A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.
يجب أن تلخص نماذج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الشبكة المعقدة للخلايا المترابطة الموجودة في الجسم الحي. يتكون الجهاز العصبي المركزي بشكل أساسي من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا للجهود المتزايدة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لاستكشاف خصائص الخلايا الفطرية ، والتي تسمح بتطوير علاجات لعدوى الجهاز العصبي المركزي وأمراضه. في حين أن بعض الأسئلة البحثية يمكن معالجتها من خلال أنظمة زراعة الخلايا البشرية ، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المستحثة) ، فإن العمل مع الخلايا البشرية له حدوده الخاصة فيما يتعلق بالتوافر والتكاليف والأخلاق. هنا ، نصف بروتوكولا فريدا لعزل الخلايا وزراعتها من أدمغة الفئران الجنينية. تحاكي ثقافات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة العديد من مجموعات الخلايا والتفاعلات الموجودة في الدماغ في الجسم الحي. بالمقارنة مع الطرق المكافئة الحالية ، يحاكي هذا البروتوكول بشكل أوثق خصائص الدماغ ويحصل أيضا على المزيد من الخلايا ، مما يسمح بفحص المزيد من الحالات التجريبية من فأر حامل واحد. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول سهل نسبيا وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. تم تحسين هذه الثقافات للاستخدام على مستويات مختلفة ، بما في ذلك شاشات عالية الإنتاجية ذات 96 بئرا ، وتحليل مجهري 24 بئرا ، ومزارع 6 آبار لقياس التدفق الخلوي وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR). طريقة الاستزراع هذه هي أداة قوية للتحقيق في العدوى والمناعة في سياق بعض تعقيدات الجهاز العصبي المركزي مع راحة الطرق في المختبر .
يعد تحسين فهمنا للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا بالغ الأهمية لتحسين الخيارات العلاجية للعديد من الأمراض الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. يتكون الجهاز العصبي المركزي ، وهو شبكة معقدة من الخلايا المترابطة داخل الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب البصرية ، من الخلايا العصبية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، وخلاياها المناعية الفطرية ، الخلايا الدبقية الصغيرة1. يمكن للنهج في المختبر في كثير من الأحيان أن يقلل بشكل كبير من عدد الفئران المطلوبة لإجراء أبحاث ذات مغزى. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المعقدة للجهاز العصبي المركزي تجعل من المستحيل تلخيص الوضع في الجسم الحي باستخدام خطوط الخلايا. توفر مزارع الخلايا العصبية المختلطة أد....
امتثلت جميع التجارب على الحيوانات للقوانين والمبادئ التوجيهية المحلية لاستخدام الحيوانات ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية المحلية في جامعة غلاسكو. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة لعام 1986 ، تحت رعاية ترخيص مشروع وزارة الداخلية في المملكة المتحدة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J المرباة في المنزل. يوصى باستخدام الإناث الشابات (8-12 أسبوعا) بسبب ارتفاع معدل نجاح الحمل ؛ يمكن إعادة استخدام الذكور لجولات متعددة من التكاثر. يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية للطريقة الموصوفة لتوليد ثقافات عصبية ودبقية مختلطة.
مجهريه
تعتبر الثقافات المزروعة على أغطية زجاجية مثالية للتحليل عن طريق الفحص المجهري. لتصور تطور الثقافات ، تم تثبيت قسائم الغطاء في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نقاط زمنية متعددة من DIV0 (بمجرد إرفاق الخلايا) حتى DIV28. تم تلطيخ الثقافات للتصوير المناعي كما هو موضح سابقا5 ب?.......
الجهاز العصبي المركزي عبارة عن شبكة معقدة تمتد من الدماغ وصولا إلى الحبل الشوكي وتتكون من العديد من أنواع الخلايا ، والخلايا العصبية في الغالب ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقيةالصغيرة 1. نظرا لأن كل خلية لها دور مهم في الحفاظ على التوازن وتوليد است.......
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
نود أن نشكر أعضاء مختبرات إدغار ولينينجتون ، ولا سيما البروفيسور كريس لينينجتون ، والدكتورة ديانا أرسيني ، والدكتورة كاتيا موكليش ، على نصائحهم وتعليقاتهم المفيدة ومساعدتهم في تغذية الثقافات أثناء إنشاء هذه الثقافات. نتوجه بشكر خاص إلى الدكتور Muecklisch لتوفير نقاط البداية لخطوط أنابيب Cell Profiler. تم دعم هذا العمل من قبل جمعية التصلب المتعدد (المنحة 122) ومؤسسة يوري ولورنا تشيرناجوفسكي إلى MP. تمويل جامعة غلاسكو ل JC و MP ؛ و Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ومجلس البحوث الطبية (MRV0109721) إلى GJG.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved