Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.

Abstract

שינויים לאחר שעתוק RNA בסוגים שונים של תעתיקי RNA קשורים לוויסות RNA מגוון בתאים איקריוטים. שינויים חריגים ב-RNA 5-methylcytosine והביטוי הלא מווסת של RNA methyltransferases הוכחו כקשורים למחלות שונות, כולל סרטן. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כדי לאפיין את המיקומים ואת רמות המתילציה הכמותית של ציטוזין ב-RNA המומר על ידי ביסולפיט ברזולוציית זוג הבסיס. בזאת, פרוטוקול זה מציג את ההליכים של שני סבבים של טיהור RNA פולי(A), שלושה מחזורים של תגובת ביסולפיט, והכנת ספרייה בפירוט כדי לאפשר מיפוי רחב שעתוק של אתרי שינוי mRNA 5-methylcytosine. הערכת כמות ואיכות ה-RNA לאחר התגובה העיקרית חיונית לניטור שלמות ה-RNA והיא צעד קריטי להבטחת ספריות ריצוף באיכות גבוהה. באופן אידיאלי, ניתן להשלים את ההליכים תוך שלושה ימים. באמצעות פרוטוקול זה, שימוש ב-RNA כולל באיכות גבוהה כקלט יכול למעשה לבנות ספריות ביסולפיט-mRNA חזקות לריצוף הדור הבא מהמדגם המעניין.

Introduction

בין למעלה מ-150 סוגים של שינויים שלאחר שעתוק1, זוהה שינוי 5-מתיל-ציטוזין (m5C) בסוגים שונים של RNA, כולל RNA ריבוזומלי, RNA העברה, רנ"א שליח, מיקרו-רנ"א, רנ"א ארוך שאינו מקודד, רנ"א קמרון, רנ"א משפר, ורנ"א קחאל קטן ספציפי לגוף2. הרנ"א m 5 C קשור למגוון מנגנונים ביולוגיים ופתולוגיים כגון ויסות התפתחות שורשי צמחים3, ביטוי גנים נגיפיים4 והתקדמות סרטן5. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צינורות יעילים לאפיון פרופיל השינוי רחב התמלול mRNA m5C של דגימות ביולוגיות בשלבי התפתחות שונים או במסגרת המחלה. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כדי לאפיין את המיקומים ואת רמות המתילציה הכמותית של ציטוזין ב-RNA המומר על ידי ביסולפיט ברזולוציית זוג בסיס 6,7,8,9. זה שימושי במיוחד כאשר חוקרים את הקשר של m5C עם ביטוי גנים וגורל RNA המעורב במנגנוני הבקרה הביולוגיים בתאים. בתא היונקים ידועים שני קוראי m 5 C: ALYREF יכול לזהות m 5 C בגרעין ומשמש כטרנספורטר mRNA גרעין לציטוזול10, בעוד YBX1 יכול לזהות m5C בציטופלסמה ולהגביר את ייצובmRNA11. mRNA חריג m5C הקשור למסלולים חיסוניים דווח בתאי T אדמנתית אדמנתית CD4+12. מחקרים גילו קשר בין mRNA m5C שינוי ומודולציה של חסינות לסרטן והתקדמות סרטן13,14. לפיכך, מיפוי פרופיל השינוי m5C על mRNA יכול לספק מידע חיוני כדי להבהיר את מנגנון הרגולציה הפוטנציאלי.

כדי לחקור את התפקידים הפונקציונליים של שינויRNA m 5 C בתנאים ביולוגיים מסוימים, ניתן לשלב גישות מבוססות המרה ביסולפיט (bsRNA-seq) והעשרת זיקה לנוגדנים כגון m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq ו- 5-Aza-seq עם פלטפורמת הריצוף בתפוקה גבוהה כדי לספק זיהוי יעיל של אזורים ורצפים ממוקדים עם שינויי m5C בקנה מידה רחב של תעתיק15, 16. היתרון של פרוטוקול זה מספק את הנוף המקיף של RNAm 5 C ברזולוציה של בסיס יחיד, שכן הגישה מבוססת העשרת זיקה לנוגדנים מסתמכת על זמינותם של נוגדנים באיכות גבוהה ויכולה להשיג את הרזולוציה של מקטע יחיד של m5C methylation landscape17.

כל דגימות הרנ"א יעובדו בשני סבבים של העשרת mRNA באמצעות חרוזי אוליגו (dT), שלושה מחזורים של תגובת ביסולפיט והכנת ספריית הריצוף. כדי לפקח על איכות הרנ"א, כל דגימת RNA תיבדק על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נימי לפני ואחרי הליכי טיהור mRNA ותגובה ביסולפיטית כדי להעריך את התפלגות המקטעים. הספריות המטוהרות ייבדקו על ידי תכונות אמפליקון ה-PCR שלהן, מקטעי פיזור גודל DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נימי, והכמויות הכוללות שלהן ייבדקו על ידי בדיקות כמותיות מבוססות צבעים פלואורסצנטיים לפני ריצוף. המערכת יכולה לשמש גם לניתוח ספקטרום רחב של דגימות ביולוגיות כגון תוצרת חקלאית, נגיפים מבודדים, קווי תאים, אורגניזמים לדוגמה ודגימות פתולוגיות.

Protocol

1. טיהור RNA פולי(A)

הערה: השתמש ב-RNA הכולל שטופל ב-DNase I ובחן את האיכות והשלמות הכוללת של ה-RNA על ידי הערכת אלקטרופורזה של נימים או ג'ל קונבנציונלי לפני שתמשיך לטיהור RNA פולי(A). החוקרים אמורים להיות מסוגלים לזהות את הפסים הריבוזומליים rRNA 28S ו-18S בשדה המשקל המולקולרי הגבוה ואת רצועת ה-rRNA 5.8S בשדה המשקל המולקולרי הנמוך ללא פסי מריחה משמעותיים באלקטרופרוגרמה. שלבי הטיהור למעשה עוקבים אחר הוראות היצרן עם שינויים קלים המצוינים בשלבים הספציפיים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. הכנה
    1. חממו את המגיב, חיץ הכביסה, חרוזי אוליגו (dT) וחיץ הליזיס בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני ביצוע ההליכים הבאים.
    2. לבידוד RNA מועשר בפולי(A), הכינו 10-20 מיקרוגרם של אליקוט של רנ"א כולל באיכות גבוהה כחומר המוצא על ידי העברת כמות נאותה של RNA לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל נטול נוקלאז. לדגור בבלוק החום ב 70 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשמור על קרח במשך 2 דקות.
      הערה: יש להתאים את כמויות הרנ"א הכולל כחומר המוצא בהתאם לכמות הרצויה של mRNA ולאופי התאים המשמשים. מבחינה אמפירית, הרנ"א המועשר בפולי(A) עשוי להוות 1-5% שפע בסך הרנ"א. אליציטוט של 10 מיקרוגרם של RNA כולל באיכות גבוהה, אמור לספק RNA מועשר בפולי(A) באיכות גבוהה בטווח של 100-500 ננוגרם להמרת ביסולפיט במורד הזרם.
    3. בינתיים, השהה מחדש לחלוטין את חרוזי האוליגו (dT). מעבירים את הכמויות הנדרשות של תרחיף חרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל, ואז מניחים על המגנט למשך 3 דקות עד שהחרוזים המגנטיים יוצרים כדור.
      הערה: השתמש בחרוזי אוליגו (dT) של 50 μL עבור קלט RNA כולל של 10 מיקרוגרם. נפח החרוזים בשלב זה יכול להיות ממוטב עוד יותר בהתאם לתאים המשמשים.
    4. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את חרוזי האוליגו (dT) עם כמויות שוות (נפח תרחיף החרוזים המשמש בשלב 1.1.3.) של חיץ ליזיס והניחו על המגנט למשך 3 דקות לפני הסרת הסופרנטנט.
      הערה: אין לייבש את החרוזים יתר על המידה; המשתמש צריך להמשיך במהירות לשלב 1.2.1.
  2. סבב הטיהור הראשון
    1. הוסף חיץ ליזה לצינור דגימת הרנ"א (יחס נפח 4:1) וערבב היטב לפני העברתו לחרוזי אוליגו (dT).
      הערה: אם נפח דגימת הרנ"א הוא 20 μL, הוסף 80 μL של מאגר ליזיס.
    2. השהה מחדש את הרנ"א: תערובת חיץ ליזיס וחרוזי אוליגו (dT) במלואם על ידי פיפטציה לפחות פי 10.
    3. אפשר לדגור על הדגימות בסיבוב רציף במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. מניחים את הדגימה על המגנט למשך 5 דקות או עד שהסופרנאטנט נקי; השליכו את הסופר-נאנט.
    5. הוסיפו 600 μL של Wash Buffer 1 לחרוזים וערבבו בזהירות כדי להשהות מחדש את החרוזים.
    6. הניחו את הצינורית על המגנט למשך 5 דקות או עד שהסופרנאטנט נקי, השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על שלב השטיפה 1.2.5 פעם אחת.
    7. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 300 μL של Wash Buffer 2, והשהו מחדש בעדינות את החרוזים.
    8. הניחו את הצינורית על המגנט למשך 5 דקות או עד שהסופרנאטנט נקי, השליכו את הסופרנטנט וחזרו על שלב השטיפה 1.2.7 פעם אחת.
    9. הוסף 30 μL של 10 mM קר Tris-HCl (חיץ Elution) לצינור הדגימה ודגור ב 70 ° C במשך 5 דקות.
    10. העבירו במהירות את הצינור אל המגנט, וכאשר המתלה צלול לאחר 20 שניות או יותר, העבירו את הסופרנאטנט המכיל RNA מועשר בפולי(A) מדולל לצינור המיקרוצנטריפוגה החדש בנפח 1.5 מ"ל.
  3. סבב הטיהור השני
    1. הוסף 120 μL (פי 4 מנפח הדגימה המדוללת) חיץ ליזה לדגימת הרנ"א המדולל וערבב היטב.
    2. שטפו את החרוזים ששימשו בסבב הראשון של הטיהור עם כמות שווה של חיץ ליזיס כמו שלב 1.1.4, צינור 10x כדי להשהות מחדש את החרוזים, ולאחר מכן הניחו אותם על המגנט במשך 5 דקות לפני השלכת supernatant.
    3. מעבירים את הרנ"א: תערובת חיץ ליזיס לחרוזים השטופים ומערבבים היטב על ידי פיפטינג לפחות פי 10.
    4. דגרו על הדגימה בסיבוב רציף במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. חזור על שלבים 1.2.4 עד 1.2.8 כדי להסיר מלח ותת-סוגים אחרים של RNA.
      הערה: ניתן להפחית את נפח מאגר הכביסה ל-300 μL של Wash Buffer 1 ול-150 μL של Wash Buffer 2.
    6. הוסף 25 μL (נפח רצוי) של 10 mM קר Tris-HCl (Elution buffer) לצינור הדגימה ודגור ב 70 ° C במשך 5 דקות.
    7. העבירו במהירות את הצינור אל המגנט, וכאשר המתלה צלול לאחר 20 שניות או יותר, העבירו את הסופרנאטנט המכיל RNA מועשר בפולי(A) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    8. העבר 2.2 μL לצינורות בעלי 8 רצועות להערכת איכות של כמות ואיכות RNA באמצעות בדיקות RNA רגישות גבוהה.
    9. אחסן את הדגימה ב -20 ° C לתקופות קצרות ו -70 ° C לתקופה ארוכה יותר.
      הערה: זו יכולה להיות נקודת השהיה בפרוטוקול.

2. המרת ביסולפיט

הערה: שלבי הצנטריפוגה בוצעו כולם בטמפרטורת החדר. ההליכים מבוצעים למעשה בהתאם להוראות היצרן אך עם שלב נוסף 2.2 להוספת רצפי mRNA בקרת ספייק-אין לפני שלב תגובת ביסולפיט שלב 2.3.

  1. העברת 19 μL של דגימת RNA מועשר פולי(A) מטוהר לצינור 0.2 מ"ל בעל 8 פסים.
  2. הוסף 1.0 μL של בקרת ספייק-אין, שאינה כוללת שינויים כלשהם ביחס הכמות שנקבע מראש של 1:10,000 (כלומר, 0.1 ננוגרם של mRNA לוציפראז: 1 מיקרוגרם של RNA מועשר בפולי(A) מטוהר) לדגימת הרנ"א של שלב 2.1.
    הערה: רצף בקרת הספייק-אין יכול להיות Firefly luciferase RNA, Renilla luciferase, או רצף RNA משועתק במבחנה ללא ציטוזין שעבר מתילציה.
  3. מוסיפים 130 μL של עוצר המרה לצינור והופכים בעדינות מספר פעמים לערבוב יסודי.
  4. הניחו את הצינור במכונת ה-PCR ובצעו שלושה מחזורי חימום ב-70°C למשך 10 דקות ולאחר מכן דגירה ב-64°C למשך 45 דקות כל אחד ולאחר מכן שלב אחרון להתקררות ל-4°C.
  5. הניחו את העמוד על צינור האיסוף והעבירו 250 מיקרוליטר של מאגר קשירת RNA לעמודה.
  6. העבר את הדגימה משלב 2.4 לעמודה משלב 2.5 וצינור ביסודיות.
  7. הוסף 400 μL של 95-100% אתנול לעמודה, לסגור במהירות את המכסה, ולהפוך מספר פעמים.
  8. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 שניות ב 25 ° C ולבטל את הזרימה.
  9. הוסף 200 μL של מאגר שטיפת RNA לעמודה.
  10. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 שניות ב 25 ° C ולהשליך את הזרימה.
  11. מוסיפים 200 μL של חיץ דה-סולפונציה ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  12. צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 30 שניות ב-25°C והשליכו את הזרימה.
  13. הוסף 400 μL של חיץ שטיפה RNA וצנטריפוגה ב 10,000 × גרם עבור 30 שניות ב 25 ° C ולבטל את הזרימה. חזור על שלב זה פעם אחת.
  14. צנטריפוגה שוב ב 10,000 × גרם למשך 2 דקות ב 25 ° C כדי להסיר לחלוטין את חיץ הכביסה השיורי.
    הערה: שלב הצנטריפוגה השני 2.14 למשך 2 דקות לפני היציאה הוא להסיר לחלוטין את מאגר הכביסה. שלב השטיפה מבוצע פעמיים כדי לשטוף את הרכיב עתיר המלח מגיב הביסולפיט ואת חיץ הדה-סולפונציה על העמודה.
  15. העבר את העמוד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל.
  16. הוסף 20-30 μL של H2O ללא Nuclease לעמוד ועמוד בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
  17. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 שניות ב 25 ° C.
  18. העבר 2.2 μL לצינורות 8 רצועות להערכת כמות ואיכות RNA.
  19. אחסן את דגימת ה- RNA שטופלה בביסולפיט ב -20 ° C לתקופות קצרות ו -70 ° C לתקופה ארוכה יותר.
    הערה: זו יכולה להיות נקודת השהיה בפרוטוקול.

3. הכנת ספריית mRNA המטופלת בביסולפיט

הערה: עקוב אחר פרוטוקול הוראות הכנת הספרייה סעיף 4 לשימוש עם mRNA מטוהר או RNA מדולדל rRNA. השלב הראשון צריך לעקוב אחר פרוטוקול RNA FFPE מאז הטיפול bisulfite מפרק את RNA. בצעו כל שלב במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית והוסיפו את תערובת התגובה על מדף קירור מקורר כקרח.

  1. הקדמת RNA הקלט
    1. העבר את הכמות הרצויה של דגימת mRNA שטופלה בביסולפיט במקסימום כולל של 5 μL או הוסף H2O ללא Nuclease כדי ליצור סך של 5 μL.
      הערה: מומלץ לפחות 10 ננוגרם של mRNA המטופל בביסולפיט כקלט עבור סוג זה של הכנת ספריית RNA וכדי ליצור את הטוחנת הסופית של מוצר ספריית 4nM.
    2. מוסיפים 1 μL של פריימר אקראי (לילך) לדגימה ומערבבים על ידי pipetting.
    3. הניחו את צינור הדגימה במכונת ה-PCR שהוגדרה מראש ב-65°C ואת המכסה ב-105°C למשך 5 דקות והחזיקו ב-4°C.
  2. סינתזת cDNA גדיל ראשון
    1. הוסף 4 μL של חיץ תגובת סינתזה (לילך), 8 μL של מגיב ספציפיות גדיל (חום), ו 2 μL של תערובת אנזימי סינתזה (חום) לדגימה, אשר עושה נפח כולל של 20 μL. מערבבים היטב על ידי pipeting לפחות 10x ומסתובבים במהירות.
    2. הניחו את צינור הדגימה במכונת ה-PCR שהוגדרה מראש ב-25°C למשך 10 דקות, 42°C למשך 50 דקות, 70°C למשך 15 דקות והחזיקו ב-4°C.
      הערה: עבור תוספות מעל 200 בסיסים, מוצעת תקופת דגירה של 42°C של 50 דקות; עבור גודל הוספה מתחת ל-200 בסיסים, מוצעת תקופת דגירה של 42 מעלות צלזיוס של 15 דקות.
  3. סינתזת cDNA גדיל שני
    1. הוסף 8 μL של מאגר תגובת סינתזה עם תערובת dUTP (כתום), 4 μL של תערובת אנזימי סינתזה (כתום), ו 48 μL של H2O ללא Nuclease. ערבבו היטב על ידי פיפטינג לפחות פי 10 והסתובבו במהירות.
    2. הניחו את צינור הדגימה במכונת ה-PCR המוגדרת מראש ב-16°C למשך שעה אחת כשהמכסה כבוי או ≤40°C.
  4. טיהור cDNA דו-גדילי עם חרוזי טיהור DNA
    1. מחממים מראש את חרוזי טיהור הדנ"א 30 דקות לפני ביצוע הטיהור והמערבולת כדי להשעות מחדש את החרוזים.
    2. הוסף 144 μL של חרוזי טיהור DNA מרחפים מחדש לדגימת cDNA משלב 3.3.2 וערבב היטב על ידי pipeting לפחות 10x.
    3. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. הניחו את צינור הדגימה על מדף מגנטי למשך 5 דקות עד שהתמיסה ברורה ולאחר מכן, הסירו את הסופרנאטנט ושמרו את החרוזים המכילים DNA.
    5. הוסף 200 μL של אתנול טרי 80% לצינור עם החרוזים תוך שמירה על הדגימה על המדף המגנטי ודגור בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.
    6. הסר את supernatant ולחזור על שלב 3.4.5 פעם אחת, אבל הפעם בזהירות להסיר את כל supernatant שיורי.
    7. יבשו את החרוזים באוויר למשך 1-5 דקות תוך שמירה על הדגימה על המגנט.
      הערה: אין לייבש את החרוזים יתר על המידה; הצבע צריך להיות חום כהה.
    8. הסר את הדגימה מהמדף המגנטי ומחק את ה- DNA על ידי הוספת 53 μL של מאגר 0.1x TE (10 mM Tris-HCl ו- 1 mM EDTA, pH 8.0) לחרוזים. מערבבים היטב על ידי פיפטינג לפחות 10x ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
    9. הניחו את הצינור על המדף המגנטי למשך 5 דקות או עד שהתמיסה צלולה.
    10. מעבירים 50 μL של supernatant המכיל cDNA דו-גדילי לצינור חדש בעל 8 פסים.
      הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולאחסן את הדגימה ב -30 °C.
  5. סיום הכנת ספריית cDNA
    1. הוסף 7 μL של Final Polishing Reaction Buffer (ירוק) ו-3 μL של End-Polishing Enzyme Mix (ירוק) לדגימת cDNA דו-גדילי מדולל.
    2. ערבבו את התערובת על ידי פיפטינג פי 10 עם הגדרת נפח של 50 μL מבלי ליצור בועות, ולאחר מכן סובבו במהירות את הדגימה.
    3. הניחו את הדגימה במכונת PCR ודגרו בטמפרטורה של 20°C למשך 30°C, 65°C למשך 30°C והחזיקו בטמפרטורה של 4°C.
  6. קשירת מתאמים
    1. יש לדלל את המתאם (אדום) בהתאם להוראות היצרן.
    2. הוסף 2.5 μL של מתאם מדולל, 1 μL של משפר קשירה (אדום), ו 30 μL של תערובת מאסטר קשירה (אדום) לדגימה.
    3. ערבבו את התערובת על ידי פיפטינג פי 10 עם הגדרת נפח של 80 μL מבלי ליצור בועות, ולאחר מכן סובבו במהירות את הדגימה.
    4. הניחו את הדגימה במכונת PCR ודגרו בטמפרטורה של 20°C למשך 15 דקות.
    5. הוסף 3 μL של תערובת של אורציל DNA glycosylase ו- DNA glycosylase-lyase endonuclease VIII (כחול) לדגימה ו pipet ביסודיות.
    6. החזירו את הדגימה למכונת ה-PCR ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות כשהמכסה מכוון ל-75°C.
  7. טיהור של cDNA מטופל בתגובת קשירה
    הערה: בחירת הגודל עם חרוזי SPRIselect, או לחלופין עם חרוזי AMpure XP יכולה לשמש למטרה זו18.
    1. מחממים מראש את החרוזים 30 דקות לפני ביצוע הטיהור והמערבולת כדי להשעות אותם מחדש.
    2. העבר 25 μL של חרוזים מרחפים לדגימת cDNA משלב 3.6.6 וערבב היטב על ידי pipeting לפחות 10x.
    3. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. הניחו את שפופרת הדגימה על מדף מגנטי למשך 5 דקות עד שהתמיסה צלולה ואז העבירו את הסופרנאטנט לשפופרת חדשה בעלת 8 רצועות והשליכו את החרוזים.
    5. מוסיפים 10 μL של חרוזים מרחפים לסופרנאטנט ומערבבים היטב על ידי פיפטציה לפחות פי 10.
    6. הניחו את שפופרת הדגימה על מדף מגנטי למשך 5 דקות עד שהתמיסה צלולה ואז השליכו את הסופרנאטנט ואל תפריעו לחרוזים.
    7. הוסף 200 μL של אתנול טרי 80% לצינור עם החרוזים תוך שמירה על הדגימה על המדף המגנטי ודגור בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.
    8. הסר את supernatant ולחזור על שלב 3.7.7 פעם אחת, אבל הפעם בזהירות להסיר את כל supernatant שיורי.
    9. יבשו את החרוזים באוויר למשך 1-5 דקות תוך שמירה על הדגימה על המגנט.
      הערה: אין לייבש את החרוזים יתר על המידה; הצבע צריך להיות חום כהה.
    10. הסר את הדגימה מהמדף המגנטי ומחק את הדנ"א על ידי הוספת 17 μL של חיץ 0.1x TE לחרוזים. מערבבים היטב על ידי פיפטינג לפחות 10x ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
    11. הניחו את הצינור על המדף המגנטי למשך 5 דקות עד שהתמיסה צלולה.
    12. העבר 15 μL של supernatant, המכיל dsDNA מוכן למטרה לצינור חדש בן 8 רצועות.
  8. העשרת PCR של DNA קשור מתאם
    1. הוסף 25 μL של תערובת מאסטר (כחול), 5 μL של פריימר מתאם 5' ו- 5 μL של פריימר מתאם 3' לדגימת DNA קשירת מתאם. מערבבים היטב על ידי פיפטינג לפחות פי 10.
    2. הניחו את הדגימה במכשיר ה-PCR ובצעו הגברה של PCR באמצעות השלבים הבאים: (1) 98°C למשך 30 שניות, (2) 98°C למשך 10 שניות, (3) 65°C למשך 75 שניות, (4) 65°C למשך 5 דקות, ו-(5) החזק ב-4°C; שבו השלבים (2) ו-(3) צריכים לחזור על עצמם עבור מספר מחזור N+2 שבו N שווה לכמות קלט הרנ"א במדריך ההוראות. משמעות הדבר היא שיש צורך בשני מחזורים נוספים עקב בחירת גודל צד כפול של דגימות שבוצעו בשלב 3.7.
      הערה: לדוגמה, 8 ננוגרם של קלט mRNA מטוהר יומלץ עם 9-10 מחזורים של PCR; אבל עם cDNA דו-צדדי, שנבחר בגודל, קשור בשלב 3.7, מחזור ה-PCR המומלץ יהיה 11-12 מחזורים.
  9. טיהור ספריות PCR מוגברות
    1. חממו מראש את חרוזי טיהור הדנ"א במשך 30 דקות לפני ביצוע הטיהור והמערבולת כדי להשעות מחדש את החרוזים.
    2. העבר 45 μL (0.9x) של חרוזים מרחפים למוצר PCR משלב 3.8.2 וערבב היטב על ידי pipeting לפחות 10x.
    3. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. הניחו את צינורית הדגימה על מדף מגנטי למשך 5 דקות עד שהתמיסה צלולה ואז הסירו את הסופרנאטנט ושמרו את החרוזים המכילים DNA.
    5. הוסף 200 μL של אתנול טרי 80% לצינור עם החרוזים, להשאיר את הדגימה על המדף המגנטי ולאפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.
    6. הסר את supernatant וחזור על שלב 3.9.5 פעם אחת, אבל הפעם בזהירות להסיר את כל supernatant שיורית.
    7. יבשו את החרוזים באוויר למשך 1-5 דקות תוך שמירה על הדגימה על המגנט.
      הערה: אין לייבש את החרוזים יתר על המידה; הצבע צריך להיות חום כהה.
    8. הסר את הדגימה מהמדף המגנטי והוסף 22 μL של חיץ TE 0.1x לחרוזים כדי להקנות את ה- DNA. מערבבים היטב על ידי פיפטינג לפחות 10x ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
    9. הניחו את הצינור על המדף המגנטי והניחו לו לעמוד למשך 5 דקות או עד שהתמיסה צלולה בטמפרטורת החדר.
    10. מעבירים 20 μL של supernatant לצינור חדש בעל 8 רצועות.
    11. העבר 2.2 μL לצינורות בעלי 8 רצועות להערכת איכות כמות ואיכות הספרייה.
      הערה: ניתן לזהות את כמות הספרייה גם על-ידי qPCR (ראה טבלת חומרים).
    12. אחסן את דוגמת ספריית bsRNA-seq ב- -20 °C.

תוצאות

סדרה של ספריות bsRNA-seq מקווי תאים19 נוצרו על-ידי ביצוע ההליכים בדוח זה (איור 1). לאחר טיהור RNA כולל המלווה בטיפול DNase המבוצע בדגימות קו תאים ובדיקת האיכות על ידי אלקטרופורזה בג'ל וספקטרופוטומטריה UV-Vis (A260/A280), דגימת ה-RNA יכולה להמשיך להעשרת RNA פולי(A). כדי לקבוע ...

Discussion

בפרוטוקול זה, צנרת מפורטת של העשרת פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה הושגה על ידי שימוש ברכיבים סטנדרטיים. ניתוח ריצוף נוסף סיפק זיהוי של mRNA 5-methylcytosine בדגימות מעניינות.

השלב הקריטי הוא איכות החומר ההתחלתי - סך כל הרנ"א - שכן פירוק הרנ"א ישפיע על קצב ההתאוששות של טיהור RNA פולי(A)....

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה של טייוואן. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer SystemAgilent, Santa Clara, CARNA quality detection
AMpure XP beadsBeckman CoulterA63881purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kitAgilent, Santa Clara, CA5067-4626DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kitAgilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rackDiagenode, Denville, NJB04000001assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rackDiagenode, Denville, NJB04000003assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kitThermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
EthanolJ.T.Baker64-17-5
EZ RNA methylation kitZymo, Irvine, CAR5002bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNAPromega, Madison, WI, USAL4561spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification KitsRoche, SwitzerlandKK4824library quantification
Nanodrop spectrophotometerThermo Fisher Scientific, Waltham, MATotal RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)New England Biolabs, Ipswich, MAE7335Slibrary preparation
NEBNext Ultra figure-materials-2064 Directional RNA Library Prep Kit for IlluminaNew England Biolabs, Ipswich, MAE7760Slibrary preparation
Nuclease-free WaterThermo Fisher ScientificAM9932
P2 pipetmanThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Qubit 2.0 fluorometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MARNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852RNA quantity detection

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , (2009).
  19. Chen, S. -. Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MRNAmRNARNARNARNA 5RNARNA AMRNA 5RNARNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved