Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол представляет собой уникальный способ создания культур клеток центральной нервной системы из эмбрионального мозга мыши на 17-й день для нейро(иммуно)логических исследований. Эта модель может быть проанализирована с использованием различных экспериментальных методов, включая ОТ-кПЦР, микроскопию, ИФА и проточную цитометрию.
Модели центральной нервной системы (ЦНС) должны повторять сложную сеть взаимосвязанных клеток, обнаруженных in vivo. ЦНС состоит в основном из нейронов, астроцитов, олигодендроцитов и микроглии. В связи с растущими усилиями по замене и сокращению использования животных были разработаны различные системы культивирования клеток in vitro для изучения свойств врожденных клеток, которые позволяют разрабатывать терапевтические средства для инфекций и патологий ЦНС. В то время как некоторые исследовательские вопросы могут быть решены с помощью систем культивирования клеток человека, таких как (индуцированные) плюрипотентные стволовые клетки, работа с клетками человека имеет свои собственные ограничения в отношении доступности, затрат и этики. Здесь мы описываем уникальный протокол выделения и культивирования клеток из эмбрионального мозга мыши. Полученные смешанные культуры нервных клеток имитируют несколько клеточных популяций и взаимодействий, обнаруженных в мозге in vivo. По сравнению с текущими эквивалентными методами, этот протокол более точно имитирует характеристики мозга, а также собирает больше клеток, что позволяет исследовать больше экспериментальных условий на одной беременной мыши. Кроме того, протокол относительно прост и легко воспроизводим. Эти культуры были оптимизированы для использования в различных масштабах, включая высокопроизводительные экраны на 96 лунок, 24-луночный микроскопический анализ и 6-луночные культуры для проточной цитометрии и количественного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). Этот метод культивирования является мощным инструментом для исследования инфекции и иммунитета в контексте некоторой сложности ЦНС с удобством методов in vitro .
Улучшение нашего понимания центральной нервной системы (ЦНС) имеет решающее значение для улучшения терапевтических возможностей для многих нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний. ЦНС, сложная сеть взаимосвязанных клеток в головном, спинном мозге и зрительных нервах, включает нейроны, олигодендроциты, астроциты и их врожденные иммунные клетки, микроглию1. Подход in vitro часто может резко сократить количество мышей, необходимых для проведения значимых исследований; однако сложная природа ЦНС делает невозможным повторение ситуации in vivo с использованием клеточных линий. Смешанные культуры нервных клеток представ....
Все эксперименты на животных соответствовали местным законам и рекомендациям по использованию животных и были одобрены местным комитетом по этической экспертизе в Университете Глазго. Животные были размещены в особых условиях, свободных от патогенов, в соответствии с Законом Великобритании о научных процедурах животных 1986 года под эгидой лицензии на проект Министерства внутренних дел Великобритании. Для этого исследования были использованы взрослые мыши C57BL/6J, выведенные собственными силами. Использование молодым женщинам (8-12 недель) рекомендуется из-за более высокой успешности беременности; Самцов можно повторно использовать для нескольких раундов разведения. ....
Микроскопия
Культуры, выращенные на стеклянных покровных стеклах, идеально подходят для анализа с помощью микроскопии. Чтобы визуализировать развитие культур, покровные стекла фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в нескольких временных точках от DIV0 (после присоединения к?.......
ЦНС представляет собой сложную сеть, которая простирается от головного мозга до спинного мозга и состоит из многих типов клеток, преимущественно нейронов, олигодендроцитов, астроцитов и микроглии1. Поскольку каждая клетка играет важную роль в поддержании гомеостаза и выр?.......
Авторам раскрывать нечего.
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Эдгара и Линингтона, в частности профессора Криса Линингтона, доктора Диану Арсени и доктора Катю Мюклиш, за их советы, полезные комментарии и помощь в кормлении культур, пока мы создавали эти культуры. Особая благодарность д-ру Мюклишу (Dr. Muecklisch) за то, что он предоставил отправные точки для конвейеров Cell Profiler. Работа выполнена при поддержке Общества рассеянного склероза (грант 122) и Фонда Юрия и Лорны Чернайовских при МП; Университет Глазго финансирует JC и MP; и Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) и Совет по медицинским исследованиям (MRV0109721) в GJG.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены