إنشاء مزارع مختلطة للخلايا العصبية والدبقية من أدمغة الفئران الجنينية لدراسة العدوى والمناعة الفطرية

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.

Abstract

يجب أن تلخص نماذج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الشبكة المعقدة للخلايا المترابطة الموجودة في الجسم الحي. يتكون الجهاز العصبي المركزي بشكل أساسي من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا للجهود المتزايدة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لاستكشاف خصائص الخلايا الفطرية ، والتي تسمح بتطوير علاجات لعدوى الجهاز العصبي المركزي وأمراضه. في حين أن بعض الأسئلة البحثية يمكن معالجتها من خلال أنظمة زراعة الخلايا البشرية ، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المستحثة) ، فإن العمل مع الخلايا البشرية له حدوده الخاصة فيما يتعلق بالتوافر والتكاليف والأخلاق. هنا ، نصف بروتوكولا فريدا لعزل الخلايا وزراعتها من أدمغة الفئران الجنينية. تحاكي ثقافات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة العديد من مجموعات الخلايا والتفاعلات الموجودة في الدماغ في الجسم الحي. بالمقارنة مع الطرق المكافئة الحالية ، يحاكي هذا البروتوكول بشكل أوثق خصائص الدماغ ويحصل أيضا على المزيد من الخلايا ، مما يسمح بفحص المزيد من الحالات التجريبية من فأر حامل واحد. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول سهل نسبيا وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. تم تحسين هذه الثقافات للاستخدام على مستويات مختلفة ، بما في ذلك شاشات عالية الإنتاجية ذات 96 بئرا ، وتحليل مجهري 24 بئرا ، ومزارع 6 آبار لقياس التدفق الخلوي وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR). طريقة الاستزراع هذه هي أداة قوية للتحقيق في العدوى والمناعة في سياق بعض تعقيدات الجهاز العصبي المركزي مع راحة الطرق في المختبر .

Introduction

يعد تحسين فهمنا للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا بالغ الأهمية لتحسين الخيارات العلاجية للعديد من الأمراض الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. يتكون الجهاز العصبي المركزي ، وهو شبكة معقدة من الخلايا المترابطة داخل الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب البصرية ، من الخلايا العصبية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، وخلاياها المناعية الفطرية ، الخلايا الدبقية الصغيرة¹. يمكن للنهج في المختبر في كثير من الأحيان أن يقلل بشكل كبير من عدد الفئران المطلوبة لإجراء أبحاث ذات مغزى. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المعقدة للجهاز العصبي المركزي تجعل من المستحيل تلخيص الوضع في الجسم الحي باستخدام خطوط الخلايا. توفر مزارع الخلايا العصبية المختلطة أداة بحث قيمة للغاية للتحقيق في أسئلة علم الأعصاب (المناعي) في نموذج ذي صلة ، بما يتماشى مع مبادئ الاستبدال والتخفيض والصقل (3Rs) ^2,3.

وصف طومسون وآخرون طريقة زراعة الخلايا باستخدام خلايا الحبل الشوكي قبل الولادة التي تتمايز إلى جميع أنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي الرئيسية المذكورة أعلاه⁴. يحتوي هذا النظام أيضا على تكوين المشبك العصبي ، ومحاور الميالين ، وعقد رانفييه. القيد الرئيسي لطريقة الزراعة هذه هو أنه ، كونه الحبل الشوكي ، فإنه لا يصمم الدماغ بشكل مفيد ، وتنتج الخلية من الحبل الشوكي الجنيني في اليوم 13 (E13) تضيق. وبالتالي ، فإن هذا يحد من عدد الحالات التجريبية التي يمكن التحقيق فيها. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نظام جديد لزراعة الخلايا يلخص خصائص الدماغ مع زيادة إنتاجية الخلايا لتقليل متطلبات الحيوانات.

باستخدام Thomson et al. كنقطة انطلاق ، قمنا بتطوير نموذج زراعة الخلايا المستمد فقط من أدمغة الفئران قبل الولادة. تحتوي هذه الثقافات على نفس مجموعات الخلايا والترابط وخيارات العلاج مثل مزارع الحبل الشوكي ، باستثناء وجود ميالين أقل بالمقارنة. ومع ذلك ، فإن وجود نموذج الجهاز العصبي المركزي في المختبر مع إنتاجية خلايا أعلى بثلاثة أضعاف تقريبا هو أكثر كفاءة ، ويتطلب عددا أقل من الفئران ووقتا أقل في معالجة الأجنة. لقد قمنا بتحسين نظام الاستزراع الفريد هذا للعديد من التطبيقات والمقاييس النهائية ، بما في ذلك استخدام أغطية زجاجية للتحليل المجهري وأحجام مختلفة من ألواح الآبار البلاستيكية ، بما في ذلك ألواح 96 بئرا للأبحاث عالية الإنتاجية.

Protocol

امتثلت جميع التجارب على الحيوانات للقوانين والمبادئ التوجيهية المحلية لاستخدام الحيوانات ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية المحلية في جامعة غلاسكو. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة لعام 1986 ، تحت رعاية ترخيص مشروع وزارة الداخلية في المملكة المتحدة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J المرباة في المنزل. يوصى باستخدام الإناث الشابات (8-12 أسبوعا) بسبب ارتفاع معدل نجاح الحمل ؛ يمكن إعادة استخدام الذكور لجولات متعددة من التكاثر. يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية للطريقة الموصوفة لتوليد ثقافات عصبية ودبقية مختلطة.

1. إعداد مستهلكات زراعة الأنسجة

1. قم بإعداد الأطباق و / أو الأطباق التي تحتوي على أغطية مجهرية داخل خزانة أمان من الفئة 2. تعقيم جميع الكواشف أو الأوتوكلاف لضمان العقم خلال فترة الاستزراع.
2. أضف الحجم المناسب من BA-PLL (13.2 ميكروغرام / مل بولي-L-ليسين هيدروبروميد [PLL] في محلول حمض البوريك [BA] [50 mM حمض البوريك ، 12.5 mM رباعي الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8.5] ؛ انظر جدول المواد) إلى كل بئر (1000 ميكرولتر / بئر في صفيحة 6 آبار ، 100 ميكرولتر / بئر في لوحة 96 بئر ؛ يتم تلخيص الأحجام في الجدول 1). بالنسبة لأغطية الفحص المجهري ، أضف 20 مل من BA-PLL إلى طبق زراعة الأنسجة بقطر 9 سم يحتوي على 200 غطاء معقم ، وقم بالدوران لتوزيعها بالتساوي.
3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
4. قم بإزالة محلول BA-PLL من كل بئر أو طبق يحتوي على أغطية مجهرية ، واغسله بإضافة 20 مل من الماء المعقم ، وتحريك أغطية الغطاء ، ثم إزالة الماء. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. بالنسبة للطبق الذي يحتوي على أغطية ، اترك الماء المعقم في طبق زراعة الأنسجة في الغسيل النهائي لإزالة أغطية الغطاء بسهولة.
5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل باستخدام ماصة معقمة واتركها تجف لمدة 2 ساعة على الأقل طوال الليل.
6. تخزين لوحات المغلفة في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر.
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدام حمض البوريك المحضر بمحلول بولي ل ليسين (BA-PLL) حتى ثلاث مرات ، مع إضافة PLL جديد في كل مرة. قم بتخزين BA-PLL في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يتم التعامل مع الأطباق باستخدام BA-PLL ، حيث يسمح PLL للخلايا بالالتصاق والنمو. بدون هذا العلاج ، سوف ترفع الخلايا بعد حوالي 1 أسبوع من الثقافة ولم تعد قادرة على التمايز.

2. تشريح الأدمغة الجنينية E17

1. شارك في إيواء واحد أو عدة فئران أنثى مع فأر ذكر. تحقق من الإناث يوميا بحثا عن سدادة مخاطية ، مما يشير إلى حدوث التزاوج.
   ملاحظة: يجب فصل أي إناث فئران "مسدودة" عن الذكر لضمان تاريخ البدء الصحيح للحمل. يمكن وزن الفئران لتأكيد الحمل أو مراقبتها بصريا.
2. إعدام الفأر الحامل في E17 باستخدام الطرق المناسبة وفقا لإرشادات وقوانين رعاية الحيوان المحلية ، على سبيل المثال ، عن طريق رفع تركيز ثاني أكسيد الكربون (CO₂) ، أو جرعة زائدة من مخدر مميت ، أو خلع الرقبة.
   ملاحظة: يجب ألا تؤدي الطريقة المختارة إلى تعطيل الأجنة. في هذه الدراسة ، تم استخدام التعرض لتركيز متزايد من غاز ثاني أكسيد الكربون متبوعا بتأكيد الوفاة عن طريق قطع الشريان الفخذي لإعدام السدود الحامل.
3. ضع الفأر الحامل الذي تم إعدامه على ظهره على لوح التشريح ؛ في حين أن تثبيته ليس مطلوبا ، إلا أنه قد يسهل الأمر على الباحثين عديمي الخبرة. قرصة خط الوسط من البطن باستخدام ملقط. باستخدام مقص حاد ، قم بفتح البطن من خلال الجلد والبريتوني فوق خط الوسط من الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري ، مع الحرص على عدم ثقب الرحم.
   1. يحتوي رحم الفأر على قرنين ، يحتوي كل منهما عادة على واحد إلى خمسة أجنة. قم بإزالة الرحم الذي يحتوي على الأجنة من الأم وضعه على الفور على الجليد.
4. قطع كيس الصفار على جانب المشيمة ، مع الحرص على عدم إتلاف الأجنة ، وإزالة الأجنة من كيس صفار البيض.
5. قطع رأس الأجنة على الفور. أضف الرؤوس مقطوعة الرأس إلى طبق مع محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) بدون الكالسيوم (Ca 2+) والمغنيسيوم (Mg²⁺) (HBSS-/-) على الثلج.
   ملاحظة: إذا كان التنميط الجيني مطلوبا ، يمكن للمرء إزالة الذيل في هذه المرحلة للتحليل الجيني. عندما يتوقع وجود أنماط وراثية متعددة ، يجب الاحتفاظ برؤوس كل جنين بشكل منفصل للزراعة.
6. باستخدام ملقط بزاوية ، ضع الرأس على جانبه المواجه لليسار.
7. بيرس العين مع حافة واحدة من ملقط ، عقد بقوة الذقن مع الآخر.
8. بدءا من القفا ، قم بتمزيق جلد فروة الرأس برفق على طول خط الوسط باتجاه طرف الخطم.
9. عند الدخول من خلال الحبل الشوكي ، الذي يمكن ملاحظته كشكل بيضاوي أبيض ، استخدم الملقط المائل لفتح الجمجمة على طول خط الوسط ، مما يؤدي إلى كشف الدماغ.
10. قشر الجمجمة برفق بعيدا على الجانب المواجه لأعلى ، وكشف الدماغ.
11. ارفع الدماغ من الجمجمة ، وتخلص من الجمجمة بمجرد إزالة الدماغ بالكامل.
12. باستخدام الملقط ، قم بإزالة السحايا ، والتي يمكن ملاحظتها كغشاء رقيق مع أوعية دموية كثيفة.
13. ضع الأدمغة في بيجو (انظر جدول المواد) يحتوي على 2 مل من HBSS-/- على الثلج.
14. كرر الخطوات من 2.6 إلى 2.13 مع الأدمغة المتبقية ، مع إضافة ما يصل إلى أربعة أدمغة لكل بيجو.
15. أضف 250 ميكرولتر من 10x تربسين إلى بيجو وسحن الأدمغة عن طريق هز بيجو. احتضان لمدة 15 دقيقة على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة فصاعدا في غطاء زراعة الأنسجة المعقمة.
16. ذوبان 2 مل من مثبطات تربسين فول الصويا (Leibovitz L-15، 0.52 ملغ/مل مثبط التربسين من فول الصويا، 40 ميكروغرام/مل DNase I، 3 ملغ/مل من ألبومين مصل البقر [BSA] الجزء الخامس؛ انظر جدول المواد) من -20 درجة مئوية بوضعه عند 37 درجة مئوية.
17. أضف 2 مل من مثبطات SD إلى كل بيجو يحتوي على أدمغة (لكل بيجو يحتوي على ما يصل إلى أربعة أدمغة) ، وهز بيجو مرة أخرى لتفريقه بالتساوي.
    ملاحظة: يقلل مثبط SD من نشاط التربسين لمنع الهضم غير الضروري للعينات والحفاظ على صلاحية الخلية.
18. بدون طرد مركزي ، قم بإزالة 2 مل من المادة الطافية من كل بيجو وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، مع الحرص على عدم نقل كتل الخلايا.
19. سحن الخلايا المتبقية في بيجو بإبرة 19 جم متصلة بحقنة سعة 5 مل عن طريق استنشاق المعلق مرتين. سيؤدي ذلك إلى إنشاء خليط سميك يشبه المخاط.
    1. كرر مرتين أخريين باستخدام إبرة 21 جرام. إذا كانت هناك كتل متبقية ، فقم بالسحن مرة أخرى بإبرة 21 جرام.
20. انقل الخلايا من bijou إلى نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل (من الخطوة 2.18) باستخدام إبرة 23 جرام.
21. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
22. قم بإزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 15 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات السائبة في الجزء السفلي التي تحتوي على الخلايا المطلوبة.
23. أجهزة الطرد المركزي الطافية مرة أخرى في 200 × غرام في RT لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية ، ولكن إذا كان المرء يحتاج إلى العديد من الخلايا أو لديه عدد قليل من الأجنة ، فيمكن للمرء تنفيذ هذه الخطوة لاستعادة أكبر عدد ممكن من الخلايا من المادة الطافية.
24. باستخدام 10 مل من وسائط الطلاء (PM) (49٪ وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين [قلم / سترب] ، 25٪ مصل حصان ، 25٪ HBSS مع Ca 2+ و Mg²⁺ [HBSS +/+] ؛ انظر جدول المواد) ، ادمج الكريتين وأعد تعليقهما معا لإنشاء تعليق خلية كاملة.
25. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وإما مقياس الدم أو عداد الخلايا الرقمية ، وقم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام PM إلى تركيز 1.8 × 10⁶ خلايا / مل.

3. تصفيح الخلايا

1. أضف الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى التنسيق المطلوب كما هو مفصل في الجدول 1: 1000 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر في شكل 96 بئرا ، أو 100 ميكرولتر لكل غطاء جانبي.
2. احتضان لمدة 2-4 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ -7٪ CO₂. تحقق من أن الخلايا قد التصقت باستخدام مجهر مقلوب.
3. قم بإزالة الوسائط وقم بتعبئتها بوسائط تمايز جديدة (DM +: DM- بما في ذلك 10 ميكروغرام / مل من الأنسولين. DM-: DMEM ، 1٪ قلم / بكتيريا ، 50 نانومتر هيدروكورتيزون ، 10 نانوغرام / مل بيوتين ، 2.5 مل 100x N1 مكمل إعلامي ؛ انظر جدول المواد). المجلدات مفصلة في الجدول 1. اضغط لأسفل على أي أغطية عائمة باستخدام طرف ماصة معقم.

4. الحفاظ على الثقافات

ملاحظة: تتطلب هذه الثقافات التغذية ثلاث مرات أسبوعيا لدعم النمو الأمثل والتمايز. ستصل الثقافات إلى الصحة والنضج الأمثل للتجارب على DIV (أيام في المختبر) 21. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 28 يوما ، وبعد ذلك تتدهور الثقافات بسرعة.

1. ثلاث مرات في الأسبوع حتى DIV12 ، استبدل جزءا من المادة الطافية ب DM + طازج عن طريق إزالة 500 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئرا ، أو 500 ميكرولتر لكل طبق يحتوي على ثلاث أغطية ، وإضافة 600 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، 60 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئر ، أو 600 ميكرولتر لكل طبق غطاء منزلق (الجدول 1).
2. ثلاث مرات في الأسبوع من DIV13 فصاعدا ، استبدل جزءا من المادة الطافية ب DM- طازج عن طريق إزالة 500 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئرا ، أو 500 ميكرولتر لكل طبق يحتوي على ثلاث أغطية ، وإضافة 600 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، 60 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئر ، أو 600 ميكرولتر لكل طبق غطاء منزلق (الجدول 1).

النتائج

مجهريه
تعتبر الثقافات المزروعة على أغطية زجاجية مثالية للتحليل عن طريق الفحص المجهري. لتصور تطور الثقافات ، تم تثبيت قسائم الغطاء في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نقاط زمنية متعددة من DIV0 (بمجرد إرفاق الخلايا) حتى DIV28. تم تلطيخ الثقافات للتصوير المناعي كما هو موضح سابقا⁵ ب?...

Discussion

الجهاز العصبي المركزي عبارة عن شبكة معقدة تمتد من الدماغ وصولا إلى الحبل الشوكي وتتكون من العديد من أنواع الخلايا ، والخلايا العصبية في الغالب ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقية^{الصغيرة 1}. نظرا لأن كل خلية لها دور مهم في الحفاظ على التوازن وتوليد است...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor