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要約

このプロトコルは、神経(免疫)学研究のために、胚17日目のマウス脳から中枢神経系細胞培養を生成するユニークな方法を提示します。このモデルは、RT-qPCR、顕微鏡、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまな実験手法を使用して分析できます。

要約

中枢神経系(CNS)のモデルは、 in vivoで 見られる相互接続された細胞の複雑なネットワークを再現する必要があります。CNSは、主にニューロン、星状細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアで構成されています。動物の使用を置き換え、削減するための努力が高まっているため、CNS感染症および病状の治療法の開発を可能にする、生来の細胞特性を探索するために、さまざまな in vitro 細胞培養システムが開発されています。特定の研究課題は、(誘導された)多能性幹細胞などのヒトベースの細胞培養システムによって対処できますが、ヒト細胞を扱う作業には、可用性、コスト、および倫理に関して独自の制限があります。ここでは、マウスの胚性脳から細胞を単離および培養するための独自のプロトコルについて説明します。得られた混合神経細胞培養物は、 in vivoで脳に見られるいくつかの細胞集団および相互作用を模倣する。現在の同等の方法と比較して、このプロトコルは脳の特性をより厳密に模倣し、より多くの細胞を獲得するため、1匹の妊娠中のマウスからより多くの実験条件を調査できます。さらに、プロトコルは比較的簡単で再現性が高いです。これらの培養物は、96ウェルベースのハイスループットスクリーン、24ウェル顕微鏡分析、フローサイトメトリーおよび逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)分析用の6ウェル培養など、さまざまなスケールでの使用に最適化されています。この培養法は、 in vitro 法の利便性を備えたCNSの複雑さの文脈の中で感染と免疫を調査するための強力なツールです。

概要

中枢神経系(CNS)の理解を深めることは、多くの神経炎症性疾患および神経変性疾患の治療選択肢を改善するために重要です。CNSは、脳、脊髄、および視神経内の相互接続された細胞の複雑なネットワークであり、ニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、およびそれらの自然免疫細胞であるミクログリア1で構成されています。in vitroアプローチは、多くの場合、有意義な研究を行うために必要なマウスの数を大幅に減らすことができます。しかし、CNSの複雑な性質により、細胞株を使用してin vivoの状況を再現することは不可能です。混合神経細胞培養は、置換、還元、改良(3R)の原則に沿って、関連するモデルで神経(免疫)学の質問を調査するための非常に貴重な研究ツールを提供します2,3。

Thomsonらは、前述の全ての主要なCNS細胞型に分化する出生前脊髄細胞を用いた細胞培養方法を記載した4。このシステムはまた、シナプス形成、有髄軸索、およびランヴィエの結節を有する。この培養方法の主な制限は、脊髄であるため、脳を有用にモデル化せず、胚13日目(E13)の脊髄からの細胞収量が収縮していることです。したがって、これにより、調査できる実験条件の数が制限されます。そこで本研究では、動物に対する必要量を減らすために、細胞収量を増加させた脳の特性を再現する新しい細胞培養システムの開発を目指しました。

Thomsonらを出発点として、純粋に出生前のマウスの脳に由来する細胞培養モデルを開発しました。これらの培養物は、脊髄培養物と同じ細胞集団、相互接続性、および治療オプションを持っていますが、比較すると髄鞘形成が少ない点が異なります。しかし、約3倍高い細胞収量を有するCNS インビトロ モデルを有することは、より効率的であり、より少ないマウスおよびより少ない時間で胚を処理する。この独自の培養システムは、顕微鏡分析用のガラスカバースリップや、ハイスループット研究用の96ウェルプレートを含むさまざまなサイズのプラスチックウェルプレートを使用するなど、複数のダウンストリームアプリケーションとスケール向けに最適化しました。

プロトコル

すべての動物実験は、動物使用に関する現地の法律とガイドラインに準拠しており、グラスゴー大学の地元の倫理審査委員会によって承認されました。動物は、英国内務省プロジェクトライセンスの後援の下、1986年英国動物科学的手順法に従って、特定の病原体のない状態で飼育されました。この研究では、社内で飼育した成体C57BL / 6Jマウスを使用しました。妊娠の成功率が高いため、若い女性(8〜12週間)の使用が推奨されます。オスは繁殖の複数のラウンドに再利用することができます。 図1 は、混合ニューロンおよびグリア培養物を生成するための記載された方法の概略概要を表す。

1.組織培養消耗品の調製

  1. クラス2安全キャビネット内の顕微鏡カバーガラスを含むプレートおよび/または皿を準備します。培養期間中の無菌性を確保するために、すべての試薬またはオートクレーブを滅菌してください。
  2. 各ウェルに適切な量のBA-PLL(13.2 μg/mLポリ-L-リジン臭化水素酸塩[PLL]、ホウ酸緩衝液[BA][50 mMホウ酸、12.5 mM四ホウ酸ナトリウム、pH 8.5]; 材料表参照)を加えます(6ウェルプレートでは1,000 μL/ウェル、96ウェルプレートでは100 μL/ウェル、容量は 表1にまとめられています)。顕微鏡カバースリップの場合は、200枚の滅菌カバースリップが入った直径9 cmの組織培養皿に20 mLのBA-PLLを加え、回転させて均等に分散させます。
  3. 37°Cで1〜2時間インキュベートします。
  4. 顕微鏡カバーガラスを含む各ウェルまたはディッシュからBA-PLL溶液を取り出し、20 mLの滅菌水を加え、カバーガラスを旋回させてから水を除去して洗浄します。この洗浄手順を3回繰り返します。カバーガラスを含む皿の場合は、カバーガラスを簡単に取り除くために、最終洗浄時に組織培養皿に滅菌水を残します。
  5. 滅菌ピペットでできるだけ多くの液体を取り除き、少なくとも2時間から一晩乾燥させます。
  6. コーティングされたプレートを4°Cで最大2か月間保管します。
    注:ポリ-l-リジン(BA-PLL)溶液で調製したホウ酸は、毎回新しいPLLを追加して、最大3回再利用できます。BA-PLLは4°Cで保管してください。 PLLは細胞が突き出て成長することを可能にするので、皿はBA-PLLで処理されます。この処理を行わないと、細胞は約1週間の培養後に浮き上がり、分化できなくなります。

2. E17胚性脳の解剖

  1. 1匹または複数の雌マウスを雄マウスと共同飼育する。交尾が行われたことを示す粘液栓がないか毎日女性をチェックしてください。
    注:「プラグを差し込んだ」メスのマウスは、妊娠の正しい開始日を確保するためにオスから分離する必要があります。マウスの体重を測定して妊娠を確認するか、視覚的に監視することができます。
  2. 地域の動物福祉ガイダンスおよび法律に準拠した適切な方法、例えば、二酸化炭素(CO2)濃度の上昇、致死麻酔薬の過剰摂取、または首の脱臼などを使用して、E17で妊娠中のマウスを淘汰する。
    注:選択した方法は、胚を破壊してはなりません。この研究では、上昇する濃度の炭酸ガスへの曝露とそれに続く大腿動脈の切断による死亡の確認が、妊娠中のダムを淘汰するために使用されました。
  3. 淘汰された妊娠中のマウスを解剖板の背中に置きます。ピン留めする必要はありませんが、経験の浅い研究者にとっては簡単かもしれません。鉗子を使用して腹部の正中線をつまみます。鋭利なハサミを使用して、子宮に穴を開けないように注意しながら、生殖器から胸郭までの正中線を越えて皮膚と腹膜を通して腹部を切り開きます。
    1. マウスの子宮には2つの角があり、それぞれに通常1〜5個の胚が含まれています。胚を含む子宮を母親から取り除き、直ちに氷の上に置きます。
  4. 胎盤の側面にある卵黄袋を切り取り、胚を傷つけないように注意しながら、卵黄袋から胚を取り除きます。
  5. すぐに胚を斬首します。斬首された頭を、氷上でカルシウム(Ca2 +)とマグネシウム(Mg2 +)(HBSS-/-)を含まないハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を入れた皿に加えます。
    注:ジェノタイピングが必要な場合は、遺伝子分析のためにこの段階で尾を取り除くことができます。複数の遺伝子型が予想される場合は、各胚の頭部を別々に保管して培養する必要があります。
  6. 角度の付いた鉗子を使用して、頭を左向きの側に置きます。
  7. 鉗子の一方の端で目を突き刺し、もう一方の端であごをしっかりと保持します。
  8. うなじから始めて、鼻の先端に向かって正中線に沿って頭皮の皮膚をそっと引き裂きます。
  9. 白い楕円形として目立つ脊髄を通って入り、角度の付いた鉗子を使用して正中線に沿って頭蓋骨を割って開き、脳を露出させます。
  10. 上を向いた側の頭蓋骨をそっと剥がし、脳を露出させます。
  11. 脳を頭蓋骨から持ち上げ、脳が完全に除去されたら頭蓋骨を処分します。
  12. 鉗子を使用して、密な血管を持つ薄い膜として目立つ髄膜を取り除きます。
  13. 氷上で2 mLのHBSS-/-を含むビジュー( 材料の表を参照)に脳を置きます。
  14. 残りの頭脳で手順2.6から2.13を繰り返し、ビジューごとに最大4つの頭脳を追加します。
  15. 250 μLの10xトリプシンをビジューに加え、ビジューを振って脳を粉砕します。37°Cで15分間インキュベートします。
    注:この時点以降のすべての手順は、滅菌組織培養フードで実行する必要があります。
  16. 2 mLの大豆トリプシン(SD)阻害剤(Leibovitz L-15、大豆由来の0.52 mg/mLトリプシン阻害剤、40 μg/mL DNase I、3 mg/mLウシ血清アルブミン[BSA]画分V; 材料表参照)を-20°Cから37°Cで解凍します。
  17. 脳を含む各ビジューに2 mLのSD阻害剤を加え(最大4つの脳を含むビジューあたり)、ビジューを再度振って均一に分散させます。
    注:SD阻害剤はトリプシン活性を低下させ、サンプルの不必要な消化を防ぎ、細胞の生存率を維持します。
  18. 遠心分離せずに、各ビジューから2 mLの上清を取り除き、細胞凝集塊を移さないように注意しながら15 mLの遠沈管に移します。
  19. 懸濁液を2回吸引することにより、5 mLシリンジに取り付けられた19 Gの針でビジューの残りの細胞を粉砕します。これにより、濃厚な粘液のような混合物が作成されます。
    1. 21 Gの針を使用してさらに2回繰り返します。塊が残っている場合は、21Gの針でもう一度粉砕します。
  20. 23 Gの針を使用して、細胞をビジューから同じ15 mL遠沈管(ステップ2.18から)に移します。
  21. 室温(RT)で200 x g で5分間遠心分離します。
  22. 5 mLの血清学的ピペットを使用してすべての上清を取り除き、必要な細胞を含む底の緩いペレットを乱さないように注意しながら、別の15 mL遠沈管に移します。
  23. 上清を再び200 x g でRTで5分間遠心分離します。
    注:このステップは必須ではありませんが、多くの細胞が必要な場合、または胚が少ない場合は、このステップを実行して、上清からできるだけ多くの細胞を回収できます。
  24. 10 mLのプレーティングメディア(PM)(49%ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]、1%ペニシリン/ストレプトマイシン[ペン/連鎖球菌]、25%ウマ血清、25%HBSS、Ca2+およびMg2 + [HBSS+ /+]; 材料表を参照)を使用して、2つのペレットを組み合わせて再懸濁し、細胞全体の懸濁液を作成します。
  25. トリパンブルーと血球計算盤またはデジタルセルカウンターを使用して細胞をカウントし、細胞懸濁液をPMで1.8 x 106 細胞/mLの濃度に希釈します。

3.セルのメッキ

  1. 表1に詳述されているように、必要量の細胞懸濁液を必要なフォーマットに加えます:6ウェルフォーマットではウェルあたり1,000 μL、96ウェルフォーマットではウェルあたり50 μL、またはカバーグラスあたり100 μL。
  2. 5%-7%CO 2中で37°Cで2〜4時間インキュベートする。倒立顕微鏡で細胞が接着していることを確認する。
  3. 培地を取り出し、新しい分化培地(DM+:DM-10 μg/mLインスリンを含む。DM-: DMEM、1%ペン/連鎖球菌、50 nMヒドロコルチゾン、10 ng / mLビオチン、2.5 mL 100x N1培地サプリメント; 材料表を参照)。ボリュームの詳細を 表 1 に示します。浮いているカバーガラスを滅菌ピペットチップで押し下げます。

4.文化の維持

注:これらの培養では、最適な成長と分化をサポートするために、週に3回給餌する必要があります。培養物は、DIV( in vitroでの日数)21での実験に最適な健康と成熟度に達します。細胞は最大28日間培養中に保持することができ、その後培養物は急速に変性する。

  1. DIV12まで週に3回、6ウェルフォーマットでウェルあたり500 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり50 μL、または3つのカバーガラスを含むディッシュあたり500 μLを除去し、6ウェルフォーマットでウェルあたり600 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり60 μLを加えて、上清の一部を新しいDM+と交換します。 またはカバースリップ皿あたり600μL(表1)。
  2. DIV13以降、週3回、上清の一部を新鮮なDM-と交換し、6ウェルフォーマットでウェルあたり500 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり50 μL、または3つのカバーガラスを含むディッシュあたり500 μLを除去し、6ウェルフォーマットでウェルあたり600 μL、96ウェルフォーマットでウェルあたり60 μLを追加します。 またはカバースリップ皿あたり600μL(表1)。

結果

顕微鏡
ガラスカバーガラスで育てられた培養物は、顕微鏡で分析するのに理想的です。培養の発達を視覚化するために、カバーガラスをDIV0(細胞が付着した後)からDIV28までの複数の時点で4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定しました。NG2(未熟希突起膠細胞)とネスチン(神経幹/前駆細胞)、神経細胞マーカーとしてSMI31(軸索)、MBP(ミエリン)、NeuN(ニューロン細胞体)、またはグリア?...

ディスカッション

CNSは、脳から脊髄にまたがる複雑なネットワークであり、主にニューロン、希突起膠細胞、星状細胞、ミクログリアなど、多くの細胞型で構成されています1。各細胞は、CNS 9,10,11の恒常性を維持し、課題に対する適切な応答を生成する上で重要な役割を果たすため、これらすべての細胞タイプを含む培養...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

エドガーとリニントンの研究室のメンバー、特にクリス・リニントン教授、ダイアナ・アルセニ博士、カティア・ミュックリッシュ博士のアドバイス、有益なコメント、そして私たちがこれらの文化を立ち上げる際の文化への供給の支援に感謝します。特に、Cell Profiler パイプラインの出発点を提供してくださった Muecklisch 博士に感謝します。この作業は、MSソサエティ(助成金122)とユーリとローナチェルナヨフスキー財団によってMPに支援されました。グラスゴー大学がJCとMPに資金を提供する。ウェルカムトラスト(217093 / Z / 19 / Z)および医学研究評議会(MRV0109721)をGJGに譲渡します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10x TrypsinSigmaT4549-100MLTo digest tissue
140 mm TC DishFisher11339283Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL FalconSarstedt62554502To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needleHenke Sass Wolf4710012040For trituration of sample
21 G needleBD304432For trituration of sample
23 G needleHenke Sass Wolf4710006030For trituration of sample
35 mm TC DishCorning430165Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringeFisher15869152For trituration of sample
6 well plateCorning3516To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL BijouxFisherDIS080010RTo put brains intp
96 well plateCorning3596To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PEMiltenyi130-123-284For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forcepsDumont0108-5/45-POFor dissection
BiotinSigmaB4501For DM+/-
Boric AcidSigmaB6768-500GFor boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69Biolegend101825For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11Biolegend103139For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70Biolegend101243For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction VSigmaA3059-10GFor SD Inhibitor
CNPAbcamAB6319Mature oligodendrocytes
CoverslipVWR631-0149To plate out cells for microscopy
Dissection ScissorsSigmaS3146-1EAFor dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-GlutamineGibco21969-035For DM+/-, and for plating media
DNase IThermofisher18047019For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase ISigmaD4263For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780Thermofisher65-0865-14Live / Dead stain
Fine forcepsDumont0102-SS135-POFor dissection
GFAPInvitrogen13-0300Astrocytes
HBSS w Ca MgSigmaH9269-500MLFor plating media
HBSS w/o Ca MgSigmaH9394-500MLFor brains to be added to
Horse SerumGibco26050-070For plating media
HydrocortisoneSigmaH0396For DM+/-
Iba1Alpha-Laboratories019-1971Microglia
InsulinSigmaI1882For DM+
Leibovitz L-15GIbco11415-049For SD Inhibitor
MBPBio-RadMCA409SMyelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA KitBioTechneDY478-05ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplementSigmaN6530-5MLFor DM+/-
NestinMerckMAB353Neuronal stem/progenitor cells
NeuNThermofisherPA578499Neuronal cell body
NG2SigmaAB5320Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APCMiltenyi130-119-155For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/StrepSigmaP0781-100MLFor DM+/-, and for plating media
Poly-L-LysinehydrobromideSigmaP1274For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31BioLegend801601Axons
Sodium TetraborateSigma221732-100GFor boric acid buffer
TrizolThermofisher15596026For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybeanSigmaT9003-100MGFor SD Inhibitor

参考文献

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