Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zusammenfassung

Das sich entwickelnde Herz ist eine komplexe Struktur mit verschiedenen Vorläuferzellen, die von komplexen Regulationsmechanismen gesteuert werden. Die Untersuchung der Genexpression und des Chromatinzustandes einzelner Zellen ermöglicht die Identifizierung des Zelltyps und -zustands. Einzelzell-Sequenzierungsansätze haben eine Reihe wichtiger Merkmale der kardialen Vorläuferzellheterogenität aufgezeigt. Diese Methoden sind jedoch in der Regel auf frisches Gewebe beschränkt, was Studien mit unterschiedlichen Versuchsbedingungen einschränkt, da das frische Gewebe im selben Durchlauf auf einmal verarbeitet werden muss, um die technische Variabilität zu reduzieren. Daher werden in diesem Bereich einfache und flexible Verfahren zur Datengewinnung aus Methoden wie der Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und dem Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (snATAC-seq) benötigt. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur schnellen Isolierung von Zellkernen für nachfolgende Single-Nuclei-Dual-Omics (kombinierte snRNA-seq und snATAC-seq) vor. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Zellkernen aus gefrorenen Proben kardialer Vorläuferzellen und kann mit Plattformen kombiniert werden, die mikrofluidische Kammern verwenden.

Einleitung

Unter den Geburtsfehlern sind angeborene Herzfehler (KHK) am häufigsten und treten jedes Jahr bei etwa 1 % der Lebendgeburten^{auf 1,2}. Genetische Mutationen werden nur in einer Minderheit der Fälle identifiziert, was darauf hindeutet, dass andere Ursachen, wie z. B. Anomalien in der Genregulation, an der Ätiologie der KHK beteiligt sind ^2,3. Die kardiale Entwicklung ist ein komplexer Prozess verschiedener und interagierender Zelltypen, was die Identifizierung kausaler nicht-kodierender Mutationen und ihrer Auswirkungen auf die Genregulation schwierig ma....

Protokoll

Das in dieser Studie angewandte Tierverfahren wurde von den Tierethikkommissionen der Universität Aix-Marseille (C2EA-14) genehmigt und gemäß den Protokollen durchgeführt, die von der ernannten nationalen Ethikkommission für Tierversuche (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorisierung Apafis Nr. 33927-2021111715507212).

1. Einrichten der zeitgesteuerten Paarung vor der Präparation

1. Um Mausembryonen zu erzeugen, führen Sie 9,5 Tage vor der Isolierung der Herzregion eine zeitgesteuerte Paarung zwischen erwachsenen Mäusen durch. Bei diesem Verfahren wurden Wildtyp-C57....

Diskussion

Die Analyse der zellulären Zusammensetzung des sich entwickelnden Herzens durch kombinierte snRNA-seq- und snATAC-seq-Studien liefert ein tieferes Verständnis der Entstehung von angeborenen Herzfehlern²⁶. Mehrere Forschungslabore haben die Auswirkungen der Kryokonservierung von Herzgewebe auf snRNA-seq²⁷ untersucht. Die Durchführung von snRNA-seq und snATAC-seq unter Verwendung von frischem, mikropräpariertem Gewebe aus Mausmodellen menschlicher Krankheiten kann beim Ve.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent		No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)	Sigma	59222C-500ML
BSA 10%	Sigma	A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)	10X Genomics	1000285
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess III FL	Thermofisher		No catalog number
Digitonin (5%)	Thermofisher	BN2006
DMSO	Sigma	D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	22431021
D-PBS	Thermofisher	14190094	Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns	10X Genomics	1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	10788561
HI-FBS	Thermofisher	A3840001	Heat inactivated
High sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Igepal CA-630	Sigma	I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermofisher	L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	M1028-100ML
Milieu McCoy 5A	Thermofisher	16600082
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
NovaSeq 6000 S2	Illumina		No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)	Thermofisher	15070063
PluriStrainer Mini 40µm	PluriSelect	V-PM15-2021-12
Rock inhibitor	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn	10X Genomics	1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin	Thermofisher	101R20
Sterile double-distilled water	Thermofisher	R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)	Sigma	T2194-100ML
Trypan Blue stain (0.4%)	Invitrogen	T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X	Thermofisher	25300054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl	Labcon	1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8	ZEISS		No catalog number