إنشاء مزارع مختلطة للخلايا العصبية والدبقية من أدمغة الفئران الجنينية لدراسة العدوى والمناعة الفطرية

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.

Abstract

يجب أن تلخص نماذج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الشبكة المعقدة للخلايا المترابطة الموجودة في الجسم الحي. يتكون الجهاز العصبي المركزي بشكل أساسي من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا للجهود المتزايدة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لاستكشاف خصائص الخلايا الفطرية ، والتي تسمح بتطوير علاجات لعدوى الجهاز العصبي المركزي وأمراضه. في حين أن بعض الأسئلة البحثية يمكن معالجتها من خلال أنظمة زراعة الخلايا البشرية ، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المستحثة) ، فإن العمل مع الخلايا البشرية له حدوده الخاصة فيما يتعلق بالتوافر والتكاليف والأخلاق. هنا ، نصف بروتوكولا فريدا لعزل الخلايا وزراعتها من أدمغة الفئران الجنينية. تحاكي ثقافات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة العديد من مجموعات الخلايا والتفاعلات الموجودة في الدماغ في الجسم الحي. بالمقارنة مع الطرق المكافئة الحالية ، يحاكي هذا البروتوكول بشكل أوثق خصائص الدماغ ويحصل أيضا على المزيد من الخلايا ، مما يسمح بفحص المزيد من الحالات التجريبية من فأر حامل واحد. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول سهل نسبيا وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. تم تحسين هذه الثقافات للاستخدام على مستويات مختلفة ، بما في ذلك شاشات عالية الإنتاجية ذات 96 بئرا ، وتحليل مجهري 24 بئرا ، ومزارع 6 آبار لقياس التدفق الخلوي وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR). طريقة الاستزراع هذه هي أداة قوية للتحقيق في العدوى والمناعة في سياق بعض تعقيدات الجهاز العصبي المركزي مع راحة الطرق في المختبر .

Introduction

يعد تحسين فهمنا للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا بالغ الأهمية لتحسين الخيارات العلاجية للعديد من الأمراض الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. يتكون الجهاز العصبي المركزي ، وهو شبكة معقدة من الخلايا المترابطة داخل الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب البصرية ، من الخلايا العصبية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، وخلاياها المناعية الفطرية ، الخلايا الدبقية الصغيرة¹. يمكن للنهج في المختبر في كثير من الأحيان أن يقلل بشكل كبير من عدد الفئران المطلوبة لإجراء أبحاث ذات مغزى. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المعقدة للجهاز العصبي المركزي تجعل من المستحيل تلخيص الوضع في الجسم الحي باستخدام خطوط الخلايا. توفر مزارع الخلايا العصبية المختلطة أد....

Protocol

امتثلت جميع التجارب على الحيوانات للقوانين والمبادئ التوجيهية المحلية لاستخدام الحيوانات ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية المحلية في جامعة غلاسكو. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة لعام 1986 ، تحت رعاية ترخيص مشروع وزارة الداخلية في المملكة المتحدة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J المرباة في المنزل. يوصى باستخدام الإناث الشابات (8-12 أسبوعا) بسبب ارتفاع معدل نجاح الحمل ؛ يمكن إعادة استخدام الذكور لجولات متعددة من التكاثر. يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية للطريقة الموصوفة لتوليد ثقافات عصبية ودبقية مختلطة.

النتائج

مجهريه
تعتبر الثقافات المزروعة على أغطية زجاجية مثالية للتحليل عن طريق الفحص المجهري. لتصور تطور الثقافات ، تم تثبيت قسائم الغطاء في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نقاط زمنية متعددة من DIV0 (بمجرد إرفاق الخلايا) حتى DIV28. تم تلطيخ الثقافات للتصوير المناعي كما هو موضح سابقا⁵ ب?.......

Discussion

الجهاز العصبي المركزي عبارة عن شبكة معقدة تمتد من الدماغ وصولا إلى الحبل الشوكي وتتكون من العديد من أنواع الخلايا ، والخلايا العصبية في الغالب ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقية^{الصغيرة 1}. نظرا لأن كل خلية لها دور مهم في الحفاظ على التوازن وتوليد است.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor