JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول سير عمل سهل المتابعة لإجراء تنقية الحمض النووي الريبي poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة باستخدام معدات موحدة لعينة بيولوجية ذات أهمية.

Abstract

ترتبط تعديلات ما بعد النسخ للحمض النووي الريبي في أنواع مختلفة من نسخ الحمض النووي الريبي بتنظيم الحمض النووي الريبي المتنوع في الخلايا حقيقية النواة. وقد تبين أن تعديلات الحمض النووي الريبي الشاذ 5-ميثيل سيتوزين والتعبير غير المنظم لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي مرتبطة بأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطانات. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول ثنائي الكبريتيت عند دقة زوج القاعدة. هنا ، يعرض هذا البروتوكول إجراءات جولتين من تنقية poly (A) RNA ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة بالتفصيل للسماح برسم خرائط على مستوى النسخ لمواقع تعديل mRNA 5-methylcytosine. يعد تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي بعد التفاعل الرئيسي أمرا ضروريا لمراقبة سلامة الحمض النووي الريبي وهو خطوة حاسمة لضمان مكتبات تسلسل عالية الجودة. من الناحية المثالية ، يمكن إكمال الإجراءات في غضون ثلاثة أيام. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن أن يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة كمدخل عمليا إلى بناء مكتبات ثنائية الكبريتيت-mRNA قوية لتسلسل الجيل التالي من عينة الاهتمام.

Introduction

من بين أكثر من 150 نوعا من تعديلات ما بعد النسخ1 ، تم تحديد تعديل 5-methylcytosine (m5C) في أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي ، والحمض النووي الريبي المنقول ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الصغير ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبي القبو ، والحمض النووي الريبي المحسن ، والحمض النووي الريبي الصغير الخاص بالجسم2. يرتبط الحمض النووي الريبي m 5 C بآليات بيولوجية ومرضية متنوعة مثل تنظيم نمو جذر النبات3 ، والتعبير الجيني الفيروسي4 ، وتطور السرطان5. الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خطوط أنابيب مبسطة لتوصيف ملف تعديل mRNA m5C على نطاق النسخ للعينات البيولوجية في مراحل النمو المختلفة أو في بيئة المرض. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول للكبريتيت عند دقة زوج القاعدة6،7،8،9. هذا مفيد بشكل خاص عند دراسة ارتباط m5C بالتعبير الجيني ومصير الحمض النووي الريبي الذي يشارك في الآليات التنظيمية البيولوجية في الخلايا. في خلية الثدييات ، هناك نوعان معروفان من قارئي m 5 C: يمكن ل ALYREF التعرف على m 5 C في النواة ويعمل كناقل mRNA من نواة إلى سيتوسول10 ، بينما يمكن ل YBX1 التعرف على m5C في السيتوبلازم وزيادة استقرار mRNA11. تم الإبلاغ عن انحراف m5C mRNAs المتعلقة بالمسارات المناعية في خلايا الذئبة الحمامية الجهازية CD4 + T12. كشفت الدراسات عن وجود علاقة بين تعديل mRNA m5C وتعديل مناعة السرطان وتطور السرطان13,14. ومن ثم، فإن رسم خريطة ملف تعريف تعديل m5C على mRNA يمكن أن يوفر معلومات حاسمة لتوضيح الآلية التنظيمية المحتملة.

للتحقيق في الأدوار الوظيفية لتعديل الحمض النوويالريبي m 5 C في ظل ظروف بيولوجية معينة ، يمكن دمج النهج القائمة على تحويل ثنائي الكبريتيت (bsRNA-seq) والنهج القائمة على إثراء تقارب الأجسام المضادة مثل m 5 C-RIP-seq و miCLIP-seq و 5-Aza-seq مع منصة التسلسل عالية الإنتاجية لتوفير الكشف الفعال عن المناطق والتسلسلات المستهدفة مع تعديلات m5C على مقياس واسع للنسخ15 ، 16. توفر ميزة هذا البروتوكول المشهد الشامل للحمض النووي الريبيm 5 C بدقة قاعدة واحدة لأن النهج القائم على إثراء تقارب الأجسام المضادة يعتمد على توافر أجسام مضادة عالية الجودة ويمكن أن يحقق دقة الجزء الواحد من مشهد مثيلة m5C17.

ستتم معالجة جميع عينات الحمض النووي الريبي بجولتين من إثراء mRNA باستخدام حبات oligo (dT) ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد مكتبة التسلسل. لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي ، سيتم فحص كل عينة من الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري قبل وبعد إجراءات تنقية mRNA وتفاعل ثنائي الكبريتيت لتقييم توزيع الشظايا. سيتم فحص المكتبات المنقاة من خلال صفات amplicon PCR الخاصة بها ، وشظايا توزيع حجم الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري ، وفحص كمياتها الإجمالية بواسطة المقايسات الكمية القائمة على الأصباغ الفلورية قبل التسلسل. يمكن أيضا استخدام النظام لتحليل مجموعة واسعة من العينات البيولوجية مثل المنتجات الزراعية ، والفيروسات المعزولة ، وخطوط الخلايا ، والكائنات الحية النموذجية ، والعينات المرضية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. بولي (أ) تنقية الحمض النووي الريبي

ملاحظة: استخدم إجمالي الحمض النووي الريبي المعالج ب DNase I وافحص جودة وسلامة الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق تقييم الرحلان الكهربائي للهلام الشعري أو التقليدي قبل الشروع في تنقية poly (A) RNA. يجب أن يكون الباحثون قادرين على تحديد نطاقات الريبوسوم 28S و 18S rRNA في مجال الوزن الجزيئي العالي ونطاق 5.8S rRNA في مجال الوزن الجزيئي المنخفض دون أي نطاقات مسحة كبيرة في مخطط كهربي. تتبع خطوات التنقية بشكل أساسي تعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة موضحة في الخطوات المحددة. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. اعداد
    1. قم بتسخين الكاشف ، ومخزن الغسيل ، وحبات oligo (dT) ، ومخزن التحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل إجراء الإجراءات التالية.
    2. لعزل الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (أ) ، قم بإعداد 10-20 ميكروغرام من حصصة من إجمالي الحمض النووي الريبي عالي الجودة كمادة أولية عن طريق نقل كمية كافية من الحمض النووي الريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النيوكلياز سعة 1.5 مل. احتضان في كتلة الحرارة على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم احتفظ بها على الجليد لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: يجب ضبط كميات إجمالي الحمض النووي الريبي كمادة أولية بشكل مناسب اعتمادا على الكمية المطلوبة من mRNA وطبيعة الخلايا المستخدمة. من الناحية التجريبية ، قد يمثل الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (أ) وفرة بنسبة 1-5٪ في إجمالي الحمض النووي الريبي. يجب أن توفر حصة 10 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي عالي الجودة ، الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (A) عالي الجودة في نطاق 100-500 نانوغرام لتحويل ثنائي الكبريتيت في المصب.
    3. وفي الوقت نفسه ، أعد تعليق حبات oligo (dT) بالكامل. انقل الكميات المطلوبة من تعليق الخرز إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل ، ثم ضعه على المغناطيس لمدة 3 دقائق حتى تشكل الخرزات المغناطيسية حبيبة.
      ملاحظة: استخدم 50 ميكرولتر من حبات oligo (dT) ل 10 ميكروغرام من إجمالي مدخلات الحمض النووي الريبي. يمكن تحسين حجم الخرز في هذه الخطوة اعتمادا على الخلايا المستخدمة.
    4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبات oligo (dT) بكميات متساوية (حجم تعليق الخرز المستخدم في الخطوة 1.1.3.) من محلول التحلل وضعه على المغناطيس لمدة 3 دقائق قبل إزالة المادة الطافية.
      ملاحظة: لا تبالغ في الخرز. يجب على المستخدم المتابعة بسرعة إلى الخطوة 1.2.1.
  2. الجولة الأولى من التطهير
    1. أضف محلول التحلل إلى أنبوب عينة الحمض النووي الريبي (نسبة الحجم 4: 1) واخلطه جيدا قبل نقله إلى حبات oligo (dT).
      ملاحظة: إذا كان حجم عينة الحمض النووي الريبي 20 ميكرولتر ، فقم بإضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل.
    2. أعد تعليق الحمض النووي الريبي: مزيج المخزن المؤقت للتحلل والخرز oligo (dT) بالكامل عن طريق سحب 10x على الأقل.
    3. اسمح للعينات بالاحتضان بالتناوب المستمر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. ضع العينة على المغناطيس لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح العنصر المتطافي صافيا ؛ تخلص من المادة الطافية.
    5. أضف 600 ميكرولتر من Wash Buffer 1 إلى الخرز واخلطه بعناية لإعادة تعليق الخرز.
    6. ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح الطافاح واضحا ، وتخلص من المادة الطافية ، وكرر خطوة الغسيل 1.2.5 مرة واحدة.
    7. اغسل الخرز بإضافة 300 ميكرولتر من Wash Buffer 2 ، وأعد تعليق الخرز برفق.
    8. ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح الطافاح صافيا ، وتخلص من المادة الطافية ، وكرر خطوة الغسيل 1.2.7 مرة واحدة.
    9. أضف 30 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl البارد (محلول الشطف) إلى أنبوب العينة واحتضانه عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    10. انقل الأنبوب بسرعة إلى المغناطيس ، وعندما يكون التعليق واضحا بعد 20 ثانية أو أكثر ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (أ) إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد سعة 1.5 مل.
  3. الجولة الثانية من التطهير
    1. أضف 120 ميكرولتر (4 أضعاف حجم العينة المستخلصة) محلول تحلل إلى عينة الحمض النووي الريبي المشحونة واخلطها جيدا.
    2. اغسل الخرزات المستخدمة في الجولة الأولى من التنقية بكمية متساوية من محلول التحلل مثل الخطوة 1.1.4 ، وسحب 10 مرات لإعادة تعليق الخرز ، ثم ضعها على المغناطيس لمدة 5 دقائق قبل التخلص من المادة الطافية.
    3. انقل الحمض النووي الريبي: امزج المحلول المؤقت للتحلل إلى الخرزات المغسولة واخلطه جيدا عن طريق سحب 10 مرات على الأقل.
    4. احتضان العينة بدوران مستمر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. كرر الخطوات من 1.2.4 إلى 1.2.8 لإزالة الملح والأنواع الفرعية الأخرى من الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: يمكن تقليل حجم المخزن المؤقت للغسيل إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل 1 و 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل 2.
    6. أضف 25 ميكرولتر (الحجم المطلوب) من 10 مللي متر بارد Tris-HCl (محلول الشطف) إلى أنبوب العينة واحتضانه عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    7. انقل الأنبوب بسرعة إلى المغناطيس ، وعندما يكون التعليق واضحا بعد 20 ثانية أو أكثر ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المخصب بالبولي (أ) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
    8. نقل أنابيب 2.2 ميكرولتر إلى 8 شرائط لتقييم جودة كمية وجودة الحمض النووي الريبي باستخدام مقايسات الحمض النووي الريبي عالية الحساسية.
    9. قم بتخزين العينة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترات قصيرة و-70 درجة مئوية لفترة أطول.
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه نقطة توقف مؤقت في البروتوكول.

2. تحويل ثنائي الكبريتيت

ملاحظة: تم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. يتم تنفيذ الإجراءات بشكل أساسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ولكن مع خطوة إضافية 2.2 لإضافة تسلسل (تسلسلات) mRNA للتحكم في الارتفاع قبل خطوة تفاعل ثنائي الكبريتيت 2.3.

  1. نقل 19 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي المنقى بولي (A) إلى أنبوب 0.2 مل 8 شريط.
  2. أضف 1.0 ميكرولتر من التحكم في الارتفاع ، وهو خال من أي تعديلات عند نسبة الكمية المحددة مسبقا 1: 10,000 (أي 0.1 نانوغرام من luciferase mRNA: 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المنقى (A) المخصب) إلى عينة الحمض النووي الريبي من الخطوة 2.1.
    ملاحظة: يمكن أن يكون تسلسل التحكم في الارتفاع هو Firefly luciferase RNA أو Renilla luciferase أو تسلسل الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر بدون سيتوزينات ميثيلية.
  3. أضف 130 ميكرولتر من ريجنت التحويل إلى الأنبوب واقلبه برفق عدة مرات للخلط الشامل.
  4. ضع الأنبوب في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل وقم بإجراء ثلاث دورات من التسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها الحضانة عند 64 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لكل منها ثم خطوة أخيرة لتبرد إلى 4 درجات مئوية.
  5. ضع العمود على أنبوب التجميع وانقل 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي إلى العمود.
  6. انقل العينة من الخطوة 2.4 إلى العمود من الخطوة 2.5 وسحب جيدا.
  7. أضف 400 ميكرولتر من 95-100٪ من الإيثانول إلى العمود ، وأغلق الغطاء بسرعة ، واقلب عدة مرات.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية عند 25 درجة مئوية وتجاهل التدفق.
  9. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الحمض النووي الريبي إلى العمود.
  10. أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية عند 25 درجة مئوية وتجاهل التدفق.
  11. أضف 200 ميكرولتر من محلول إزالة الكبريت واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  12. أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية عند 25 درجة مئوية وتجاهل التدفق.
  13. أضف 400 ميكرولتر من محلول غسيل الحمض النووي الريبي وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية عند 25 درجة مئوية وتخلص من التدفق. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  14. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 10000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية لإزالة المخزن المؤقت للغسيل المتبقي تماما.
    ملاحظة: خطوة الطرد المركزي الأخرى 2.14 لمدة دقيقتين قبل الشطف هي إزالة المخزن المؤقت للغسيل تماما. يتم تنفيذ خطوة الغسيل مرتين لغسل المكون عالي الملح من كاشف ثنائي الكبريتيت ومخزن إزالة الكبريت على العمود.
  15. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
  16. أضف 20-30 ميكرولتر من H2O الخالي من النيوكلياز إلى العمود والوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
  17. أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية عند 25 درجة مئوية.
  18. نقل 2.2 ميكرولتر إلى أنابيب 8 شرائط لتقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي.
  19. قم بتخزين عينة الحمض النووي الريبي المعالج بثنائي الكبريتيت عند -20 درجة مئوية لفترات قصيرة و -70 درجة مئوية لفترة أطول.
    ملاحظة: يمكن أن تكون هذه نقطة توقف مؤقت في البروتوكول.

3. إعداد مكتبة mRNA المعالج بالكبريتيت

ملاحظة: اتبع القسم 4 من بروتوكول تعليمات إعداد المكتبة للاستخدام مع mRNA المنقى أو الحمض النووي الريبي المستنفد rRNA. يجب أن تتبع خطوة التحضير الأولى بروتوكول FFPE RNA لأن معالجة ثنائي الكبريتيت تجزئ الحمض النووي الريبي. قم بإجراء كل خطوة في غطاء التدفق الصفحي وأضف خليط التفاعل على رف تبريد مبرد بالجليد.

  1. فتيلة الحمض النووي الريبي المدخلات
    1. انقل الكمية المطلوبة من عينة mRNA المعالجة بثنائي الكبريتيت بحد أقصى إجمالي 5 ميكرولتر أو أضف H2O الخالي من النيوكلياز ليصبح المجموع 5 ميكرولتر.
      ملاحظة: يوصى باستخدام ما لا يقل عن 10 نانوغرام من mRNA المعالج بثنائي الكبريتيت كمدخلات لهذا النوع من تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي ولتوليد المولارية النهائية لمنتج مكتبة 4 نانومتر.
    2. أضف 1 ميكرولتر من التمهيدي العشوائي (أرجواني) إلى العينة واخلطها عن طريق الماصة.
    3. ضع أنبوب العينة في جهاز PCR المضبوط مسبقا على 65 درجة مئوية والغطاء عند 105 درجة مئوية لمدة 5 دقائق واستمر عند 4 درجات مئوية.
  2. تخليق cDNA من الشريط الأول
    1. أضف 4 ميكرولتر من محلول تفاعل التوليف (أرجواني) ، و 8 ميكرولتر من كاشف خصوصية الشريط (بني) ، و 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم التوليف (بني) إلى العينة ، مما يجعل الحجم الإجمالي 20 ميكرولتر. تخلط جيدا عن طريق سحب 10x على الأقل وتدور بسرعة.
    2. ضع أنبوب العينة في جهاز PCR المحدد مسبقا عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، و 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، واستمر عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بالنسبة للإدخالات التي تزيد عن 200 قاعدة ، يقترح فترة حضانة 42 درجة مئوية مدتها 50 دقيقة ؛ لإدراج حجم أقل من 200 قاعدة ، يقترح فترة حضانة 42 درجة مئوية مدتها 15 دقيقة.
  3. تخليق cDNA من الشريط الثاني
    1. أضف 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل التوليف مع مزيج dUTP (برتقالي) ، و 4 ميكرولتر من مزيج إنزيم التوليف (برتقالي) ، و 48 ميكرولتر من H2O. امزج جيدا عن طريق سحب 10x على الأقل وتدويره بسرعة.
    2. ضع أنبوب العينة في جهاز PCR المضبوط مسبقا على 16 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع ضبط الغطاء أو ≤40 درجة مئوية.
  4. تنقية cDNA مزدوجة تقطعت بهم السبل مع حبات تنقية الحمض النووي
    1. قم بتسخين حبات تنقية الحمض النووي قبل 30 دقيقة من إجراء التنقية والدوامة لإعادة تعليق الخرزات.
    2. أضف 144 ميكرولتر من حبات تنقية الحمض النووي المعاد تعليقها إلى عينة cDNA من الخطوة 3.3.2 واخلطها جيدا عن طريق سحب 10 أضعاف على الأقل.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. ضع أنبوب العينة على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق حتى يصبح المحلول صافيا ثم قم بإزالة المادة الطافية واحتفظ بالخرز الذي يحتوي على الحمض النووي.
    5. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ إلى الأنبوب مع الخرزات مع الاحتفاظ بالعينة على الرف المغناطيسي واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الخطوة 3.4.5 مرة واحدة ، ولكن هذه المرة قم بإزالة كل المادة الطافية المتبقية بعناية.
    7. جفف الخرز في الهواء لمدة 1-5 دقائق مع الاحتفاظ بالعينة على المغناطيس.
      ملاحظة: لا تبالغ في الخرز. يجب أن يكون اللون بني غامق.
    8. قم بإزالة العينة من الحامل المغناطيسي وقم بإزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 53 ميكرولتر من 0.1x TE (10 mM Tris-HCl و 1 mM EDTA ، pH 8.0) إلى الخرزات. تخلط جيدا عن طريق سحب ما لا يقل عن 10x واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    9. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح المحلول واضحا.
    10. انقل 50 ميكرولتر من المادة الطافية التي تحتوي على cDNA مزدوج الشريط إلى أنبوب جديد مكون من 8 أشرطة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة ويمكن تخزين العينة عند -30 درجة مئوية.
  5. نهاية إعداد مكتبة cDNA
    1. أضف 7 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل التلميع النهائي (أخضر) و 3 ميكرولتر من مزيج إنزيم التلميع النهائي (أخضر) إلى عينة cDNA مزدوجة الشريط المستحثة.
    2. امزج الخليط عن طريق سحب 10 أضعاف مع إعداد حجم 50 ميكرولتر دون إنشاء فقاعات ، ثم قم بتدوير العينة بسرعة.
    3. ضع العينة في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل واحتضانها على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، و 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وامسكها عند 4 درجات مئوية.
  6. ربط المحول
    1. قم بتخفيف المحول (الأحمر) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. أضف 2.5 ميكرولتر من المحول المخفف ، و 1 ميكرولتر من محسن الربط (أحمر) ، و 30 ميكرولتر من Ligation Master Mix (أحمر) إلى العينة.
    3. امزج الخليط عن طريق سحب 10 أضعاف مع إعداد حجم 80 ميكرولتر دون إنشاء فقاعات ، ثم قم بتدوير العينة بسرعة.
    4. ضع العينة في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل واحتضانها على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. أضف 3 ميكرولتر من خليط يوراسيل DNA glycosylase و DNA glycosylase-lyase endonuclease VIII (أزرق) إلى العينة وماصة جيدا.
    6. ضع العينة مرة أخرى في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع ضبط الغطاء على 75 درجة مئوية.
  7. تنقية تفاعل الربط تعامل cDNAs
    ملاحظة: يمكن استخدام اختيار الحجم مع حبات SPRIselect ، أو اختياريا مع حبات AMpure XP لهذا الغرض18.
    1. سخن الخرزات قبل 30 دقيقة من إجراء التنقية والدوامة لإعادة تعليقها.
    2. انقل 25 ميكرولتر من الخرز المعاد تعليقه إلى عينة cDNA من الخطوة 3.6.6 واخلطها جيدا عن طريق سحب 10 أضعاف على الأقل.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. ضع أنبوب العينة على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد مكون من 8 شرائط وتخلص من الخرزات.
    5. أضف 10 ميكرولتر من الخرز المعاد تعليقه إلى المادة الطافية واخلطها جيدا عن طريق سحب 10 أضعاف على الأقل.
    6. ضع أنبوب العينة على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا ثم تخلص من المادة الطافية ولا تزعج الخرز.
    7. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ إلى الأنبوب مع الخرزات مع الاحتفاظ بالعينة على الرف المغناطيسي واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.
    8. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الخطوة 3.7.7 مرة واحدة ، ولكن هذه المرة قم بإزالة كل المواد الطافية المتبقية بعناية.
    9. جفف الخرزات في الهواء لمدة 1-5 دقائق مع الاحتفاظ بالعينة على المغناطيس.
      ملاحظة: لا تبالغ في الخرز. يجب أن يكون اللون بني غامق.
    10. قم بإزالة العينة من الحامل المغناطيسي وقم بإزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 17 ميكرولتر من المخزن المؤقت 0.1x TE إلى الخرزات. تخلط جيدا عن طريق سحب ما لا يقل عن 10x واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    11. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا.
    12. انقل 15 ميكرولتر من المادة الطافية ، والتي تحتوي على dsDNA المستهدف المعد نهائيا إلى أنبوب جديد مكون من 8 أشرطة.
  8. إثراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي المرتبط بالمحول
    1. أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي (الأزرق) ، و 5 ميكرولتر من التمهيدي للمحول 5 بوصات ، و 5 ميكرولتر من التمهيدي للمحول 3 بوصات إلى عينة الحمض النووي المرتبطة بالمحول. تخلط جيدا عن طريق سحب 10 مرات على الأقل.
    2. ضع العينة في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل وقم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الخطوات التالية: (1) 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (2) 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، (3) 65 درجة مئوية لمدة 75 ثانية ، (4) 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و (5) عقد عند 4 درجات مئوية ؛ حيث يجب تكرار الخطوتين (2) و (3) لرقم دورة N + 2 حيث N يساوي كمية إدخال الحمض النووي الريبي في دليل التعليمات. هذا يعني أن هناك حاجة إلى دورتين إضافيتين بسبب اختيار حجم مزدوج الجانب للعينات التي تم إجراؤها في الخطوة 3.7.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يوصى ب 8 نانوغرام من مدخلات mRNA المنقى مع 9-10 دورات من تفاعل البوليميراز المتسلسل؛ ولكن مع cDNA مزدوج الجانب ، محدد الحجم ، مرتبط في الخطوة 3.7 ، ستكون دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الموصى بها 11-12 دورة.
  9. تنقية المكتبات المضخمة PCR
    1. سخن حبات تنقية الحمض النووي لمدة 30 دقيقة قبل إجراء التنقية والدوامة لإعادة تعليق الخرزات.
    2. انقل 45 ميكرولتر (0.9x) من الخرز المعاد تعليقه إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من الخطوة 3.8.2 واخلطه جيدا عن طريق سحب 10 أضعاف على الأقل.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. ضع أنبوب العينة على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق حتى يصبح المحلول صافيا ثم قم بإزالة المادة الطافية واحتفظ بالخرز الذي يحتوي على الحمض النووي.
    5. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ إلى الأنبوب مع الخرز ، واترك العينة على الرف المغناطيسي واتركها تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الخطوة 3.9.5 مرة واحدة ، ولكن هذه المرة قم بإزالة كل المواد الطافية المتبقية بعناية.
    7. جفف الخرزات في الهواء لمدة 1-5 دقائق مع الاحتفاظ بالعينة على المغناطيس.
      ملاحظة: لا تبالغ في الخرز. يجب أن يكون اللون بني غامق.
    8. أخرج العينة من الرف المغناطيسي وأضف 22 ميكرولتر من المخزن المؤقت 0.1x TE إلى الخرزات لإزالة الحمض النووي. تخلط جيدا عن طريق سحب ما لا يقل عن 10x واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    9. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي واتركه يقف لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح المحلول صافيا في درجة حرارة الغرفة.
    10. انقل 20 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد مكون من 8 أشرطة.
    11. نقل 2.2 ميكرولتر إلى أنابيب 8 شرائط لتقييم جودة كمية المكتبة وجودتها.
      ملاحظة: يمكن أيضا اكتشاف كمية المكتبة بواسطة qPCR (انظر جدول المواد).
    12. قم بتخزين عينة مكتبة bsRNA-seq عند -20 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم إنشاء سلسلة من مكتبات bsRNA-seq من خطوط الخلية19 باتباع الإجراءات الواردة في هذا التقرير (الشكل 1). بعد تنقية الحمض النووي الريبي الكلي مصحوبة بمعالجة DNase التي يتم إجراؤها على عينات خط الخلية وفحص الجودة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي وقياس الطيف الضو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول ، تم تحقيق خط أنابيب مفصل لإثراء poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة من خلال استخدام مكونات موحدة. قدم تحليل التسلسل الإضافي تحديد mRNA 5-methylcytosine في العينات ذات الأهمية.

الخطوة الحاسمة هي جودة بدء المواد - إجمالي الحمض النووي الريبي - لأن تدهور الحم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer SystemAgilent, Santa Clara, CARNA quality detection
AMpure XP beadsBeckman CoulterA63881purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kitAgilent, Santa Clara, CA5067-4626DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kitAgilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rackDiagenode, Denville, NJB04000001assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rackDiagenode, Denville, NJB04000003assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kitThermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
EthanolJ.T.Baker64-17-5
EZ RNA methylation kitZymo, Irvine, CAR5002bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNAPromega, Madison, WI, USAL4561spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification KitsRoche, SwitzerlandKK4824library quantification
Nanodrop spectrophotometerThermo Fisher Scientific, Waltham, MATotal RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)New England Biolabs, Ipswich, MAE7335Slibrary preparation
NEBNext Ultra figure-materials-1690 Directional RNA Library Prep Kit for IlluminaNew England Biolabs, Ipswich, MAE7760Slibrary preparation
Nuclease-free WaterThermo Fisher ScientificAM9932
P2 pipetmanThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Qubit 2.0 fluorometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MARNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852RNA quantity detection

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102(2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1(2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40(2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606(2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MRNA Bisulfite mRNA RNA RNA 5 methylcytosine RNA Methyltransferases Poly A MRNA 5 methylcytosine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved