Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

Resumo

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Resumo

Modelos do sistema nervoso central (SNC) devem recapitular a complexa rede de células interconectadas encontradas in vivo. O SNC consiste principalmente de neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Devido aos crescentes esforços para substituir e reduzir o uso animal, uma variedade de sistemas de cultura de células in vitro tem sido desenvolvida para explorar propriedades celulares inatas, que permitem o desenvolvimento de terapêuticas para infecções e patologias do SNC. Embora certas questões de pesquisa possam ser abordadas por sistemas de cultura de células baseados em humanos, como células-tronco pluripotentes (induzidas), trabalhar com células humanas tem suas próprias limitações em relação à disponibilidade, custos e ética. Aqui, descrevemos um protocolo único para isolar e cultivar células de cérebros embrionários de camundongos. As culturas de células neurais mistas resultantes imitam várias populações de células e interações encontradas no cérebro in vivo. Em comparação com os métodos equivalentes atuais, este protocolo imita mais de perto as características do cérebro e também ganha mais células, permitindo assim que mais condições experimentais sejam investigadas a partir de uma rata grávida. Além disso, o protocolo é relativamente fácil e altamente reprodutível. Essas culturas foram otimizadas para uso em várias escalas, incluindo telas de alto rendimento baseadas em 96 poços, análise de microscopia de 24 poços e culturas de 6 poços para citometria de fluxo e análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR). Este método de cultura é uma ferramenta poderosa para investigar infecção e imunidade dentro do contexto de alguma complexidade do SNC com a conveniência de métodos in vitro .

Introdução

Melhorar nossa compreensão do sistema nervoso central (SNC) é fundamental para melhorar as opções terapêuticas para muitas doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas. O SNC, uma rede complexa de células interconectadas dentro do cérebro, medula espinhal e nervos ópticos, compreende neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e suas células imunes inatas, a microglia¹. Uma abordagem in vitro pode muitas vezes reduzir drasticamente o número de camundongos necessários para realizar pesquisas significativas; no entanto, a natureza complexa do SNC torna impossível recapitular a situação in vivo usando linhagens celulares. Culturas mistas de células neurais fornecem uma ferramenta de pesquisa extremamente valiosa para investigar questões de neuro(imuno)logia em um modelo relevante, de acordo com os princípios de Substituição, Redução e Refinamento (3Rs)^2,3.

Thomson e col. descreveram um método de cultura celular utilizando células pré-natais da medula espinhal que se diferenciam em todos os principais tipos celulares do SNC já^mencionados4. Este sistema também tem formação de sinapses, axônios mielinizados e nós de Ranvier. A principal limitação deste método de cultura é que, sendo a medula espinhal, ele não modela utilmente o cérebro, e os rendimentos celulares a partir do 13º dia embrionário (E13) medulares são constritores. Assim, isso limita o número de condições experimentais que podem ser investigadas. Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um novo sistema de cultura celular que recapitule as características do cérebro com aumento do rendimento celular para reduzir as exigências para animais.

Usando Thomson et al., como ponto de partida, desenvolvemos um modelo de cultura celular derivado puramente de cérebros pré-natais de camundongos. Essas culturas têm as mesmas populações celulares, interconectividade e opções de tratamento que as culturas da medula espinhal, exceto que há menos mielinização em comparação. No entanto, ter um modelo in vitro do SNC com um rendimento celular aproximadamente três vezes maior é mais eficiente, exigindo menos camundongos e menos tempo de processamento de embriões. Otimizamos este sistema de cultura exclusivo para várias aplicações e escalas downstream, incluindo o uso de lamínulas de vidro para análise de microscopia e vários tamanhos de placas de poço plástico, incluindo placas de 96 poços para pesquisa de alto rendimento.

Protocolo

Todos os experimentos com animais cumpriram as leis e diretrizes locais para uso de animais e foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ética local da Universidade de Glasgow. Os animais foram alojados em condições específicas livres de patógenos de acordo com o UK Animals Scientific Procedures Act 1986, sob os auspícios de uma Licença de Projeto do Ministério do Interior do Reino Unido. Para este estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6J adultos criados internamente. O uso de fêmeas jovens (8-12 semanas) é recomendado devido à maior taxa de sucesso da gravidez; Os machos podem ser reutilizados para várias rodadas de reprodução. A Figura 1 representa uma visão geral esquemática do método descrito para gerar culturas mistas neuronal e glial.

1. Preparação dos consumíveis para cultura de tecidos

1. Prepare as placas e/ou pratos contendo lamínulas de microscopia dentro de um armário de segurança Classe 2. Esterilizar todos os reagentes ou autoclave para garantir a esterilidade durante o período de cultura.
2. Adicionar o volume apropriado de BA-PLL (13,2 μg/mL de poli-L-lisinaidrobrometo [PLL] em tampão de ácido bórico [BA] [ácido bórico 50 mM, tetraborato de sódio 12,5 mM, pH 8,5]; ver Tabela de Materiais) a cada poço (1.000 μL/poço em uma placa de 6 poços, 100 μL/poço em uma placa de 96 poços; os volumes estão resumidos na Tabela 1). Para as lamínulas de microscopia, adicionar 20 mL de BA-PLL a uma placa de cultura de tecidos de 9 cm de diâmetro contendo 200 lamínulas estéreis e girar para distribuir uniformemente.
3. Incubar a 37 °C durante 1-2 h.
4. Remova a solução BA-PLL de cada poço ou prato contendo lamínulas de microscopia e lave adicionando 20 mL de água estéril, girando as lamínulas e, em seguida, removendo a água. Repita esta etapa de lavagem três vezes. Para um prato contendo lamínulas, deixe água estéril na placa de cultura de tecidos na lavagem final para remover facilmente as lamínulas.
5. Retire o máximo de líquido possível com uma pipeta estéril e deixe secar por pelo menos 2 h durante a noite.
6. Conservar as placas revestidas a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.
   NOTA: O ácido bórico preparado com solução de poli-l-lisina (BA-PLL) pode ser reutilizado até três vezes, adicionando novo PLL a cada vez. Conservar o BA-PLL a 4 °C. Os pratos são tratados com BA-PLL, pois o PLL permite que as células grudem e cresçam. Sem esse tratamento, as células se levantam após aproximadamente 1 semana de cultura e não conseguem mais se diferenciar.

2. Dissecção de cérebros embrionários E17

1. Co-abrigar um ou vários camundongos fêmeas com um camundongo macho. Verifique as fêmeas diariamente para um tampão de muco, indicando que o acasalamento ocorreu.
   NOTA: Qualquer camundongo fêmea "plugado" precisa ser separado do macho para garantir a data correta de início da gestação. Os ratos podem ser pesados para confirmar a gravidez ou monitorados visualmente.
2. Cull a rata prenhe no E17 usando métodos apropriados em conformidade com as diretrizes e leis locais de bem-estar animal, por exemplo, aumentando a concentração de dióxido de carbono (CO₂), uma overdose letal de anestésico ou luxação do pescoço.
   NOTA: O método escolhido não deve perturbar os embriões. Para este estudo, a exposição a uma concentração crescente de gás carbônico seguida da confirmação de morte por corte da artéria femoral foi usada para abater fêmeas grávidas.
3. Coloque o rato prenhe abatido de costas em uma placa de dissecação; Embora não seja necessário fixá-lo, pode facilitar para pesquisadores inexperientes. Aperte a linha média do abdômen usando pinças. Usando tesouras afiadas, abra o abdômen através da pele e do peritônio sobre a linha média da genitália até a caixa torácica, tomando cuidado para não perfurar o útero.
   1. O útero de camundongo tem dois chifres, cada um contendo de um a cinco embriões. Retire o útero que contém os embriões da mãe e coloque-o imediatamente no gelo.
4. Corte o saco vitelino na lateral das placentas, tomando cuidado para não danificar os embriões, e retire os embriões do saco vitelino.
5. Decapitar imediatamente os embriões. Adicione as cabeças decapitadas em um prato com solução salina balanceada de Hanks (HBSS) sem cálcio (Ca 2+) e magnésio (Mg²⁺) (HBSS-/-) no gelo.
   NOTA: Se a genotipagem for necessária, pode-se remover a cauda nesta fase para análise genética. Quando múltiplos genótipos são esperados, as cabeças de cada embrião devem ser mantidas separadamente para cultivo.
6. Usando pinça angulada, posicione a cabeça de lado voltada para a esquerda.
7. Perfure o olho com uma borda da pinça, segurando firmemente o queixo com a outra.
8. Começando pela nuca, rasgue suavemente a pele do couro cabeludo ao longo da linha média em direção à ponta do focinho.
9. Entrando pela medula espinhal, perceptível como um oval branco, use a pinça angulada para abrir o crânio ao longo da linha média, expondo o cérebro.
10. Descasque suavemente o crânio do lado voltado para cima, expondo o cérebro.
11. Levante o cérebro para fora do crânio, descartando o crânio uma vez que o cérebro foi completamente removido.
12. Usando o fórceps, remova as meninges, que são perceptíveis como uma membrana fina com vasos sanguíneos densos.
13. Coloque os cérebros em um bijou (ver Tabela de Materiais) contendo 2 mL de HBSS-/- no gelo.
14. Repita as etapas 2.6 a 2.13 com os cérebros restantes, somando até quatro cérebros por bijuteria.
15. Adicione 250 μL de tripsina 10x ao bijou e triture os cérebros agitando o bijou. Incubar durante 15 min a 37 °C.
    NOTA: Todos os passos a partir deste ponto devem ser realizados em uma capa de cultura de tecidos estéril.
16. Descongelar 2 mL de inibidor de tripsina (SD) de soja (Leibovitz L-15, 0,52 mg/mL inibidor de tripsina de soja, 40 μg/mL DNase I, 3 mg/mL de albumina de soro bovino [BSA] fração V; ver Tabela de Materiais) de -20 °C, colocando-o a 37 °C.
17. Adicione 2 mL de inibidor de SD a cada bijou contendo cérebros (por bijou contendo até quatro cérebros), agitando o bijou novamente para dispersá-lo uniformemente.
    NOTA: O inibidor SD diminui a atividade da tripsina para evitar a digestão desnecessária das amostras e preservar a viabilidade celular.
18. Sem centrifugação, retirar 2 mL do sobrenadante de cada bijutê e transferir para um tubo centrífugo de 15 mL, tomando cuidado para não transferir aglomerados celulares.
19. Triturar as células restantes no bijuteria com uma agulha de 19 G acoplada a uma seringa de 5 mL aspirando a suspensão duas vezes. Isso criará uma mistura espessa semelhante a muco.
    1. Repita mais duas vezes com uma agulha de 21 G. Se houver aglomerados remanescentes, triture mais uma vez com a agulha de 21 G.
20. Transferir as células do bijuteria para o mesmo tubo de centrífuga de 15 ml (do passo 2.18) utilizando uma agulha de 23 G.
21. Centrifugar a 200 x g à temperatura ambiente (TR) durante 5 min.
22. Remova todo o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 5 mL e transfira-o para outro tubo centrífugo de 15 mL, tomando cuidado para não perturbar a pastilha solta no fundo contendo as células necessárias.
23. Centrifugar novamente o sobrenadante a 200 x g em RT por 5 min.
    NOTA: Esta etapa não é essencial, mas se alguém requer muitas células ou tem poucos embriões, pode-se realizar esta etapa para recuperar o maior número possível de células do sobrenadante.
24. Usando 10 mL de meio de plaqueamento (PM) (49% meio águia modificado de Dulbecco [DMEM], 1% penicilina/estreptomicina [Pen/Strep], 25% de soro de cavalo, 25% HBSS com Ca 2+ e Mg² + [HBSS⁺ /+]; ver Tabela de Materiais), combine e ressuspenda os dois pellets juntos para criar uma suspensão de célula inteira.
25. Contar as células usando azul de tripano e um hemocitômetro ou contador de células digital e diluir a suspensão celular com PM até uma concentração de 1,8 x 10⁶ células/mL.

3. Plaing as células

1. Adicione o volume necessário da suspensão celular ao formato requerido, conforme detalhado na Tabela 1: 1.000 μL por poço no formato de 6 poços, 50 μL por poço no formato de 96 poços ou 100 μL por lamínula.
2. Incubar durante 2-4 h a 37 °C com 5%-7% CO₂. Verifique se as células aderiram usando um microscópio invertido.
3. Retirar o meio e completar com novo meio de diferenciação (DM+: DM- incluindo 10 μg/mL de insulina. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hidrocortisona, 10 ng/mL biotina, 2,5 mL 100x N1 suplemento de mídia; ver Tabela de Materiais). Os volumes estão detalhados na Tabela 1. Pressione qualquer tampa flutuante usando uma ponta de pipeta estéril.

4. Manutenção das culturas

NOTA: Estas culturas requerem alimentação três vezes por semana para suportar o crescimento ideal e diferenciação. As culturas atingirão sanidade e maturidade ótimas para experimentos em DIV (dias in vitro) 21. As células podem ser mantidas em cultura por até 28 dias, após os quais as culturas degeneram rapidamente.

1. Três vezes por semana até DIV12, substituir parte do sobrenadante por DM+ fresco, removendo 500 μL por poço no formato de 6 poços, 50 μL por poço no formato de 96 poços ou 500 μL por prato contendo três lamínulas e adicionando 600 μL por poço no formato de 6 poços, 60 μL por poço no formato de 96 poços, ou 600 μL por placa de cobertura (Tabela 1).
2. Três vezes por semana, a partir da DIV13, substituir parte do sobrenadante por DM- fresco, removendo 500 μL por poço no formato de 6 poços, 50 μL por poço no formato de 96 poços ou 500 μL por prato contendo três lamínulas e adicionando 600 μL por poço no formato de 6 poços, 60 μL por poço no formato de 96 poços, ou 600 μL por placa de cobertura (Tabela 1).

Resultados

Microscopia
Culturas cultivadas em lamínulas de vidro são ideais para análise por microscopia. Para visualizar o desenvolvimento das culturas, as lamínulas foram fixadas em paraformaldeído (PFA) a 4% em múltiplos momentos, desde a DIV0 (uma vez que as células foram fixadas) até a DIV28. As culturas foram coradas para imagem de imunofluorescência, conforme previamente^descrito5 , utilizando três diferentes combinações de colorações: NG2 (oligodendrócitos imaturos) ...

Discussão

O SNC é uma rede complexa que se estende do cérebro até a medula espinhal e consiste de vários tipos celulares, predominantemente neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia¹. Como cada célula tem um papel importante na manutenção da homeostase e na geração de respostas adequadas aos desafios no SNC 9,10,11^, um sistema de cultura que contenha todos esses tipos celulares é uma ferramenta útil e versátil pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor