Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Özet

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Özet

Merkezi sinir sistemi (CNS) modelleri, in vivo olarak bulunan birbirine bağlı hücrelerin karmaşık ağını özetlemelidir.CNS öncelikle nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia'dan oluşur. Hayvan kullanımını değiştirme ve azaltma çabalarının artması nedeniyle, CNS enfeksiyonları ve patolojileri için terapötiklerin geliştirilmesine izin veren doğuştan gelen hücre özelliklerini keşfetmek için çeşitli in vitro hücre kültürü sistemleri geliştirilmiştir. Bazı araştırma soruları, (indüklenmiş) pluripotent kök hücreler gibi insan temelli hücre kültürü sistemleri tarafından ele alınabilirken, insan hücreleriyle çalışmanın kullanılabilirlik, maliyetler ve etik açısından kendi sınırlamaları vardır. Burada, embriyonik fare beyinlerinden hücreleri izole etmek ve kültürlemek için benzersiz bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan karışık nöral hücre kültürleri, beyinde in vivo olarak bulunan çeşitli hücre popülasyonlarını ve etkileşimlerini taklit eder. Mevcut eşdeğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol beynin özelliklerini daha yakından taklit eder ve ayrıca daha fazla hücre toplar, böylece hamile bir fareden daha fazla deneysel koşulun araştırılmasına izin verir. Ayrıca, protokol nispeten kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu kültürler, 96 kuyucuklu yüksek verimli ekranlar, 24 kuyucuklu mikroskopi analizi ve akış sitometrisi ve ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için 6 kuyucuklu kültürler dahil olmak üzere çeşitli ölçeklerde kullanım için optimize edilmiştir. Bu kültür yöntemi, in vitro yöntemlerin rahatlığı ile CNS'nin bazı karmaşıklıkları bağlamında enfeksiyon ve bağışıklığı araştırmak için güçlü bir araçtır.

Giriş

Merkezi sinir sistemi (CNS) hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, birçok nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalık için terapötik seçenekleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Beyin, omurilik ve optik sinirler içindeki birbirine bağlı hücrelerin karmaşık bir ağı olan CNS, nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve bunların doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia^1'i içerir. İn vitro bir yaklaşım genellikle anlamlı araştırmalar yapmak için gereken fare sayısını önemli ölçüde azaltabilir; Bununla birlikte, CNS'nin karmaşık doğası, hücre hatlarını kullanarak in vivo durumu özetlemeyi imkansız kılar. Karışık nöral hücre kültürleri, Replasman, İndirgeme ve İyileştirme (3R) ilkeleri ^2,3 doğrultusunda, ilgili bir modelde nöro(immüno)loji sorularını araştırmak için son derece değerli bir araştırma aracı sağlar.

Thomson ve ark., yukarıda belirtilen tüm ana CNS^{hücre tiplerine} farklılaşan prenatal omurilik hücrelerini kullanarak bir hücre kültürü yöntemi tanımlamıştır. Bu sistem ayrıca sinaps oluşumuna, miyelinli aksonlara ve Ranvier düğümlerine sahiptir. Bu kültürleme yönteminin temel sınırlaması, omurilik olarak, beyni yararlı bir şekilde modellememesi ve embriyonik gün 13 (E13) omuriliklerinden elde edilen hücre veriminin daralmasıdır. Bu nedenle, bu, araştırılabilecek deneysel koşulların sayısını sınırlar. Bu nedenle, bu çalışma, hayvanlara olan gereksinimleri azaltmak için artan hücre verimi ile beynin özelliklerini özetleyen yeni bir hücre kültürü sistemi geliştirmeyi amaçlamıştır.

Thomson ve ark.'yı başlangıç noktası olarak kullanarak, tamamen doğum öncesi fare beyinlerinden türetilmiş bir hücre kültürü modeli geliştirdik. Bu kültürler, omurilik kültürleriyle aynı hücre popülasyonlarına, birbirine bağlanabilirliğe ve tedavi seçeneklerine sahiptir, ancak karşılaştırıldığında daha az miyelinasyon vardır. Bununla birlikte, yaklaşık üç kat daha yüksek hücre verimine sahip bir CNS in vitro modeline sahip olmak daha verimlidir ve daha az fare ve daha az zaman işleme embriyosu gerektirir. Bu benzersiz kültür sistemini, mikroskopi analizi için cam kapak fişleri ve yüksek verimli araştırmalar için 96 delikli plakalar da dahil olmak üzere çeşitli boyutlarda plastik kuyu plakaları kullanmak da dahil olmak üzere birden fazla aşağı akış uygulaması ve terazisi için optimize ettik.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, hayvan kullanımı için yerel yasalara ve yönergelere uygundur ve Glasgow Üniversitesi'ndeki yerel Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, İngiltere İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı'nın himayesinde, İngiltere Hayvanları Bilimsel Prosedürler Yasası 1986 uyarınca belirli patojensiz koşullarda barındırılmıştır. Bu çalışma için, şirket içi yetiştirilmiş yetişkin C57BL / 6J fareler kullanılmıştır. Gebeliğin daha yüksek başarı oranı nedeniyle genç kadınların (8-12 hafta) kullanılması önerilir; Erkekler birden fazla üreme turu için tekrar kullanılabilir. Şekil 1 , karışık nöronal ve glial kültürler oluşturmak için tarif edilen yöntemin şematik bir özetini temsil etmektedir.

1. Doku kültürü sarf malzemelerinin hazırlanması

1. Sınıf 2 Güvenlik kabini içinde mikroskopi kapakları içeren tabakları ve/veya bulaşıkları hazırlayın. Kültür döneminde steriliteyi sağlamak için tüm reaktifleri veya otoklavı sterilize edin.
2. Her bir kuyucuğa uygun miktarda BA-PLL (borik asit tamponunda [BA] [50 mM borik asit, 12,5 mM sodyum tetraborat, pH 8,5]; bkz. Malzeme Tablosunda 1.000 μL/kuyu, 96 delikli bir plakada 100 μL/kuyu; hacimler Tablo 1'de özetlenmiştir) uygun hacimde BA-PLL (13,2 μg/mL poli-L-lizinhidrobromür [PLL]) ekleyin. Mikroskopi kapakları için, 200 steril kapak fişi içeren 9 cm çapında bir doku kültürü kabına 20 mL BA-PLL ekleyin ve eşit olarak dağıtmak için girdap yapın.
3. 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. BA-PLL çözeltisini mikroskopi kapakları içeren her bir kuyucuktan veya tabaktan çıkarın ve 20 mL steril su ekleyerek, kapak kapaklarını döndürerek ve ardından suyu çıkararak yıkayın. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Kapak fişleri içeren bir tabakta, kapak kapaklarını kolayca çıkarmak için son yıkamada doku kültürü kabında steril su bırakın.
5. Steril bir pipetle mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve gece boyunca en az 2 saat kurumaya bırakın.
6. Kaplanan plakaları 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
   NOT: Poli-l-lizin (BA-PLL) çözeltisi ile hazırlanan borik asit, her seferinde yeni PLL eklenerek üç defaya kadar tekrar kullanılabilir. BA-PLL'yi 4 °C'de saklayın. Bulaşıklar BA-PLL ile muamele edilir, çünkü PLL hücrelerin yapışmasına ve büyümesine izin verir. Bu tedavi olmadan, hücreler yaklaşık 1 haftalık kültürden sonra kalkacak ve artık farklılaşamayacaktır.

2. E17 embriyonal beyinlerinin diseksiyonu

1. Bir veya daha fazla dişi fareyi bir erkek fare ile birlikte barındırın. Dişileri günlük olarak bir mukus tıkacı için kontrol edin, bu da çiftleşmenin gerçekleştiğini gösterir.
   NOT: Herhangi bir "tıkanmış" dişi farenin, gebeliğin doğru başlangıç tarihini sağlamak için erkekten ayrılması gerekir. Fareler hamileliği doğrulamak için tartılabilir veya görsel olarak izlenebilir.
2. Hamile fareyi E17'de, örneğin karbondioksit (CO₂) konsantrasyonunu yükselterek, ölümcül anestezik doz aşımı veya boynun çıkığı gibi yerel hayvan refahı rehberliğine ve yasalarına uygun uygun yöntemler kullanarak itlaf edin.
   NOT: Seçilen yöntem embriyoları bozmamalıdır. Bu çalışma için, artan bir karbondioksit gazı konsantrasyonuna maruz kalmanın ardından femoral arterin kesilmesiyle ölümün doğrulanması gebe barajları yok etmek için kullanılmıştır.
3. Culled, hamile fareyi sırtına bir diseksiyon tahtasına yerleştirin; sabitlemek gerekli olmasa da, deneyimsiz araştırmacılar için daha kolay olabilir. Forseps kullanarak karın orta hattını sıkıştırın. Keskin makas kullanarak, uterusu delmemeye dikkat ederek, karnı deriden ve orta hat üzerindeki peritondan cinsel organdan göğüs kafesine kadar kesin.
   1. Fare rahminin, her biri tipik olarak bir ila beş embriyo içeren iki boynuzu vardır. Embriyoları içeren uterusu anneden çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
4. Plasentaların yanındaki yumurta sarısı torbasını kesin, embriyolara zarar vermemeye dikkat edin ve embriyoları yumurta sarısı çuvalından çıkarın.
5. Hemen embriyoların kafasını kesin. Kafası kesilmiş kafaları, buz üzerinde kalsiyum (Ca 2⁺) ve magnezyum (Mg²⁺) (HBSS-/-) içermeyen Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile bir kaba ekleyin.
   NOT: Genotipleme gerekiyorsa, genetik analiz için bu aşamada kuyruk çıkarılabilir. Birden fazla genotip beklendiğinde, her embriyonun başları kültürleme için ayrı tutulmalıdır.
6. Açılı forseps kullanarak, kafayı sola bakan tarafına yerleştirin.
7. Forsepsin bir kenarıyla gözü delin, çeneyi diğeriyle sıkıca tutun.
8. Enseden başlayarak, kafa derisinin derisini orta çizgi boyunca burun ucuna doğru yavaşça yırtın.
9. Beyaz bir oval olarak fark edilen omurilikten girerek, kafatasını orta hat boyunca açmak ve beyni açığa çıkarmak için açılı forsepsleri kullanın.
10. Kafatasını yukarı bakan taraftan yavaşça soyun ve beyni açığa çıkarın.
11. Beyni kafatasından çıkarın, beyin tamamen çıkarıldıktan sonra kafatasını atın.
12. Forsepsleri kullanarak, yoğun kan damarlarına sahip ince bir zar olarak fark edilen meninksleri çıkarın.
13. Beyinleri buz üzerinde 2 mL HBSS-/- içeren bir bijou'ya ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
14. 2.6 ila 2.13 arasındaki adımları kalan beyinlerle tekrarlayın ve bijou başına dört adede kadar beyin ekleyin.
15. Bijou'ya 250 μL 10x tripsin ekleyin ve bijou'yu sallayarak beyinleri üçe katlayın. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımlar steril doku kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir.
16. 2 mL soya fasulyesi tripsin (SD) inhibitörü (Leibovitz L-15, soya fasulyesinden 0.52 mg/mL tripsin inhibitörü, 40 μg/mL DNaz I, 3 mg/mL sığır serum albümini [BSA] fraksiyonu V; bakınız Malzeme Tablosu) -20 °C'den 37 °C'ye yerleştirerek çözün.
17. Her bijou içeren beyine 2 mL SD inhibitörü ekleyin (dört adede kadar beyin içeren bijou başına), bijou'yu eşit şekilde dağıtmak için tekrar sallayın.
    NOT: SD inhibitörü, numunelerin gereksiz yere sindirilmesini önlemek ve hücre canlılığını korumak için tripsin aktivitesini azaltır.
18. Santrifüjleme olmadan, her bir bijou'dan 2 mL süpernatantı çıkarın ve hücre kümelerini aktarmamaya dikkat ederek 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
19. Bijou'da kalan hücreleri, süspansiyonu iki kez aspire ederek 5 mL'lik bir şırıngaya tutturulmuş 19 G'lik bir iğne ile tritüre edin. Bu, kalın bir mukus benzeri karışım yaratacaktır.
    1. 21 G'lık bir iğne kullanarak iki kez daha tekrarlayın. Kalan kümeler varsa, 21 G iğne ile bir kez daha tritüre edin.
20. 23 G'lik bir iğne kullanarak hücreleri bijou'dan aynı 15 mL santrifüj tüpüne (adım 2.18'den itibaren) aktarın.
21. Oda sıcaklığında (RT) 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
22. Tüm süpernatantı 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak çıkarın ve gerekli hücreleri içeren alttaki gevşek peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek başka bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
23. Süpernatantı RT'de 200 x g'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüj edin.
    NOT: Bu adım gerekli değildir, ancak çok sayıda hücreye ihtiyaç duyulursa veya az sayıda embriyo varsa, süpernatandan mümkün olduğunca çok hücre kurtarmak için bu adımı gerçekleştirebilirsiniz.
24. 10 mL kaplama ortamı (PM) kullanarak (%49 Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı [DMEM], %1 penisilin/streptomisin [Pen/Strep], %25 at serumu, %25 HBSS ile Ca 2+ ve Mg² + [HBSS⁺ /+]; bakınız Malzeme Tablosu), bütün bir hücre süspansiyonu oluşturmak için iki peleti birleştirin ve yeniden askıya alın.
25. Tripan mavisi ve bir hemositometre veya dijital hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu PM ile 1.8 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin.

3. Hücrelerin kaplanması

1. Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi gerekli formata ekleyin: 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 1.000 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya kapak kayması başına 100 μL.
2. 37 ° C'de 2-4 saat boyunca% 5 -% 7 CO₂ ile inkübe edin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışıp yapışmadığını kontrol edin.
3. Ortamı çıkarın ve yeni farklılaştırma medyası (DM+: DM- 10 μg/mL insülin dahil. DM-: DMEM, %1 Kalem/Strep, 50 nM hidrokortizon, 10 ng/mL biyotin, 2,5 mL 100x N1 ortam takviyesi; Bkz. Malzeme Tablosu). Birimler Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Steril bir pipet ucu kullanarak yüzen kapak fişlerini bastırın.

4. Kültürlerin sürdürülmesi

NOT: Bu kültürler, optimal büyümeyi ve farklılaşmayı desteklemek için haftada üç kez beslenmeyi gerektirir. Kültürler, DIV ( in vitro günler) 21 üzerindeki deneyler için optimum sağlık ve olgunluğa ulaşacaktır. Hücreler 28 güne kadar kültürde tutulabilir, bundan sonra kültürler hızla dejenere olur.

1. DIV12'ye kadar haftada üç kez, 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 500 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya üç kapak fişi içeren çanak başına 500 μL çıkararak ve 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 600 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 60 μL ekleyerek süpernatantın bir kısmını taze DM+ ile değiştirin, veya kapak kayması çanağı başına 600 μL (Tablo 1).
2. DIV13'ten itibaren haftada üç kez, 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 500 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 50 μL veya üç kapak fişi içeren çanak başına 500 μL çıkararak ve 6 kuyucuklu formatta kuyu başına 600 μL, 96 kuyucuklu formatta kuyu başına 60 μL ekleyerek süpernatantın bir kısmını taze DM- ile değiştirin, veya kapak kayması çanağı başına 600 μL (Tablo 1).

Sonuçlar

Mikroskopi
Cam örtüler üzerinde yetiştirilen kültürler mikroskopi ile analiz etmek için idealdir. Kültürlerin gelişimini görselleştirmek için, kapak kaymaları DIV0'dan (hücreler bağlandıktan sonra) DIV28'e kadar birçok zaman noktasında% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi. Kültürler, daha önce tarif edildiği gibi immünofloresan görüntüleme için boyandı⁵ üç farklı boyama kombinasyonu kullanılarak: gelişimsel belirteçler olarak NG2 (olgun...

Tartışmalar

CNS, beyinden omuriliğe kadar uzanan karmaşık bir ağdır ve ağırlıklı olarak nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve mikroglia¹ olmak üzere birçok hücre tipinden oluşur. Her hücrenin homeostazı korumada ve CNS 9,10,11'deki zorluklara uygun yanıtlar üretmede önemli bir rolü olduğundan, tüm bu hücre tiplerini içeren bir kültür sistemi^, beynin bir uyarana nasıl tepki verebilece?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor