感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

要約

このプロトコルは、神経(免疫)学研究のために、胚17日目のマウス脳から中枢神経系細胞培養を生成するユニークな方法を提示します。このモデルは、RT-qPCR、顕微鏡、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまな実験手法を使用して分析できます。

要約

中枢神経系(CNS)のモデルは、 in vivoで 見られる相互接続された細胞の複雑なネットワークを再現する必要があります。CNSは、主にニューロン、星状細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアで構成されています。動物の使用を置き換え、削減するための努力が高まっているため、CNS感染症および病状の治療法の開発を可能にする、生来の細胞特性を探索するために、さまざまな in vitro 細胞培養システムが開発されています。特定の研究課題は、(誘導された)多能性幹細胞などのヒトベースの細胞培養システムによって対処できますが、ヒト細胞を扱う作業には、可用性、コスト、および倫理に関して独自の制限があります。ここでは、マウスの胚性脳から細胞を単離および培養するための独自のプロトコルについて説明します。得られた混合神経細胞培養物は、 in vivoで脳に見られるいくつかの細胞集団および相互作用を模倣する。現在の同等の方法と比較して、このプロトコルは脳の特性をより厳密に模倣し、より多くの細胞を獲得するため、1匹の妊娠中のマウスからより多くの実験条件を調査できます。さらに、プロトコルは比較的簡単で再現性が高いです。これらの培養物は、96ウェルベースのハイスループットスクリーン、24ウェル顕微鏡分析、フローサイトメトリーおよび逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)分析用の6ウェル培養など、さまざまなスケールでの使用に最適化されています。この培養法は、 in vitro 法の利便性を備えたCNSの複雑さの文脈の中で感染と免疫を調査するための強力なツールです。

概要

中枢神経系(CNS)の理解を深めることは、多くの神経炎症性疾患および神経変性疾患の治療選択肢を改善するために重要です。CNSは、脳、脊髄、および視神経内の相互接続された細胞の複雑なネットワークであり、ニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、およびそれらの自然免疫細胞であるミクログリア¹で構成されています。in vitroアプローチは、多くの場合、有意義な研究を行うために必要なマウスの数を大幅に減らすことができます。しかし、CNSの複雑な性質により、細胞株を使用してin vivoの状況を再現することは不可能です。混合神経細胞培養は、置換、還元、改良(3R^{)の原則に沿って}、関連するモデルで神経(免疫)学の質問を調査するための非常に貴重な研究ツールを提供します^2,3。

Thomsonらは、前述の全ての主要なCNS細胞型に分化する出生前脊髄細胞を用いた細胞培養方法を記載した⁴。このシステムはまた、シナプス形成、有髄軸索、およびランヴィエの結節を有する。この培養方法の主な制限は、脊髄であるため、脳を有用にモデル化せず、胚13日目(E13)の脊髄からの細胞収量が収縮していることです。したがって、これにより、調査できる実験条件の数が制限されます。そ....

プロトコル

すべての動物実験は、動物使用に関する現地の法律とガイドラインに準拠しており、グラスゴー大学の地元の倫理審査委員会によって承認されました。動物は、英国内務省プロジェクトライセンスの後援の下、1986年英国動物科学的手順法に従って、特定の病原体のない状態で飼育されました。この研究では、社内で飼育した成体C57BL / 6Jマウスを使用しました。妊娠の成功率が高いため、若い女性(8〜12週間)の使用が推奨されます。オスは繁殖の複数のラウンドに再利用することができます。 図1 は、混合ニューロンおよびグリア培養物を生成するための記載された方法の概略概要を表す。

1.組織培養消耗品の調製

1. クラス2安全キャビネット内の顕微鏡カバーガラスを含むプレートおよび/または皿を準備します。培養期間中の無菌性を確保するために、すべての試薬またはオートクレーブを滅菌してください。
2. 各ウェルに適切な量のBA-PLL(13.2 μg/mLポリ-L-リジン臭化水素酸塩[PLL]、ホウ酸緩衝液[BA][50 mMホウ酸、12.5 mM四ホウ酸ナトリウム、pH 8.5]; 材料表参照)を加えます(6ウェルプレートでは1,000 μL/ウェル、96ウェルプレートでは100 μL/ウェル、容量は 表1にまとめられてい....

ディスカッション

CNSは、脳から脊髄にまたがる複雑なネットワークであり、主にニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、ミクログリアなど、多くの細胞型で構成されています¹。各細胞は、CNS 9,10,11の恒常性を維持し、課題に対する適切な応答を生成する上で重要な役割を果たすため、これらすべての細胞タイプを含む培養.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor