העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

Summary

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.

Abstract

שינויים לאחר שעתוק RNA בסוגים שונים של תעתיקי RNA קשורים לוויסות RNA מגוון בתאים איקריוטים. שינויים חריגים ב-RNA 5-methylcytosine והביטוי הלא מווסת של RNA methyltransferases הוכחו כקשורים למחלות שונות, כולל סרטן. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כדי לאפיין את המיקומים ואת רמות המתילציה הכמותית של ציטוזין ב-RNA המומר על ידי ביסולפיט ברזולוציית זוג הבסיס. בזאת, פרוטוקול זה מציג את ההליכים של שני סבבים של טיהור RNA פולי(A), שלושה מחזורים של תגובת ביסולפיט, והכנת ספרייה בפירוט כדי לאפשר מיפוי רחב שעתוק של אתרי שינוי mRNA 5-methylcytosine. הערכת כמות ואיכות ה-RNA לאחר התגובה העיקרית חיונית לניטור שלמות ה-RNA והיא צעד קריטי להבטחת ספריות ריצוף באיכות גבוהה. באופן אידיאלי, ניתן להשלים את ההליכים תוך שלושה ימים. באמצעות פרוטוקול זה, שימוש ב-RNA כולל באיכות גבוהה כקלט יכול למעשה לבנות ספריות ביסולפיט-mRNA חזקות לריצוף הדור הבא מהמדגם המעניין.

Introduction

בין למעלה מ-150 סוגים של שינויים שלאחר שעתוק¹, זוהה שינוי 5-מתיל-ציטוזין (m⁵C) בסוגים שונים של RNA, כולל RNA ריבוזומלי, RNA העברה, רנ"א שליח, מיקרו-רנ"א, רנ"א ארוך שאינו מקודד, רנ"א קמרון, רנ"א משפר, ורנ"א קחאל קטן ספציפי לגוף². הרנ"א m 5 C קשור למגוון מנגנונים ביולוגיים ופתולוגיים כגון ויסות התפתחות שורשי צמחים³, ביטוי גנים נגיפיים⁴ והתקדמות סרטן⁵. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צינורות יעילים לאפיון פרופיל השינוי רחב התמלול mRNA m⁵C של דגימות ביולוגיות בשלבי התפתחות שונים או במסגרת המחלה. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כד....

Protocol

1. טיהור RNA פולי(A)

הערה: השתמש ב-RNA הכולל שטופל ב-DNase I ובחן את האיכות והשלמות הכוללת של ה-RNA על ידי הערכת אלקטרופורזה של נימים או ג'ל קונבנציונלי לפני שתמשיך לטיהור RNA פולי(A). החוקרים אמורים להיות מסוגלים לזהות את הפסים הריבוזומליים rRNA 28S ו-18S בשדה המשקל המולקולרי הגבוה ואת רצועת ה-rRNA 5.8S בשדה המשקל המולקולרי הנמוך ללא פסי מריחה משמעותיים באלקטרופרוגרמה. שלבי הטיהור למעשה עוקבים אחר הוראות היצרן עם שינויים קלים המצוינים בשלבים הספציפיים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנה
   1. חממו את המגיב, חיץ הכביסה, חרוזי אוליגו (dT) וחיץ ה....

תוצאות

סדרה של ספריות bsRNA-seq מקווי תאים¹⁹ נוצרו על-ידי ביצוע ההליכים בדוח זה (איור 1). לאחר טיהור RNA כולל המלווה בטיפול DNase המבוצע בדגימות קו תאים ובדיקת האיכות על ידי אלקטרופורזה בג'ל וספקטרופוטומטריה UV-Vis (A260/A280), דגימת ה-RNA יכולה להמשיך להעשרת RNA פולי(A). כדי לקבוע .......

Discussion

בפרוטוקול זה, צנרת מפורטת של העשרת פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה הושגה על ידי שימוש ברכיבים סטנדרטיים. ניתוח ריצוף נוסף סיפק זיהוי של mRNA 5-methylcytosine בדגימות מעניינות.

השלב הקריטי הוא איכות החומר ההתחלתי - סך כל הרנ"א - שכן פירוק הרנ"א ישפיע על קצב ההתאוששות של טיהור RNA פולי(A)........

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection