘要

发育中的心脏是一个复杂的结构，包含由复杂调节机制控制的各种祖细胞。检查单个细胞的基因表达和染色质状态可以识别细胞类型和状态。单细胞测序方法揭示了心脏祖细胞异质性的许多重要特征。然而，这些方法通常仅限于新鲜组织，这限制了具有不同实验条件的研究，因为必须在同一次运行中立即处理新鲜组织以减少技术可变性。因此，该领域需要简单灵活的程序来生成来自单核RNA测序（snRNA-seq）和转座酶可接近染色质的高通量测序（snATAC-seq）等方法的数据。在这里，我们提出了一种快速分离细胞核的协议，用于随后的单核双组学（组合snRNA-seq和snATAC-seq）。该方法允许从心脏祖细胞的冷冻样品中分离细胞核，并且可以与使用微流体室的平台结合使用。

引言

在出生缺陷中，先天性心脏缺陷（CHD）是最常见的，每年约有1%的活产婴儿发生^1，2。仅在少数病例中发现基因突变，这意味着其他原因，例如基因调节异常，与冠心病^2，3的病因有关。心脏发育是多种多样和相互作用的细胞类型的复杂过程，使得鉴定因果非编码突变及其对基因调控的影响具有挑战性。心脏的器官发生始于产生不同亚型心脏细胞的细胞祖细胞，包括心肌细胞、成纤维细胞、心外细胞和心内膜细胞^4，5。单细胞基因组学正在成为研究心脏发育和评估细胞异质性对健康和疾病的影响的关键方法⁶。用于同时测量不同参数的多组学方法的发展和计算管道的扩展促进了正常和^{患病心脏中}细胞类型和亚型的发现6。本文描述了一种可靠的单核分离方案，用于从小鼠胚胎获得的冷冻心脏祖细胞，该方案与下游snRNA-seq和snATAC-seq（以及snRNA-seq和snATAC-seq组合）兼容7，^8，

研究方案

本研究中采用的动物程序已获得艾克斯-马赛大学动物伦理委员会（C2EA-14）的批准，并根据指定的国家动物实验伦理委员会（国家教育部，高等和研究部;授权阿帕菲斯号33927-2021111715507212）。

1. 在解剖前设置定时交配

1. 为了产生小鼠胚胎，在心脏区域分离前9.5天在成年小鼠之间进行定时交配。在该过程中，使用2-6个月的野生型C57BL / 6J小鼠，并在夜间进行定时交配。
2. 第二天早上，检查雌性小鼠是否有阴道塞。考虑将插头确定为胚胎日（E）0.5的日期考虑。

2. 组织制备和细胞分离

1. 在受孕后第 9.5 天通过 CO 2 对 _2-6 个月大的孕妇 C57BL/6J 实施安乐死，浓度增加，然后颈椎脱位。用70%乙醇清洁腹部下部。
   注意：不建议在颈椎脱位前使用麻醉剂，因为这会使胚胎暴露于环境变化中，从而影响随后的转录组学和表观基因组学研究。
2. 用剪刀打开腹部和腹膜。可视化子宫角，并用镊子切除两个角。
3. 将角放入含有1%FBS的冷完全培养基的培养皿中。虽然不需要特定的体积，但必须注意确保胚胎完全浸入培养基中。每 10 cm 培养皿的大约体积为 10 mL 是合适的。
4. 在设置为....

讨论

通过结合snRNA-seq和snATAC-seq研究对发育中心脏的细胞组成的分析，可以更深入地了解先天性心脏病的起源²⁶。一些研究实验室研究了心脏组织冷冻保存对snRNA-seq²⁷的影响。在比较不同的实验条件时，使用来自人类疾病小鼠模型的新鲜微解剖组织进行snRNA-seq和snATAC-seq在逻辑上可能具有挑战性。对于给定的开发阶段，一个困难是必须在同一次运行中处理对照组和实验?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number