إثراء مكتبة mRNA و Bisulfite-mRNA للجيل التالي من التسلسل

Summary

يوفر هذا البروتوكول سير عمل سهل المتابعة لإجراء تنقية الحمض النووي الريبي poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة باستخدام معدات موحدة لعينة بيولوجية ذات أهمية.

Abstract

ترتبط تعديلات ما بعد النسخ للحمض النووي الريبي في أنواع مختلفة من نسخ الحمض النووي الريبي بتنظيم الحمض النووي الريبي المتنوع في الخلايا حقيقية النواة. وقد تبين أن تعديلات الحمض النووي الريبي الشاذ 5-ميثيل سيتوزين والتعبير غير المنظم لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي مرتبطة بأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطانات. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول ثنائي الكبريتيت عند دقة زوج القاعدة. هنا ، يعرض هذا البروتوكول إجراءات جولتين من تنقية poly (A) RNA ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة بالتفصيل للسماح برسم خرائط على مستوى النسخ لمواقع تعديل mRNA 5-methylcytosine. يعد تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي بعد التفاعل الرئيسي أمرا ضروريا لمراقبة سلامة الحمض النووي الريبي وهو خطوة حاسمة لضمان مكتبات تسلسل عالية الجودة. من الناحية المثالية ، يمكن إكمال الإجراءات في غضون ثلاثة أيام. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن أن يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة كمدخل عمليا إلى بناء مكتبات ثنائية الكبريتيت-mRNA قوية لتسلسل الجيل التالي من عينة الاهتمام.

Introduction

من بين أكثر من 150 نوعا من تعديلات ما بعد النسخ¹ ، تم تحديد تعديل 5-methylcytosine (m⁵C) في أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي ، والحمض النووي الريبي المنقول ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الصغير ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبي القبو ، والحمض النووي الريبي المحسن ، والحمض النووي الريبي الصغير الخاص بالجسم². يرتبط الحمض النووي الريبي m 5 C بآليات بيولوجية ومرضية متنوعة مثل تنظيم نمو جذر النبات³ ، والتعبير الجيني الفيروسي⁴ ، وتطور السرطان⁵.<....

Protocol

1. بولي (أ) تنقية الحمض النووي الريبي

ملاحظة: استخدم إجمالي الحمض النووي الريبي المعالج ب DNase I وافحص جودة وسلامة الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق تقييم الرحلان الكهربائي للهلام الشعري أو التقليدي قبل الشروع في تنقية poly (A) RNA. يجب أن يكون الباحثون قادرين على تحديد نطاقات الريبوسوم 28S و 18S rRNA في مجال الوزن الجزيئي العالي ونطاق 5.8S rRNA في مجال الوزن الجزيئي المنخفض دون أي نطاقات مسحة كبيرة في مخطط كهربي. تتبع خطوات التنقية بشكل أساسي تعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة موضحة في الخطوات المحددة. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

....

النتائج

تم إنشاء سلسلة من مكتبات bsRNA-seq من خطوط الخلية¹⁹ باتباع الإجراءات الواردة في هذا التقرير (الشكل 1). بعد تنقية الحمض النووي الريبي الكلي مصحوبة بمعالجة DNase التي يتم إجراؤها على عينات خط الخلية وفحص الجودة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي وقياس الطيف الضو.......

Discussion

في هذا البروتوكول ، تم تحقيق خط أنابيب مفصل لإثراء poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة من خلال استخدام مكونات موحدة. قدم تحليل التسلسل الإضافي تحديد mRNA 5-methylcytosine في العينات ذات الأهمية.

الخطوة الحاسمة هي جودة بدء المواد - إجمالي الحمض النووي الريبي - لأن تدهور الحم.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection