Yeni Nesil Dizileme için mRNA ve Bisülfit-mRNA Kütüphanesinin Zenginleştirilmesi Hazırlığı

Özet

Bu protokol, ilgilenilen biyolojik bir numune için standartlaştırılmış ekipman kullanarak poli(A) RNA saflaştırması, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlığı yapmak için takip edilmesi kolay bir iş akışı sağlar.

Özet

Çeşitli RNA transkript tiplerindeki RNA transkripsiyon sonrası modifikasyonlar, ökaryotik hücrelerde çeşitli RNA regülasyonu ile ilişkilidir. Anormal RNA 5-metilsitozin modifikasyonlarının ve RNA metiltransferazların düzensiz ekspresyonunun kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Baz çifti çözünürlüğünde bisülfit dönüştürülmüş RNA'daki pozisyonları ve kantitatif sitozin metilasyon seviyelerini karakterize etmek için transkriptom çapında bisülfit dizileme geliştirilmiştir. Burada, bu protokol, mRNA 5-metilsitozin modifikasyon bölgelerinin transkriptom çapında haritalanmasına izin vermek için iki tur poli(A) RNA saflaştırması, üç döngü bisülfit reaksiyonu ve kütüphane hazırlama prosedürlerini ayrıntılı olarak sunar. Ana reaksiyondan sonra RNA miktarının ve kalitesinin değerlendirilmesi, RNA bütünlüğünü izlemek için gereklidir ve yüksek kaliteli dizileme kitaplıkları sağlamak için kritik bir adımdır. İdeal olarak, prosedürler üç gün içinde tamamlanabilir. Bu protokolle, girdi olarak yüksek kaliteli toplam RNA'nın kullanılması, ilgilenilen örnekten yeni nesil dizileme için pratik olarak sağlam bisülfit-mRNA kitaplıkları oluşturabilir.

Giriş

150'den fazla transkripsiyon sonrası modifikasyon^{türü arasında 1}, 5-metilsitozin (^m5C) modifikasyonu, ribozomal RNA, transfer RNA, haberci RNA, mikro RNA, uzun kodlamayan RNA, tonoz RNA, güçlendirici RNA ve küçük cajal vücuda özgü RNA'lar² dahil olmak üzere çeşitli RNA tiplerinde tanımlanmıştır. RNA m⁵C, bitki kök gelişimini³, viral gen ekspresyonu⁴ ve kanser ilerlemesini⁵ düzenleme gibi çeşitli biyolojik ve patolojik mekanizmalarla ilişkilidir. Bu protokolün amacı, farklı gelişim aşamalarında veya hastalık ortamında biyolojik ö....

Protokol

1. Poli(A) RNA saflaştırması

NOT: DNaz I ile muamele edilen toplam RNA'yı kullanın ve poli(A) RNA saflaştırmasına geçmeden önce kapiler veya konvansiyonel jel elektroforezi değerlendirmesi ile toplam RNA kalitesini ve bütünlüğünü inceleyin. Araştırmacılar, elektroferogramda herhangi bir önemli yayma bandı olmadan yüksek moleküler ağırlıklı alanda 28S ve 18S rRNA ribozomal bantlarını ve düşük moleküler ağırlıklı alanda 5.8S rRNA bandını tanımlayabilmelidir. Saflaştırma adımları, belirli adımlarda belirtilen küçük değişikliklerle esasen üreticinin talimatlarını takip eder. Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve aletlerle ilgil....

Tartışmalar

Bu protokolde, standartlaştırılmış bileşenler kullanılarak ayrıntılı bir poli(A) zenginleştirme, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlama hattı elde edildi. Daha ileri dizileme analizi, ilgilenilen örneklerde mRNA 5-metilsitozinin tanımlanmasını sağladı.

Kritik adım, başlangıç materyalinin kalitesidir - toplam RNA - çünkü RNA'nın bozunması poli (A) RNA saflaştırmasının geri kazanım oranını etkileyecektir. Poli(A) RNA saflaştırma adımını gerçekle.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection