ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

Summary

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

Abstract

מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) חייבים לשחזר את הרשת המורכבת של תאים מחוברים הנמצאים in vivo. מערכת העצבים המרכזית מורכבת בעיקר מנוירונים, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ותאי מיקרוגליה. בשל המאמצים הגוברים להחליף ולהפחית את השימוש בבעלי חיים, פותחו מגוון מערכות תרבית תאים במבחנה כדי לחקור תכונות תאים מולדות, המאפשרות פיתוח טיפולים לזיהומים ופתולוגיות במערכת העצבים המרכזית. בעוד ששאלות מחקר מסוימות יכולות להיות מטופלות על ידי מערכות תרבית תאים מבוססות אדם, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים (מושרים), לעבודה עם תאים אנושיים יש מגבלות משלה לגבי זמינות, עלויות ואתיקה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ייחודי לבידוד וטיפוח תאים ממוחות עכברים עובריים. תרביות התאים העצביות המעורבות המתקבלות מחקות מספר אוכלוסיות תאים ואינטראקציות הנמצאות במוח in vivo. בהשוואה לשיטות המקבילות כיום, פרוטוקול זה מחקה באופן הדוק יותר את מאפייני המוח וגם מגייס יותר תאים, ובכך מאפשר לחקור יותר תנאי ניסוי מעכבר הרה אחת. יתר על כן, הפרוטוקול קל יחסית וניתן לשחזור מאוד. תרביות אלה עברו אופטימיזציה לשימוש בקני מידה שונים, כולל מסכי תפוקה גבוהה מבוססי 96 בארות, ניתוח מיקרוסקופיה של 24 בארות ותרביות 6 בארות לניתוח ציטומטריית זרימה ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-qPCR). שיטת תרבית זו היא כלי רב עוצמה לחקור זיהום וחסינות בהקשר של חלק מהמורכבות של מערכת העצבים המרכזית עם הנוחות של שיטות חוץ גופיות .

Introduction

שיפור ההבנה שלנו של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי לשיפור האפשרויות הטיפוליות עבור מחלות נוירו-דלקתיות וניווניות רבות. מערכת העצבים המרכזית, רשת מורכבת של תאים המחוברים זה לזה במוח, בעמוד השדרה ובעצבי הראייה, כוללת נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ותאי מערכת החיסון המולדת שלהם, מיקרוגליה¹. גישה חוץ-גופית יכולה לעתים קרובות להפחית באופן דרסטי את מספר העכברים הדרושים לביצוע מחקר משמעותי; עם זאת, האופי המורכב של מערכת העצבים המרכזית אינו מאפשר לשחזר את המצב in vivo באמצעות קווי תאים. תרביות תאים עצביים מעורבים מספקות כלי מחקר בעל ערך רב לחקר שאלות נוירו(אימונו)לוגיות במודל רלוונטי, בהתאם לעקרונות החלפה, הפחתה ועידון (3Rs) ^2,3.

תומסון ועמיתיו תיארו שיטת תרבית תאים המשתמשת בתאי חוט שדרה טרום לידתי המתמיינים לכל סוגי תאי CNS העיקריים שהוזכרו לעיל⁴. למערכת זו יש גם היווצרות סינפסות, אקסונים מיאלינטים וצמתים של Ranvier. המגבלה העיקרית של שיטת תרבית זו היא שבהיותו חוט השדרה, הוא אינו מודל שימושי של המוח, והתא מניב מיום עוברי 13 (E13) חוטי השדרה מתכווצים. לפיכך, זה מגביל את מספר תנאי הניסוי שניתן לחקור. לכן, מחקר זה נועד לפתח מערכת תרבית תאים חדשה המשחזרת את מאפייני המוח עם תפוקת תאים מוגברת כדי להפחית את הדרישות לבעלי חיים.

באמצעות תומסון ועמיתיו כנקודת מוצא, פיתחנו מודל של תרבית תאים שנגזר אך ורק ממוחות של עכברים לפני הלידה. לתרביות אלה יש את אותן אוכלוסיות תאים, קישוריות ואפשרויות טיפול כמו תרביות חוט השדרה, אלא שיש פחות מיאלינציה בהשוואה. עם זאת, מודל CNS in vitro עם תפוקת תאים גבוהה פי שלושה בקירוב הוא יעיל יותר, דורש פחות עכברים ופחות זמן עיבוד עוברים. ביצענו אופטימיזציה של מערכת תרביות ייחודית זו עבור יישומים ומאזניים מרובים במורד הזרם, כולל שימוש בכיסויי זכוכית לניתוח מיקרוסקופיה ובגדלים שונים של לוחות בארות פלסטיק, כולל לוחות 96 בארות למחקר בתפוקה גבוהה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים עמדו בחוקים ובהנחיות המקומיים לשימוש בבעלי חיים, ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המקומית באוניברסיטת גלזגו. בעלי החיים שוכנו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים בהתאם לחוק הנהלים המדעיים של בעלי החיים בבריטניה 1986, בחסות רישיון פרויקט משרד הפנים הבריטי. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J בוגרים שגודלו בבית. מומלץ להשתמש בנשים צעירות (8-12 שבועות) בשל שיעור ההצלחה הגבוה יותר של ההריון; ניתן לעשות שימוש חוזר בזכרים למספר סבבי רבייה. איור 1 מייצג סקירה סכמטית של השיטה המתוארת ליצירת תרביות נוירונים וגליה מעורבות.

1. הכנת חומרים מתכלים של תרבות הרקמה

1. הכינו את הצלחות ו/או הכלים המכילים כיסויי מיקרוסקופיה בתוך ארון בטיחות דרגה 2. לעקר את כל הריאגנטים או autoclave כדי להבטיח סטריליות במהלך תקופת התרבות.
2. הוסף את הנפח המתאים של BA-PLL (13.2 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-ליזין-הידרוברומיד [PLL] במאגר חומצה בורית [BA] [50 מ"מ חומצה בורית, 12.5 מ"מ נתרן טטרבורט, pH 8.5]; ראה טבלת חומרים) לכל באר (1,000 מיקרוליטר/באר בצלחת בת 6 בארות, 100 מיקרוליטר/באר בצלחת של 96 בארות; הכרכים מסוכמים בטבלה 1). לכיסויי מיקרוסקופיה יש להוסיף 20 מ"ל BA-PLL לצלחת תרבית רקמה בקוטר 9 ס"מ המכילה 200 כיסויים סטריליים, ולהסתחרר לפיזור אחיד.
3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 שעות.
4. הסר את תמיסת BA-PLL מכל באר או צלחת המכילה כיסויי מיקרוסקופיה, ושטוף על ידי הוספת 20 מ"ל מים סטריליים, ערבול החלקות הכיסוי, ולאחר מכן הסרת המים. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים. עבור צלחת המכילה כיסויים, השאירו מים סטריליים בצלחת תרבית הרקמה בשטיפה הסופית כדי להסיר בקלות את הכיסויים.
5. מוציאים כמה שיותר נוזלים עם פיפטה סטרילית ומניחים להתייבש לפחות שעתיים עד לילה.
6. אחסנו את הצלחות המצופות בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
   הערה: חומצה בורית מוכנה עם תמיסת פולי-ל-ליזין (BA-PLL) ניתנת לשימוש חוזר עד שלוש פעמים, הוספת PLL חדש בכל פעם. אחסן את BA-PLL ב 4 ° C. מנות מטופלות עם BA-PLL, כמו PLL מאפשר לתאים להישאר למטה ולגדול. ללא טיפול זה, התאים יתרוממו לאחר כשבוע של תרבית ולא יוכלו עוד להתמיין.

2. דיסקציה של המוח העוברי E17

1. בית משותף של עכבר נקבה אחת או יותר עם עכבר זכר. בדוק את הנקבות מדי יום עבור פקק ריר, המציין הזדווגות התרחשה.
   הערה: כל נקבת עכברה "מחוברת" צריכה להיות מופרדת מהזכר כדי להבטיח את תאריך ההתחלה הנכון של ההריון. ניתן לשקול עכברים כדי לאשר הריון או לפקח חזותית.
2. יש לכלוא את העכבר ההרה ב-E17 בשיטות מתאימות בהתאם להנחיות ולחוקים המקומיים לרווחת בעלי חיים, לדוגמה, על ידי העלאת ריכוז הפחמן הדו-חמצני (_CO2), מנת יתר קטלנית של חומר הרדמה או נקע של הצוואר.
   הערה: אסור שהשיטה שנבחרה תשבש את העוברים. במחקר זה, חשיפה לריכוז עולה של גז פחמן דו חמצני ואחריו אישור מוות על ידי קטיעת עורק הירך שימשה כדי לרפות סכרים בהריון.
3. הניחו את העכבר ההרה על גבו על לוח נתיחה; אמנם אין צורך להצמיד אותו, אך הוא עשוי להקל על חוקרים חסרי ניסיון. צבטו את קו האמצע של הבטן באמצעות מלקחיים. באמצעות מספריים חדים, לחתוך לפתוח את הבטן דרך העור ואת הצפק מעל קו האמצע מן איבר המין לכלוב הצלעות, נזהר לא לנקב את הרחם.
   1. לרחם העכבר יש שתי קרניים, שכל אחת מהן מכילה בדרך כלל עובר אחד עד חמישה עוברים. הסר את הרחם המכיל את העוברים מן האם ומיד להניח אותו על קרח.
4. חותכים דרך שק החלמון בצד השליה, נזהרים שלא לפגוע בעוברים, ומוציאים את העוברים משק החלמון שלהם.
5. ערפו מיד את ראשיהם של העוברים. הוסיפו את הראשים הערופים לצלחת עם תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) ללא סידן (Ca 2+) ומגנזיום (Mg²⁺) (HBSS-/-) על קרח.
   הערה: אם נדרש גנוטיפ, ניתן להסיר את הזנב בשלב זה לצורך ניתוח גנטי. כאשר צפויים גנוטיפים מרובים, יש לשמור את הראשים של כל עובר בנפרד לצורך תרבית.
6. בעזרת מלקחיים זוויתיים מקמו את הראש על צדו כשהוא פונה שמאלה.
7. חורר את העין עם קצה אחד של המלקחיים, מחזיק בחוזקה את הסנטר עם השני.
8. מתחילים מהעורף, קורעים בעדינות את עור הקרקפת לאורך קו האמצע לכיוון קצה החוטם.
9. נכנסים דרך חוט השדרה, בולט כמו אליפסה לבנה, להשתמש מלקחיים זוויתיים כדי לפצח את הגולגולת לאורך קו האמצע, לחשוף את המוח.
10. מקלפים בעדינות את הגולגולת בצד הפונה כלפי מעלה, וחושפים את המוח.
11. הרימו את המוח אל מחוץ לגולגולת, והשליכו את הגולגולת לאחר שהמוח הוסר לחלוטין.
12. באמצעות מלקחיים, להסיר את קרומי המוח, אשר בולטים כמו קרום דק עם כלי דם צפופים.
13. הכניסו את המוח לביז'ו (ראו טבלת חומרים) המכיל 2 מ"ל HBSS-/- על קרח.
14. חזרו על שלבים 2.6 עד 2.13 עם המוחות הנותרים, והוסיפו עד ארבעה מוחות לכל ביז'ו.
15. הוסף 250 μL של טריפסין 10x bijou ו triturate המוח על ידי ניעור bijou. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C.
    הערה: כל השלבים מנקודה זו ואילך צריכים להתבצע בתרבית רקמה סטרילית.
16. הפשרה 2 מ"ל של מעכב טריפסין סויה (SD) (Leibovitz L-15, 0.52 מ"ג/מ"ל מעכב טריפסין מפולי סויה, 40 מיקרוגרם/מ"ל DNase I, 3 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר [BSA] חלק V; ראו טבלת חומרים) מ-20°C - על ידי הצבתו בטמפרטורה של 37°C.
17. הוסיפו 2 מ"ל של מעכב SD לכל ביז'ו המכיל מוח (לכל ביז'ו המכיל עד ארבעה מוחות), ונענעו שוב את הביז'ו כדי לפזר אותו באופן שווה.
    הערה: מעכב SD מפחית את פעילות הטריפסין כדי למנוע עיכול מיותר של הדגימות ולשמר את יכולת הקיום של התא.
18. ללא צנטריפוגה, מוציאים 2 מ"ל של הסופרנאטנט מכל ביז'ו ומעבירים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, נזהרים שלא להעביר גושי תאים.
19. Triturate את התאים הנותרים bijou עם מחט 19 G מחובר מזרק 5 מ"ל על ידי שאיפה את המתלה פעמיים. זה ייצור תערובת סמיכה דמוית ריר.
    1. חזור על הפעולה פעמיים נוספות באמצעות מחט 21 גרם. אם נותרו גושים, יש לשלש שוב עם מחט 21 גרם.
20. העבר את התאים מהביז'ו לאותה צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל (משלב 2.18) באמצעות מחט 23 גרם.
21. צנטריפוגה במהירות 200 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
22. מוציאים את כל הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל ומעבירים אותו לצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל, נזהרים שלא להפריע לגלולה הרופפת בתחתית המכילה את התאים הדרושים.
23. צנטריפוגה את הסופרנאטנט שוב ב 200 x גרם ב RT במשך 5 דקות.
    הערה: שלב זה אינו חיוני, אך אם אדם זקוק לתאים רבים או שיש לו מעט עוברים, ניתן לבצע שלב זה כדי לשחזר תאים רבים ככל האפשר מהסופרנטנט.
24. שימוש ב-10 מ"ל של חומרי ציפוי (PM) (49% מדיום עיט מעובד של Dulbecco [DMEM], 1% פניצילין/סטרפטומיצין [Pen/Strep], 25% סרום סוס, 25% HBSS עם Ca 2+ ו-Mg² + [HBSS⁺ /+]; ראו טבלת חומרים), שלבו והשעו מחדש את שתי הכדוריות יחד ליצירת תרחיף תא שלם.
25. ספרו את התאים באמצעות טריפאן כחול והמוציטומטר או מונה תאים דיגיטלי, ודללו את תרחיף התא עם PM לריכוז של 1.8 x 10⁶ תאים / מ"ל.

3. ציפוי התאים

1. הוסף את הנפח הנדרש של מתלה התא לתבנית הנדרשת כמפורט בטבלה 1: 1,000 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 50 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 100 μL לכל כיסוי.
2. יש לדגור במשך 2-4 שעות בטמפרטורה של 37°C עם 5%-7% CO₂. בדקו שהתאים נצמדו באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
3. הסר את המדיה וטען באמצעי בידול חדש (DM+: DM- כולל אינסולין של 10 מיקרוגרם/מ"ל. DM-: DMEM, 1% עט/Strep, הידרוקורטיזון 50 ננומטר, ביוטין 10 נ"ג/מ"ל, תוסף מדיה 2.5 מ"ל 100x N1; ראו טבלת חומרים). הכרכים מפורטים בטבלה 1. לחצו כלפי מטה על כל הכיסויים הצפים בעזרת קצה פיפטה סטרילי.

4. שמירה על התרבויות

הערה: תרבויות אלה דורשות האכלה שלוש פעמים בשבוע כדי לתמוך בגדילה ובהתמיינות אופטימליות. התרביות יגיעו לבריאות ובשלות אופטימליות לניסויים ב-DIV (ימים במבחנה) 21. תאים יכולים להישמר בתרבית עד 28 ימים, ולאחר מכן התרביות מתנוונות במהירות.

1. שלוש פעמים בשבוע עד DIV12, להחליף חלק של supernatant עם DM+ טרי על ידי הסרת 500 μL לכל באר בפורמט 6 באר, 50 μL לכל באר בפורמט 96 באר, או 500 μL לכל צלחת המכילה שלושה כיסויים, והוספת 600 μL לכל באר בפורמט 6 באר, 60 μL לכל באר בפורמט 96 באר, או 600 מיקרוליטר לכל צלחת כיסוי (טבלה 1).
2. שלוש פעמים בשבוע מ-DIV13 ואילך, החליפו חלק מהסופרנאטנט ב-DM טרי על ידי הסרת 500 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 50 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 500 μL לצלחת המכילה שלוש כיסויים, והוספת 600 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 60 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 600 מיקרוליטר לכל צלחת כיסוי (טבלה 1).

תוצאות

מיקרוסקופ
תרביות הגדלות על כיסויי זכוכית אידיאליות לניתוח במיקרוסקופיה. כדי להמחיש את התפתחות התרביות, הכיסויים נקבעו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במספר נקודות זמן מ-DIV0 (לאחר חיבור התאים) ועד DIV28. התרביות הוכתמו לצורך דימות אימונופלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן⁵ באמצעות שלוש...

Discussion

מערכת העצבים המרכזית היא רשת מורכבת המשתרעת מהמוח ועד חוט השדרה ומורכבת מסוגי תאים רבים, בעיקר נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ומיקרוגליה¹. מכיוון שלכל תא יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס וביצירת תגובות מתאימות לאתגרים במערכת העצבים המרכזית 9,10,11...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor