A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.

Abstract

يجب أن تلخص نماذج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الشبكة المعقدة للخلايا المترابطة الموجودة في الجسم الحي. يتكون الجهاز العصبي المركزي بشكل أساسي من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا للجهود المتزايدة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لاستكشاف خصائص الخلايا الفطرية ، والتي تسمح بتطوير علاجات لعدوى الجهاز العصبي المركزي وأمراضه. في حين أن بعض الأسئلة البحثية يمكن معالجتها من خلال أنظمة زراعة الخلايا البشرية ، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المستحثة) ، فإن العمل مع الخلايا البشرية له حدوده الخاصة فيما يتعلق بالتوافر والتكاليف والأخلاق. هنا ، نصف بروتوكولا فريدا لعزل الخلايا وزراعتها من أدمغة الفئران الجنينية. تحاكي ثقافات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة العديد من مجموعات الخلايا والتفاعلات الموجودة في الدماغ في الجسم الحي. بالمقارنة مع الطرق المكافئة الحالية ، يحاكي هذا البروتوكول بشكل أوثق خصائص الدماغ ويحصل أيضا على المزيد من الخلايا ، مما يسمح بفحص المزيد من الحالات التجريبية من فأر حامل واحد. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول سهل نسبيا وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. تم تحسين هذه الثقافات للاستخدام على مستويات مختلفة ، بما في ذلك شاشات عالية الإنتاجية ذات 96 بئرا ، وتحليل مجهري 24 بئرا ، ومزارع 6 آبار لقياس التدفق الخلوي وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR). طريقة الاستزراع هذه هي أداة قوية للتحقيق في العدوى والمناعة في سياق بعض تعقيدات الجهاز العصبي المركزي مع راحة الطرق في المختبر .

Introduction

يعد تحسين فهمنا للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا بالغ الأهمية لتحسين الخيارات العلاجية للعديد من الأمراض الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. يتكون الجهاز العصبي المركزي ، وهو شبكة معقدة من الخلايا المترابطة داخل الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب البصرية ، من الخلايا العصبية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، وخلاياها المناعية الفطرية ، الخلايا الدبقية الصغيرة1. يمكن للنهج في المختبر في كثير من الأحيان أن يقلل بشكل كبير من عدد الفئران المطلوبة لإجراء أبحاث ذات مغزى. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المعقدة للجهاز العصبي المركزي تجعل من المستحيل تلخيص الوضع في الجسم الحي باستخدام خطوط الخلايا. توفر مزارع الخلايا العصبية المختلطة أد....

Protocol

امتثلت جميع التجارب على الحيوانات للقوانين والمبادئ التوجيهية المحلية لاستخدام الحيوانات ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية المحلية في جامعة غلاسكو. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة لعام 1986 ، تحت رعاية ترخيص مشروع وزارة الداخلية في المملكة المتحدة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J المرباة في المنزل. يوصى باستخدام الإناث الشابات (8-12 أسبوعا) بسبب ارتفاع معدل نجاح الحمل ؛ يمكن إعادة استخدام الذكور لجولات متعددة من التكاثر. يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية للطريقة الموصوفة لتوليد ثقافات عصبية ودبقية مختلطة.

النتائج

مجهريه
تعتبر الثقافات المزروعة على أغطية زجاجية مثالية للتحليل عن طريق الفحص المجهري. لتصور تطور الثقافات ، تم تثبيت قسائم الغطاء في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نقاط زمنية متعددة من DIV0 (بمجرد إرفاق الخلايا) حتى DIV28. تم تلطيخ الثقافات للتصوير المناعي كما هو موضح سابقا5 ب?.......

Discussion

الجهاز العصبي المركزي عبارة عن شبكة معقدة تمتد من الدماغ وصولا إلى الحبل الشوكي وتتكون من العديد من أنواع الخلايا ، والخلايا العصبية في الغالب ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقيةالصغيرة 1. نظرا لأن كل خلية لها دور مهم في الحفاظ على التوازن وتوليد است.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر أعضاء مختبرات إدغار ولينينجتون ، ولا سيما البروفيسور كريس لينينجتون ، والدكتورة ديانا أرسيني ، والدكتورة كاتيا موكليش ، على نصائحهم وتعليقاتهم المفيدة ومساعدتهم في تغذية الثقافات أثناء إنشاء هذه الثقافات. نتوجه بشكر خاص إلى الدكتور Muecklisch لتوفير نقاط البداية لخطوط أنابيب Cell Profiler. تم دعم هذا العمل من قبل جمعية التصلب المتعدد (المنحة 122) ومؤسسة يوري ولورنا تشيرناجوفسكي إلى MP. تمويل جامعة غلاسكو ل JC و MP ؛ و Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ومجلس البحوث الطبية (MRV0109721) إلى GJG.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x TrypsinSigmaT4549-100MLTo digest tissue
140 mm TC DishFisher11339283Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL FalconSarstedt62554502To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needleHenke Sass Wolf4710012040For trituration of sample
21 G needleBD304432For trituration of sample
23 G needleHenke Sass Wolf4710006030For trituration of sample
35 mm TC DishCorning430165Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringeFisher15869152For trituration of sample
6 well plateCorning3516To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL BijouxFisherDIS080010RTo put brains intp
96 well plateCorning3596To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PEMiltenyi130-123-284For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forcepsDumont0108-5/45-POFor dissection
BiotinSigmaB4501For DM+/-
Boric AcidSigmaB6768-500GFor boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69Biolegend101825For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11Biolegend103139For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70Biolegend101243For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction VSigmaA3059-10GFor SD Inhibitor
CNPAbcamAB6319Mature oligodendrocytes
CoverslipVWR631-0149To plate out cells for microscopy
Dissection ScissorsSigmaS3146-1EAFor dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-GlutamineGibco21969-035For DM+/-, and for plating media
DNase IThermofisher18047019For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase ISigmaD4263For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780Thermofisher65-0865-14Live / Dead stain
Fine forcepsDumont0102-SS135-POFor dissection
GFAPInvitrogen13-0300Astrocytes
HBSS w Ca MgSigmaH9269-500MLFor plating media
HBSS w/o Ca MgSigmaH9394-500MLFor brains to be added to
Horse SerumGibco26050-070For plating media
HydrocortisoneSigmaH0396For DM+/-
Iba1Alpha-Laboratories019-1971Microglia
InsulinSigmaI1882For DM+
Leibovitz L-15GIbco11415-049For SD Inhibitor
MBPBio-RadMCA409SMyelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA KitBioTechneDY478-05ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplementSigmaN6530-5MLFor DM+/-
NestinMerckMAB353Neuronal stem/progenitor cells
NeuNThermofisherPA578499Neuronal cell body
NG2SigmaAB5320Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APCMiltenyi130-119-155For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/StrepSigmaP0781-100MLFor DM+/-, and for plating media
Poly-L-LysinehydrobromideSigmaP1274For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31BioLegend801601Axons
Sodium TetraborateSigma221732-100GFor boric acid buffer
TrizolThermofisher15596026For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybeanSigmaT9003-100MGFor SD Inhibitor

References

  1. Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved