Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée

Résumé

Ce protocole présente une façon unique de générer des cultures cellulaires du système nerveux central à partir de cerveaux de souris embryonnaires du jour 17 pour la recherche en neuro(immuno)logie. Ce modèle peut être analysé à l’aide de diverses techniques expérimentales, notamment la RT-qPCR, la microscopie, l’ELISA et la cytométrie en flux.

Résumé

Les modèles du système nerveux central (SNC) doivent récapituler le réseau complexe de cellules interconnectées trouvé in vivo. Le SNC se compose principalement de neurones, d’astrocytes, d’oligodendrocytes et de microglies. En raison des efforts croissants pour remplacer et réduire l’utilisation animale, une variété de systèmes de culture cellulaire in vitro ont été développés pour explorer les propriétés cellulaires innées, ce qui permet le développement de thérapies pour les infections et les pathologies du SNC. Alors que certaines questions de recherche peuvent être abordées par des systèmes de culture cellulaire basés sur l’homme, tels que les cellules souches pluripotentes (induites), travailler avec des cellules humaines a ses propres limites en ce qui concerne la disponibilité, les coûts et l’éthique. Ici, nous décrivons un protocole unique pour isoler et cultiver des cellules à partir de cerveaux de souris embryonnaires. Les cultures de cellules neurales mixtes qui en résultent imitent plusieurs populations cellulaires et interactions trouvées dans le cerveau in vivo. Par rapport aux méthodes équivalentes actuelles, ce protocole imite plus étroitement les caractéristiques du cerveau et recueille également plus de cellules, permettant ainsi d’étudier plus de conditions expérimentales à partir d’une souris gravide. De plus, le protocole est relativement facile et hautement reproductible. Ces cultures ont été optimisées pour une utilisation à différentes échelles, y compris des cribles à haut débit à 96 puits, des analyses de microscopie à 24 puits et des cultures à 6 puits pour la cytométrie en flux et l’analyse de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR). Cette méthode de culture est un outil puissant pour étudier l’infection et l’immunité dans le contexte d’une partie de la complexité du SNC avec la commodité des méthodes in vitro .

Introduction

Il est essentiel d’améliorer notre compréhension du système nerveux central (SNC) pour améliorer les options thérapeutiques pour de nombreuses maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives. Le SNC, un réseau complexe de cellules interconnectées dans le cerveau, la moelle épinière et les nerfs optiques, comprend des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et leurs cellules immunitaires innées, la microglie¹. Une approche in vitro peut souvent réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour effectuer des recherches significatives; Cependant, la nature complexe du SNC rend impossible la récapitulation de la situation in vivo à l’aide de lignées cellulaires. Les cultures de cellules neurales mixtes constituent un outil de recherche extrêmement précieux pour étudier les questions de neuro(immuno)logie dans un modèle pertinent, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R) ^2,3.

Thomson et al. ont décrit une méthode de culture cellulaire utilisant des cellules prénatales de la moelle épinière qui se différencient en tous les principaux types de cellules du SNC^{susmentionnés 4}. Ce système a également la formation de synapses, les axones myélinisés et les nœuds de Ranvier. La principale limitation de cette méthode de culture est que, étant la moelle épinière, elle ne modélise pas utilement le cerveau, et les rendements cellulaires du jour embryonnaire 13 (E13) de la moelle épinière se contractent. Ainsi, cela limite le nombre de conditions expérimentales qui peuvent être étudiées. Par conséquent, cette étude visait à développer un nouveau système de culture cellulaire qui récapitule les caractéristiques du cerveau avec un rendement cellulaire accru pour réduire les besoins des animaux.

En utilisant Thomson et al. comme point de départ, nous avons développé un modèle de culture cellulaire dérivé uniquement de cerveaux de souris prénatals. Ces cultures ont les mêmes populations cellulaires, l’interconnectivité et les mêmes options de traitement que les cultures de la moelle épinière, sauf qu’il y a moins de myélinisation en comparaison. Cependant, avoir un modèle in vitro du SNC avec un rendement cellulaire environ trois fois plus élevé est plus efficace, nécessitant moins de souris et moins de temps de traitement des embryons. Nous avons optimisé ce système de culture unique pour de multiples applications et échelles en aval, y compris l’utilisation de lamelles de couverture en verre pour l’analyse microscopique et de différentes tailles de plaques de puits en plastique, y compris des plaques de 96 puits pour la recherche à haut débit.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux étaient conformes aux lois et directives locales pour l’utilisation des animaux et ont été approuvées par le comité d’examen éthique local de l’Université de Glasgow. Les animaux ont été logés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes conformément à la loi britannique de 1986 sur les procédures scientifiques sur les animaux, sous les auspices d’une licence de projet du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Pour cette étude, des souris adultes C57BL/6J élevées en interne ont été utilisées. L’utilisation de jeunes femmes (8-12 semaines) est recommandée en raison du taux de réussite plus élevé de la grossesse; Les mâles peuvent être réutilisés pour plusieurs cycles de reproduction. La figure 1 représente un aperçu schématique de la méthode décrite pour générer des cultures neuronales et gliales mixtes.

1. Préparation des consommables de culture tissulaire

1. Préparer les assiettes et/ou les plats contenant des lamelles de microscopie à l’intérieur d’une enceinte de sécurité de classe 2. Stériliser tous les réactifs ou autoclaves pour assurer la stérilité pendant la période de culture.
2. Ajouter le volume approprié de BA-PLL (13,2 μg/mL de poly-L-lysinehydrobromure [PLL] dans un tampon d’acide borique [BA] [50 mM d’acide borique, 12,5 mM de tétraborate de sodium, pH 8,5]; voir le tableau des matériaux) à chaque puits (1 000 μL/puits dans une plaque de 6 puits, 100 μL/puits dans une plaque de 96 puits; les volumes sont résumés dans le tableau 1). Pour les lames de couverture de microscopie, ajouter 20 ml de BA-PLL à une boîte de culture tissulaire de 9 cm de diamètre contenant 200 lamelles de couverture stériles et agiter pour répartir uniformément.
3. Incuber à 37 °C pendant 1-2 h.
4. Retirer la solution BA-PLL de chaque puits ou plat contenant des lames de couverture de microscopie et laver en ajoutant 20 ml d’eau stérile, en faisant tourbillonner les lames de couverture, puis en retirant l’eau. Répétez cette étape de lavage trois fois. Pour un plat contenant des lamelles de couverture, laissez de l’eau stérile dans la boîte de culture tissulaire lors du lavage final pour retirer facilement les lamelles de couverture.
5. Retirer autant de liquide que possible avec une pipette stérile et laisser sécher pendant au moins 2 h à toute la nuit.
6. Conservez les plaques revêtues à 4 °C jusqu’à 2 mois.
   REMARQUE: La solution préparée d’acide borique avec poly-l-lysine (BA-PLL) peut être réutilisée jusqu’à trois fois, en ajoutant une nouvelle LPL à chaque fois. Conserver la BA-PLL à 4 °C. Les plats sont traités avec BA-PLL, car la LPL permet aux cellules de coller et de se développer. Sans ce traitement, les cellules se soulèveront après environ 1 semaine de culture et ne pourront plus se différencier.

2. Dissection de cerveaux embryonnaires E17

1. Cologer une ou plusieurs souris femelles avec une souris mâle. Vérifiez quotidiennement les femelles pour un bouchon de mucus, indiquant que l’accouplement a eu lieu.
   REMARQUE: Toute souris femelle « bouchée » doit être séparée du mâle pour assurer la date de début correcte de la gestation. Les souris peuvent être pesées pour confirmer la grossesse ou surveillées visuellement.
2. Abattre la souris gravide à E17 en utilisant des méthodes appropriées conformément aux directives et aux lois locales en matière de bien-être animal, par exemple, en augmentant la concentration de dioxyde de carbone (CO₂), une surdose anesthésique mortelle ou une luxation du cou.
   NOTE: La méthode choisie ne doit pas perturber les embryons. Pour cette étude, l’exposition à une concentration croissante de dioxyde de carbone gazeux suivie de la confirmation de la mort par sectionnement de l’artère fémorale a été utilisée pour éliminer les mères gravides.
3. Placez la souris gravide abattue sur le dos sur une planche de dissection; Bien qu’il ne soit pas nécessaire de le cerner, cela pourrait faciliter la tâche des chercheurs inexpérimentés. Pincez la ligne médiane de l’abdomen à l’aide d’une pince. À l’aide de ciseaux tranchants, ouvrez l’abdomen à travers la peau et le péritoine sur la ligne médiane allant des organes génitaux à la cage thoracique, en prenant soin de ne pas percer l’utérus.
   1. L’utérus de souris a deux cornes, chacune contenant généralement un à cinq embryons. Retirez l’utérus contenant les embryons de la mère et placez-le immédiatement sur de la glace.
4. Coupez le sac vitellin sur le côté des placentas, en prenant soin de ne pas endommager les embryons, et retirez les embryons de leur sac vitellin.
5. Décapitant immédiatement les embryons. Ajouter les têtes décapitées dans un plat avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) sans calcium (Ca 2+) et magnésium (Mg²⁺) (HBSS-/-) sur glace.
   NOTE: Si le génotypage est nécessaire, on peut enlever la queue à ce stade pour une analyse génétique. Lorsque plusieurs génotypes sont attendus, les têtes de chaque embryon doivent être conservées séparément pour la culture.
6. À l’aide de pinces inclinées, placez la tête sur le côté vers la gauche.
7. Percez l’œil avec un bord de la pince, en tenant fermement le menton avec l’autre.
8. En commençant par la nuque, déchirez doucement la peau du cuir chevelu le long de la ligne médiane vers le bout du museau.
9. En entrant par la moelle épinière, visible comme un ovale blanc, utilisez les pinces inclinées pour ouvrir le crâne le long de la ligne médiane, exposant ainsi le cerveau.
10. Décollez doucement le crâne sur le côté tourné vers le haut, exposant le cerveau.
11. Soulevez le cerveau hors du crâne, en éliminant le crâne une fois que le cerveau a été complètement retiré.
12. À l’aide de la pince, retirez les méninges, qui se distinguent par une fine membrane avec des vaisseaux sanguins denses.
13. Placer la cervelle dans un bijou (voir le tableau des matières) contenant 2 mL de HBSS-/- sur glace.
14. Répétez les étapes 2.6 à 2.13 avec les cerveaux restants, en ajoutant jusqu’à quatre cerveaux par bijou.
15. Ajouter 250 μL de trypsine 10x au bijou et triturer la cervelle en secouant le bijou. Incuber pendant 15 min à 37 °C.
    REMARQUE: Toutes les étapes à partir de ce moment doivent être effectuées dans une houlette de culture tissulaire stérile.
16. Décongeler 2 mL d’inhibiteur de la trypsine (SD) du soja (Leibovitz L-15, 0,52 mg/mL d’inhibiteur de la trypsine du soja, 40 μg/mL de DNase I, 3 mg/mL d’albumine sérique bovine [BSA] fraction V; voir le tableau des matières) à partir de -20 °C en le plaçant à 37 °C.
17. Ajouter 2 mL d’inhibiteur du SD à chaque bijou contenant des cerveaux (par bijou contenant jusqu’à quatre cerveaux), en secouant à nouveau le bijou pour le disperser uniformément.
    REMARQUE: L’inhibiteur SD diminue l’activité de la trypsine pour éviter la digestion inutile des échantillons et préserver la viabilité cellulaire.
18. Sans centrifugation, retirer 2 mL du surnageant de chaque bijou et transférer dans un tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas transférer d’amas cellulaires.
19. Triturer les cellules restantes dans le bijou avec une aiguille de 19 G fixée à une seringue de 5 ml en aspirant la suspension deux fois. Cela créera un mélange épais semblable à du mucus.
    1. Répétez deux fois de plus à l’aide d’une aiguille de 21 G. S’il reste des touffes, triturez une fois de plus avec l’aiguille de 21 G.
20. Transférer les cellules du bijou dans le même tube à centrifuger de 15 ml (à partir de l’étape 2.18) à l’aide d’une aiguille de 23 g.
21. Centrifuger à 200 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min.
22. Retirer tout le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et le transférer dans un autre tube à centrifuger de 15 mL, en prenant soin de ne pas déranger la pastille lâche au fond contenant les cellules requises.
23. Centrifuger à nouveau le surnageant à 200 x g à TA pendant 5 min.
    NOTE: Cette étape n’est pas essentielle, mais si l’on a besoin de nombreuses cellules ou a peu d’embryons, on pourrait effectuer cette étape pour récupérer autant de cellules que possible du surnageant.
24. À l’aide de 10 mL de média de placage (49 % de milieu aigle modifié de Dulbecco [DMEM], 1 % de pénicilline/streptomycine [Pen/Strep], 25 % de sérum de cheval, 25 % d’HBSS avec Ca 2+ et Mg² + [HBSS⁺ /+]; voir le tableau des matières), combiner et remettre en suspension les deux pastilles ensemble pour créer une suspension cellulaire entière.
25. Compter les cellules à l’aide de bleu de trypan et d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules numériques, et diluer la suspension cellulaire avec des particules à une concentration de 1,8 x 10⁶ cellules/mL.

3. Placage des cellules

1. Ajouter le volume requis de la suspension cellulaire au format requis tel qu’indiqué dans le tableau 1 : 1 000 μL par puits en format 6 puits, 50 μL par puits en format 96 puits ou 100 μL par lamelle de couverture.
2. Incuber pendant 2-4 h à 37 °C avec 5%-7% CO₂. Vérifiez que les cellules ont adhéré à l’aide d’un microscope inversé.
3. Retirez le média et complétez avec un nouveau milieu de différenciation (DM+ : DM- incluant 10 μg/mL d’insuline. DM- : DMEM, 1 % Pen/Strep, hydrocortisone 50 nM, 10 ng/mL de biotine, 2,5 mL de supplément de milieu 100x N1; voir le tableau des matières). Les volumes sont détaillés dans le tableau 1. Appuyez sur les lamelles de couverture flottantes à l’aide d’un embout de pipette stérile.

4. Maintenir les cultures

REMARQUE: Ces cultures nécessitent une alimentation trois fois par semaine pour soutenir une croissance et une différenciation optimales. Les cultures atteindront une santé et une maturité optimales pour les expériences sur DIV (jours in vitro) 21. Les cellules peuvent être conservées en culture jusqu’à 28 jours, après quoi les cultures dégénèrent rapidement.

1. Trois fois par semaine jusqu’à DIV12, remplacer une partie du surnageant par du DM+ frais en retirant 500 μL par puits en format 6 puits, 50 μL par puits en format 96 puits, ou 500 μL par antenne contenant trois lamelles de couverture, et en ajoutant 600 μL par puits en format 6 puits, 60 μL par puits en format 96 puits, ou 600 μL par antenne parabolique (tableau 1).
2. Trois fois par semaine à partir de DIV13, remplacer une partie du surnageant par du DM- frais en retirant 500 μL par puits dans un format à 6 puits, 50 μL par puits dans un format 96 puits, ou 500 μL par antenne contenant trois lamelles de couverture, et en ajoutant 600 μL par puits dans un format 6 puits, 60 μL par puits dans un format 96 puits, ou 600 μL par antenne parabolique (tableau 1).

Résultats

Microscopie
Les cultures cultivées sur des lamelles de verre sont idéales pour être analysées par microscopie. Pour visualiser le développement des cultures, les lamelles de couverture ont été fixées dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4% à plusieurs points temporels de DIV0 (une fois les cellules attachées) à DIV28. Les cultures ont été colorées pour l’imagerie par immunofluorescence comme décrit précédemment⁵ en utilisant trois combinaisons de coloration dif...

Discussion

Le SNC est un réseau complexe qui s’étend du cerveau à la moelle épinière et se compose de nombreux types de cellules, principalement des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et des microglies¹. Comme chaque cellule a un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et la génération de réponses appropriées aux défis du SNC 9,10,11^, un système de culture qui contient tous ces types de cellules est u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor