감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

요약

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

초록

중추신경계(CNS)의 모델은 생체 내에서 발견되는 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크를 요약해야 합니다.중추신경계는 주로 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성됩니다. 동물 사용을 대체하고 줄이기 위한 노력이 증가함에 따라 선천성 세포 특성을 탐색하기 위해 다양한 시험관 내 세포 배양 시스템이 개발되어 CNS 감염 및 병리에 대한 치료제를 개발할 수 있습니다. 특정 연구 질문은 (유도된) 만능 줄기 세포와 같은 인간 기반 세포 배양 시스템으로 해결할 수 있지만 인간 세포로 작업하는 것은 가용성, 비용 및 윤리와 관련하여 고유한 한계가 있습니다. 여기에서는 배아 마우스 뇌에서 세포를 분리하고 배양하기 위한 고유한 프로토콜을 설명합니다. 그 결과 혼합 신경 세포 배양은 생체 내 뇌에서 발견되는 여러 세포 집단과 상호 작용을 모방합니다. 현재의 동등한 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은 뇌의 특성을 더 밀접하게 모방하고 더 많은 세포를 확보하므로 임신한 마우스 한 마리에서 더 많은 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 비교적 쉽고 재현성이 높습니다. 이러한 배양은 96웰 기반 고처리량 스크리닝, 24웰 현미경 분석, 유세포 분석 및 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위한 6웰 배양을 포함하여 다양한 규모로 사용하도록 최적화되었습니다. 이 배양 방법은 시험관 내 방법의 편리함과 함께 CNS의 일부 복잡성의 맥락에서 감염 및 면역을 조사하는 강력한 도구입니다.

서문

중추신경계(CNS)에 대한 이해를 높이는 것은 많은 신경염증 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료 옵션을 개선하는 데 중요합니다. 뇌, 척수, 시신경 내에서 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크인 CNS는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 이들의 선천성 면역 세포인 미세아교세포로 구성됩니다¹. 체외 접근법은 종종 의미있는 연구를 수행하는 데 필요한 마우스의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 그러나 CNS의 복잡한 특성으로 인해 세포주를 사용하여 생체 내 상황을 요약하는 것은 불가능합니다. 혼합 신경 세포 배양은 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙 ^2,3에 따라 관련 모델에서 신경(면역학) 문제를 조사하는 데 매우 유용한 연구 도구를 제공합니다.

Thomson et al.은 앞서 언급한 모든 주요 CNS 세포 유형으로 분화하는 태아기 척수 세포를 이용한 세포 배양 방법을 설명했다⁴. 이 시스템은 또한 시냅스 형성, 수초 축삭 및 Ranvier의 노드를 가지고 있습니다. 이 배양 방법의....

프로토콜

모든 동물 실험은 동물 사용에 대한 현지 법률 및 지침을 준수했으며 글래스고 대학의 지역 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 영국 내무부 프로젝트 라이센스의 후원하에 1986년 영국 동물 과학 절차법에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되었습니다. 이 연구에서는 사내에서 사육된 성인 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 젊은 여성 (8-12 주)의 사용은 임신 성공률이 높기 때문에 권장됩니다. 수컷은 여러 차례의 번식에 재사용 할 수 있습니다. 그림 1 은 혼합된 뉴런 및 신경교 배양을 생성하는 설명된 방법의 개략도를 나타냅니다.

1. 조직 배양 소모품의 제조

1. Class 2 안전 캐비닛 내부에 현미경 커버슬립이 들어 있는 접시 및/또는 접시를 준비합니다. 배양 기간 동안 무균 상태를 보장하기 위해 모든 시약 또는 오토클레이브를 멸균하십시오.
2. 적절한 부피의 BA-PLL(붕산 완충액[BA][50mM 붕산, 12.5mM 사붕산나트륨, pH 8.5] 중 13.2μg/mL 폴리-L-라이신하이드로브로마이드[PLL])을 각 웰(6웰 플레이트에서 1,000μL/웰, 96웰 플레이트에서 100μL/웰, 부피는 ....

토론

중추신경계는 뇌에서 척수까지 이어지는 복잡한 네트워크로, 주로 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 미세아교세포 등 다양한 세포 유형으로 구성되어 있다¹. 각 세포는 항상성을 유지하고 CNS ^9,10,11의 문제에 대한 적절한 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 모든 세포 유형을 포함하는 배양 시스템은 뇌?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor