Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Modelle des Zentralnervensystems (ZNS) müssen das komplexe Netzwerk miteinander verbundener Zellen rekapitulieren, das in vivo zu finden ist.Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia. Aufgrund der zunehmenden Bemühungen, den Einsatz von Tieren zu ersetzen und zu reduzieren, wurde eine Vielzahl von In-vitro-Zellkultursystemen entwickelt, um die Eigenschaften angeborener Zellen zu erforschen, die die Entwicklung von Therapeutika für ZNS-Infektionen und -Pathologien ermöglichen. Während bestimmte Forschungsfragen mit humanen Zellkultursystemen beantwortet werden können, wie z. B. (induzierte) pluripotente Stammzellen, hat die Arbeit mit menschlichen Zellen ihre eigenen Grenzen in Bezug auf Verfügbarkeit, Kosten und Ethik. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus embryonalen Mäusegehirnen. Die daraus resultierenden gemischten neuronalen Zellkulturen ahmen mehrere Zellpopulationen und Interaktionen nach, die im Gehirn in vivo zu finden sind. Im Vergleich zu aktuellen äquivalenten Methoden ahmt dieses Protokoll die Eigenschaften des Gehirns genauer nach und sammelt auch mehr Zellen, so dass mehr experimentelle Bedingungen an einer trächtigen Maus untersucht werden können. Darüber hinaus ist das Protokoll relativ einfach und sehr gut reproduzierbar. Diese Kulturen wurden für den Einsatz in verschiedenen Maßstäben optimiert, darunter 96-Well-basierte Hochdurchsatz-Screens, 24-Well-Mikroskopieanalysen und 6-Well-Kulturen für die Durchflusszytometrie und die Analyse der reversen Transkriptions-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Kulturmethode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Infektionen und Immunität im Zusammenhang mit einem Teil der Komplexität des ZNS mit der Bequemlichkeit von In-vitro-Methoden zu untersuchen.

Einleitung

Die Verbesserung unseres Verständnisses des zentralen Nervensystems (ZNS) ist entscheidend, um die therapeutischen Optionen für viele neuroinflammatorische und neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern. Das ZNS, ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Zellen im Gehirn, Rückenmark und Sehnerven, besteht aus Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und ihren angeborenen Immunzellen, den Mikroglia¹. Ein In-vitro-Ansatz kann die Anzahl der Mäuse, die für sinnvolle Forschung erforderlich sind, oft drastisch reduzieren. Die Komplexität des ZNS macht es jedoch unmöglich, die In-vivo-Situation mit Hilfe von Zelllinien zu rekap....

Protokoll

Alle Tierversuche entsprachen den lokalen Gesetzen und Richtlinien für die Verwendung von Tieren und wurden von der örtlichen Ethikkommission an der Universität Glasgow genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten krankheitserregerfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit dem UK Animals Scientific Procedures Act 1986 unter der Schirmherrschaft einer Projektlizenz des britischen Innenministeriums untergebracht. Für diese Studie wurden selbst gezüchtete erwachsene C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Verwendung von jungen Weibchen (8-12 Wochen) wird aufgrund der höheren Erfolgsrate der Schwangerschaft empfohlen. Männchen können für mehrere Zuchtrunden wiederverwendet werden. <....

Diskussion

Das ZNS ist ein komplexes Netzwerk, das sich vom Gehirn bis zum Rückenmark erstreckt und aus vielen Zelltypen besteht, vor allem Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia¹. Da jede Zelle eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Erzeugung angemessener Reaktionen auf Herausforderungen im ZNS^{spielt 9,10,11}, ist ein Kultursystem, das all diese Zelltypen enthält, ein nützliches und vielseitiges Werkzeug, um zu untersuchen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor