JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, ilgilenilen biyolojik bir numune için standartlaştırılmış ekipman kullanarak poli(A) RNA saflaştırması, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlığı yapmak için takip edilmesi kolay bir iş akışı sağlar.

Özet

Çeşitli RNA transkript tiplerindeki RNA transkripsiyon sonrası modifikasyonlar, ökaryotik hücrelerde çeşitli RNA regülasyonu ile ilişkilidir. Anormal RNA 5-metilsitozin modifikasyonlarının ve RNA metiltransferazların düzensiz ekspresyonunun kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Baz çifti çözünürlüğünde bisülfit dönüştürülmüş RNA'daki pozisyonları ve kantitatif sitozin metilasyon seviyelerini karakterize etmek için transkriptom çapında bisülfit dizileme geliştirilmiştir. Burada, bu protokol, mRNA 5-metilsitozin modifikasyon bölgelerinin transkriptom çapında haritalanmasına izin vermek için iki tur poli(A) RNA saflaştırması, üç döngü bisülfit reaksiyonu ve kütüphane hazırlama prosedürlerini ayrıntılı olarak sunar. Ana reaksiyondan sonra RNA miktarının ve kalitesinin değerlendirilmesi, RNA bütünlüğünü izlemek için gereklidir ve yüksek kaliteli dizileme kitaplıkları sağlamak için kritik bir adımdır. İdeal olarak, prosedürler üç gün içinde tamamlanabilir. Bu protokolle, girdi olarak yüksek kaliteli toplam RNA'nın kullanılması, ilgilenilen örnekten yeni nesil dizileme için pratik olarak sağlam bisülfit-mRNA kitaplıkları oluşturabilir.

Giriş

150'den fazla transkripsiyon sonrası modifikasyontürü arasında 1, 5-metilsitozin (m5C) modifikasyonu, ribozomal RNA, transfer RNA, haberci RNA, mikro RNA, uzun kodlamayan RNA, tonoz RNA, güçlendirici RNA ve küçük cajal vücuda özgü RNA'lar2 dahil olmak üzere çeşitli RNA tiplerinde tanımlanmıştır. RNA m5C, bitki kök gelişimini3, viral gen ekspresyonu4 ve kanser ilerlemesini5 düzenleme gibi çeşitli biyolojik ve patolojik mekanizmalarla ilişkilidir. Bu protokolün amacı, farklı gelişim aşamalarında veya hastalık ortamında biyolojik örneklerin transkriptom çapında mRNA m5C modifikasyon profilini karakterize etmek için aerodinamik boru hatları sağlamaktır. Baz çifti çözünürlüğü 6,7,8,9'da bisülfit dönüştürülmüş RNA'daki pozisyonları ve kantitatif sitozin metilasyon seviyelerini karakterize etmek için transkriptom çapında bisülfit dizileme geliştirilmiştir. Bu, özelliklem5C'nin hücrelerdeki biyolojik düzenleyici mekanizmalarda yer alan gen ekspresyonu ve RNA kaderi ile ilişkisini incelerken yararlıdır. Memeli hücresinde bilinen iki m5 C okuyucusu vardır: ALYREF, çekirdektem5C'yitanıyabilir ve bir mRNA çekirdeğinden sitozole taşıyıcısı 10 olarak hizmet ederken, YBX1 sitoplazmadam5C'yi tanıyabilir ve mRNA stabilizasyonunu artırabilir11. Sistemik Lupus Eritematozus CD4+ T hücrelerinde immün yolaklarla ilgili anormal m5C mRNA'ları bildirilmiştir12. Çalışmalar, mRNA m5C modifikasyonu ve kanser bağışıklığının modülasyonu ile kanser ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur13,14. Bu nedenle, mRNA üzerindeki m5C modifikasyon profilinin haritalanması, potansiyel düzenleyici mekanizmayı aydınlatmak için çok önemli bilgiler sağlayabilir.

Belirli biyolojik koşullar altında RNA m 5 C modifikasyonununfonksiyonel rollerini araştırmak için, m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq ve 5-Aza-seq gibi bisülfit dönüşüm tabanlı (bsRNA-seq) ve antikor afinite zenginleştirme tabanlı yaklaşımlar, transkriptom çapında bir ölçekte m5C modifikasyonları ile hedeflenen bölgelerin ve dizilerin verimli bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için yüksek verimli dizileme platformu ile birleştirilebilir15, 16. Bu protokolün avantajı, antikor afinitesi zenginleştirmeye dayalı yaklaşım, yüksek kaliteli antikorların mevcudiyetine dayandığından vem5C metilasyon manzarası17'nin tek parça çözünürlüğünü elde edebildiğinden, tek bazlı bir çözünürlükte kapsamlı RNA m5C manzarasını sağlar.

Tüm RNA örnekleri, oligo(dT) boncukları, üç döngü bisülfit reaksiyonu ve dizileme kütüphanesi hazırlığı kullanılarak iki tur mRNA zenginleştirme ile işlenecektir. RNA kalitesini izlemek için, her RNA numunesi, fragman dağılımını değerlendirmek için mRNA saflaştırma ve bisülfit reaksiyonu prosedürlerinden önce ve sonra kılcal jel elektroforezi ile incelenecektir. Saflaştırılmış kütüphaneler, PCR amplikon nitelikleri, kılcal jel elektroforezi ile DNA boyutu dağılım fragmanları ve dizilemeden önce floresan boya bazlı kantitatif tahlillerle incelenen toplam miktarları ile incelenecektir. Sistem ayrıca tarımsal ürünler, izole viryonlar, hücre hatları, model organizmalar ve patolojik örnekler gibi geniş bir biyolojik numune yelpazesini analiz etmek için de kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Poli(A) RNA saflaştırması

NOT: DNaz I ile muamele edilen toplam RNA'yı kullanın ve poli(A) RNA saflaştırmasına geçmeden önce kapiler veya konvansiyonel jel elektroforezi değerlendirmesi ile toplam RNA kalitesini ve bütünlüğünü inceleyin. Araştırmacılar, elektroferogramda herhangi bir önemli yayma bandı olmadan yüksek moleküler ağırlıklı alanda 28S ve 18S rRNA ribozomal bantlarını ve düşük moleküler ağırlıklı alanda 5.8S rRNA bandını tanımlayabilmelidir. Saflaştırma adımları, belirli adımlarda belirtilen küçük değişikliklerle esasen üreticinin talimatlarını takip eder. Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

  1. Hazırlık
    1. Aşağıdaki prosedürleri uygulamadan önce reaktifi, yıkama tamponunu, oligo(dT) boncukları ve lizis tamponunu oda sıcaklığında 30 dakika ısıtın.
    2. Poli(A) ile zenginleştirilmiş RNA'nın izolasyonu için, yeterli miktarda RNA'yı nükleaz içermeyen 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak başlangıç materyali olarak 10-20 μg yüksek kaliteli toplam RNA alikotu hazırlayın. Isı bloğunda 70 °C'de 5 dakika inkübe edin, ardından 2 dakika buz üzerinde tutun.
      NOT: Başlangıç materyali olarak toplam RNA miktarları, istenen mRNA miktarına ve kullanılan hücrelerin doğasına bağlı olarak uygun şekilde ayarlanmalıdır. Ampirik olarak, poli(A) ile zenginleştirilmiş RNA, toplam RNA'da %1-5 bolluk oluşturabilir. 10 μg yüksek kaliteli toplam RNA'nın bir alikotu, aşağı akış bisülfit dönüşümü için 100-500 ng aralığında yüksek kaliteli poli(A) ile zenginleştirilmiş RNA sağlamalıdır.
    3. Bu arada, oligo (dT) boncuklarını tamamen yeniden askıya alın. Gerekli miktarda boncuk süspansiyonunu yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından manyetik boncuklar bir pelet oluşturana kadar 3 dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.
      NOT: 10 μg toplam RNA girişi için 50 μL oligo(dT) boncuk kullanın. Bu adımdaki boncukların hacmi, kullanılan hücrelere bağlı olarak daha da optimize edilebilir.
    4. Süpernatanı çıkarın ve oligo(dT) boncuklarını eşit miktarlarda (adım 1.1.3'te kullanılan boncuk süspansiyonunun hacmi) lizis tamponu ile yeniden süspanse edin ve süpernatanı çıkarmadan önce 3 dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.
      NOT: Boncukları fazla kurutmayın; Kullanıcı hızlı bir şekilde Adım 1.2.1'e geçmelidir.
  2. İlk saflaştırma turu
    1. RNA numune tüpüne lizis tamponu ekleyin (hacim oranı 4:1) ve oligo(dT) boncuklarına aktarmadan önce iyice karıştırın.
      NOT: RNA numune hacmi 20 μL ise, 80 μL lizis tamponu ekleyin.
    2. RNA: lizis tampon karışımı ve oligo(dT) boncuklarını en az 10 kez pipetleyerek tamamen yeniden süspanse edin.
    3. Numunelerin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sürekli rotasyonla inkübe edilmesine izin verin.
    4. Numuneyi 5 dakika boyunca veya süpernatan berraklaşana kadar mıknatısın üzerine yerleştirin; süpernatanı atın.
    5. Boncuklara 600 μL Yıkama Tamponu 1 ekleyin ve boncukları yeniden süspanse etmek için dikkatlice karıştırın.
    6. Tüpü 5 dakika boyunca veya süpernatan temizlenene kadar mıknatısın üzerine yerleştirin, süpernatanı atın ve yıkama adımı 1.2.5'i bir kez tekrarlayın.
    7. 300 μL Yıkama Tamponu 2 ekleyerek boncukları yıkayın ve boncukları nazikçe yeniden süspanse edin.
    8. Tüpü 5 dakika boyunca veya süpernatan temizlenene kadar mıknatısın üzerine yerleştirin, süpernatanı atın ve yıkama adımı 1.2.7'yi bir kez tekrarlayın.
    9. Numune tüpüne 30 μL soğuk 10 mM Tris-HCl (Elüsyon tamponu) ekleyin ve 70 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    10. Tüpü hızlı bir şekilde mıknatısın üzerine aktarın ve süspansiyon 20 saniye veya daha uzun bir süre sonra temizlendiğinde, ayrıştırılmış poli(A) ile zenginleştirilmiş RNA içeren süpernatantı yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  3. İkinci saflaştırma turu
    1. Ayrıştırılmış RNA örneğine 120 μL (ayrıştırılmış numunenin hacminin 4 katı) lizis tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
    2. İlk saflaştırma turunda kullanılan boncukları adım 1.1.4'te olduğu gibi eşit miktarda lizis tamponu ile yıkayın, boncukları yeniden süspanse etmek için 10x pipetleyin ve ardından süpernatanı atmadan önce 5 dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.
    3. RNA: lizis tampon karışımını yıkanmış boncuklara aktarın ve en az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.
    4. Numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sürekli rotasyonla inkübe edin.
    5. Tuzu ve diğer RNA alt tiplerini çıkarmak için 1.2.4 ila 1.2.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
      NOT: Yıkama tamponunun hacmi 300 μL Yıkama Tamponu 1'e ve 150 μL Yıkama Tamponu 2'ye düşürülebilir.
    6. Numune tüpüne 25 μL (istenen hacim) soğuk 10 mM Tris-HCl (Elüsyon tamponu) ekleyin ve 70 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    7. Tüpü hızlı bir şekilde mıknatısın üzerine aktarın ve süspansiyon 20 saniye veya daha uzun bir süre sonra temizlendiğinde, ayrıştırılmış poli (A) ile zenginleştirilmiş RNA içeren süpernatanı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    8. RNA yüksek hassasiyetli tahliller kullanarak RNA miktarının ve kalitesinin kalite değerlendirmesi için 2.2 μL'yi 8 şeritli tüplere aktarın.
    9. Numuneyi kısa süreler için -20 °C'de ve daha uzun süre -70 °C'de saklayın.
      NOT: Bu, protokolde bir duraklama noktası olabilir.

2. Bisülfit dönüşümü

NOT: Santrifüj adımlarının tümü oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Prosedürler esasen üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilir, ancak bisülfit reaksiyonu adım 2.3'ten önce spike-in kontrol mRNA dizi(ler)ini eklemek için ek bir adım 2.2 ile gerçekleştirilir.

  1. 19 μL saflaştırılmış poli(A) ile zenginleştirilmiş RNA örneğini 0,2 mL 8 şeritli bir tüpe aktarın.
  2. Önceden belirlenmiş 1:10.000 miktar oranında herhangi bir modifikasyondan arınmış 1.0 μL spike-in kontrolü ekleyin (yani, 0.1 ng lusiferaz mRNA: 1 μg saflaştırılmış poli(A) zenginleştirilmiş RNA) adım 2.1'in RNA örneğine.
    NOT: Spike-in kontrol dizisi, Ateşböceği lusiferaz RNA, Renilla lusiferaz veya metillenmiş sitozinler içermeyen in vitro kopyalanmış RNA dizisi olabilir.
  3. Tüpe 130 μL dönüşüm regenti ekleyin ve iyice karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.
  4. Tüpü PCR makinesine yerleştirin ve 70 °C'de 10 dakika boyunca üç döngü ısıtma, ardından her biri 64 °C'de 45 dakika inkübe etme ve ardından 4 °C'ye soğuması için son bir adım gerçekleştirin.
  5. Kolonu toplama tüpüne yerleştirin ve 250 μL RNA bağlama tamponunu kolona aktarın.
  6. Numuneyi adım 2.4'ten adım 2.5'teki sütuna aktarın ve iyice pipetleyin.
  7. Kolona 400 μL% 95-100 etanol ekleyin, kapağı hızla kapatın ve birkaç kez ters çevirin.
  8. 25 °C'de 30 saniye boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
  9. Kolona 200 μL RNA yıkama tamponu ekleyin.
  10. 25 °C'de 30 saniye boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
  11. 200 μL desülfonasyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  12. 25 °C'de 30 saniye boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
  13. 400 μL RNA yıkama tamponu ekleyin ve 25 °C'de 30 saniye boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin ve akışı atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
  14. Kalan yıkama tamponunu tamamen çıkarmak için 10.000 × g'da 25 °C'de 2 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    NOT: Elüsyondan 2.14 dakika önce 2 dakika boyunca diğer santrifüjleme adımı, yıkama tamponunu tamamen çıkarmaktır. Yıkama adımı, yüksek tuzlu bileşenin bisülfit reaktifinden ve kolondaki kükürt giderme tamponundan yıkanması için iki kez gerçekleştirilir.
  15. Kolonu yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  16. Kolona 20-30 μL Nükleaz içermeyen H2O ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika bekletin.
  17. 25 °C'de 30 saniye boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin.
  18. RNA miktarı ve kalitesinin değerlendirilmesi için 2.2 μL'yi 8 şeritli tüplere aktarın.
  19. Bisülfit ile muamele edilmiş RNA örneğini kısa süreler için -20 °C'de ve daha uzun bir süre için -70 °C'de saklayın.
    NOT: Bu, protokolde bir duraklama noktası olabilir.

3. Bisülfit ile muamele edilmiş mRNA kütüphanesi hazırlığı

NOT: Saflaştırılmış mRNA veya rRNA'sı tükenmiş RNA ile kullanım için kütüphane hazırlama talimatı protokolü bölüm 4'ü izleyin. Bisülfit tedavisi RNA'yı parçaladığı için ilk hazırlama adımı FFPE RNA protokolünü takip etmelidir. Her adımı laminer akış başlığında gerçekleştirin ve reaksiyon karışımını buzla soğutulmuş bir soğutma rafına ekleyin.

  1. Giriş RNA'sının hazırlanması
    1. İstenilen miktarda bisülfit ile muamele edilmiş mRNA örneğini toplam maksimum 5 μL'de aktarın veya toplam 5 μL yapmak için Nükleaz içermeyenH2Oekleyin.
      NOT: Bu tip RNA kütüphanesi hazırlığı ve 4nM kütüphane ürününün nihai molaritesini oluşturmak için girdi olarak en az 10 ng bisülfit ile muamele edilmiş mRNA önerilir.
    2. Numuneye 1 μL Random primer (leylak) ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
    3. Numune tüpünü 65 °C'de önceden ayarlanmış PCR makinesine ve 105 °C'de 5 dakika süreyle kapağa yerleştirin ve 4 °C'de tutun.
  2. Birinci iplikli cDNA sentezi
    1. Numuneye 4 μL sentez reaksiyon tamponu (leylak), 8 μL iplik özgüllüğü reaktifi (kahverengi) ve 2 μL sentez enzim karışımı (kahverengi) ekleyin, bu da toplam hacim 20 μL'dir. En az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın ve hızla döndürün.
    2. Numune tüpünü 25 dakika boyunca 10 °C, 42 dakika boyunca 50 °C, 70 °C 15 dakika önceden ayarlanmış PCR makinesine yerleştirin ve 4 °C'de tutun.
      NOT: 200 bazın üzerindeki ekler için, 50 dakikalık 42 °C'lik bir inkübasyon süresi önerilir; 200 bazın altındaki kesici uç boyutu için 15 dakikalık 42 °C inkübasyon süresi önerilir.
  3. İkinci iplikli cDNA sentezi
    1. dUTP karışımı (turuncu) ile 8 μL sentez reaksiyonu tamponu, 4 μL sentez enzim karışımı (turuncu) ve 48 μL Nükleaz içermeyen H2O ekleyin.
    2. S'ye yerleştirinamples tüp, kapak kapalıyken veya ≤40 °C iken 1 saat boyunca 16 °C'de önceden ayarlanmış PCR makinesine yerleştirin.
  4. DNA saflaştırma boncukları ile çift sarmallı cDNA'nın saflaştırılması
    1. Saflaştırmayı gerçekleştirmeden 30 dakika önce DNA saflaştırma boncuklarını önceden ısıtın ve boncukları yeniden süspanse etmek için girdap yapın.
    2. Adım 3.3.2'den cDNA örneğine 144 μL yeniden süspanse DNA saflaştırma boncuğu ekleyin ve en az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    4. Numune tüpünü, çözelti berraklaşana kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın ve DNA içeren boncukları saklayın.
    5. Numuneyi manyetik rafta tutarken boncuklarla birlikte tüpe 200 μL taze yapılmış %80 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.
    6. Süpernatanı çıkarın ve adım 3.4.5'i bir kez tekrarlayın, ancak bu sefer kalan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    7. Numuneyi mıknatıs üzerinde tutarken boncukları 1-5 dakika havayla kurutun.
      NOT: Boncukları fazla kurutmayın; Renk koyu kahverengi olmalıdır.
    8. Numuneyi manyetik raftan çıkarın ve boncuklara 53 μL 0.1x TE (10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA, pH 8.0) tamponu ekleyerek DNA'yı elüte edin. En az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    9. Tüpü 5 dakika boyunca veya çözelti berraklaşana kadar manyetik rafa yerleştirin.
    10. Çift sarmallı cDNA içeren 50 μL süpernatantı yeni bir 8 şeritli tüpe aktarın.
      NOT: Protokol bu noktada durdurulabilir ve numune -30 °C'de saklanabilir.
  5. cDNA kütüphanesinin son hazırlığı
    1. Ayrıştırılmış çift sarmallı cDNA örneğine 7 μL uç parlatma Reaksiyon Tamponu (yeşil) ve 3 μL uç parlatma Enzim Karışımı (yeşil) ekleyin.
    2. Karışımı, 50 μL hacim ayarıyla 10x pipetleyerek kabarcık oluşturmadan karıştırın ve ardından numuneyi hızla döndürün.
    3. Numuneyi bir PCR makinesine yerleştirin ve 20 °C'de 30 dakika, 65 °C'de 30 dakika inkübe edin ve 4 °C'de tutun.
  6. Adaptör ligasyonu
    1. Adaptörü (kırmızı) üreticinin talimatlarına göre seyreltin.
    2. Numuneye 2,5 μL seyreltilmiş adaptör, 1 μL ligasyon arttırıcı (kırmızı) ve 30 μL Ligation Master Mix (kırmızı) ekleyin.
    3. Karışımı, kabarcık oluşturmadan 80 μL hacim ayarıyla 10x pipetleyerek karıştırın ve ardından numuneyi hızla döndürün.
    4. Numuneyi bir PCR makinesine yerleştirin ve 20 °C'de 15 dakika inkübe edin.
    5. Numuneye 3 μL urasil DNA glikozilaz ve DNA glikozilaz-liyaz endonükleaz VIII (mavi) karışımı ekleyin ve iyice pipetleyin.
    6. Numuneyi PCR makinesine geri koyun ve kapak 75 °C'ye ayarlanmış olarak 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  7. Ligasyon reaksiyonu ile muamele edilmiş cDNA'ların saflaştırılması
    NOT: SPRIselect Boncuklar veya isteğe bağlı olarak AMpure XP boncukları ile boyut seçimi bu amaç için kullanılabilir18.
    1. Saflaştırmayı gerçekleştirmeden 30 dakika önce boncukları önceden ısıtın ve yeniden süspanse etmek için girdap yapın.
    2. Adım 3.6.6'dan cDNA örneğine 25 μL yeniden süspanse edilmiş boncuk aktarın ve en az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    4. Numune tüpünü, çözelti berraklaşana kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve ardından süpernatanı yeni bir 8 şeritli tüpe aktarın ve boncukları atın.
    5. Süpernatanıma 10 μL yeniden süspanse edilmiş boncuk ekleyin ve en az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.
    6. Numune tüpünü, çözelti berraklaşana kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve ardından süpernatanı atın ve boncukları rahatsız etmeyin.
    7. Numuneyi manyetik rafta tutarken boncuklarla birlikte tüpe 200 μL taze yapılmış %80 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.
    8. Süpernatanı çıkarın ve adım 3.7.7'yi bir kez tekrarlayın, ancak bu sefer kalan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    9. Numuneyi mıknatıs üzerinde tutarken boncukları 1-5 dakika havayla kurutun.
      NOT: Boncukları fazla kurutmayın; Renk koyu kahverengi olmalıdır.
    10. Numuneyi manyetik raftan çıkarın ve boncuklara 17 μL 0.1x TE tamponu ekleyerek DNA'yı elüte edin. En az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    11. Çözelti berraklaşana kadar tüpü 5 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.
    12. Hedef son hazırlanmış dsDNA içeren 15 μL süpernatanı yeni bir 8 şeritli tüpe aktarın.
  8. Adaptör bağlı DNA'nın PCR zenginleştirilmesi
    1. Adaptöre bağlı DNA örneğine 25 μL ana karışım (mavi), 5 μL 5' adaptör primeri ve 5 μL 3' adaptör primeri ekleyin. En az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.
    2. Numuneyi PCR makinesine yerleştirin ve aşağıdaki adımları kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: (1) 98 saniye boyunca 30 °C, (2) 98 saniye boyunca 10 °C, (3) 65 saniye boyunca 75 °C, (4) 65 dakika boyunca 5 °C ve (5) 4 °C'de tutun; (2) ve (3) adımlarının, N'nin kullanım kılavuzundaki RNA giriş miktarına eşit olduğu bir N+2 döngü numarası için tekrarlanması gerektiği. Bu, adım 3.7'de gerçekleştirilen numunelerin çift taraflı boyut seçimi nedeniyle 2 ek döngüye ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir.
      NOT: Örneğin, 9-10 döngü PCR ile 8 ng saflaştırılmış mRNA girişi önerilecektir; ancak adım 3.7'de çift taraflı, boyut seçilmiş, bağlanmış cDNA ile önerilen PCR döngüsü 11-12 döngü olacaktır.
  9. PCR ile güçlendirilmiş kütüphanelerin saflaştırılması
    1. Saflaştırmayı gerçekleştirmeden önce DNA saflaştırma boncuklarını 30 dakika önceden ısıtın ve boncukları yeniden süspanse etmek için girdap yapın.
    2. Adım 3.8.2'den itibaren 45 μL (0,9x) yeniden süspanse edilmiş boncukları PCR ürününe aktarın ve en az 10x pipetleyerek iyice karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    4. Numune tüpünü, çözelti berraklaşana kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın ve DNA içeren boncukları saklayın.
    5. Boncuklarla birlikte tüpe 200 μL taze yapılmış %80 etanol ekleyin, numuneyi manyetik rafta bırakın ve oda sıcaklığında 30 saniye bekletin.
    6. Süpernatanı çıkarın ve adım 3.9.5'i bir kez tekrarlayın, ancak bu sefer kalan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    7. Numuneyi mıknatıs üzerinde tutarken boncukları 1-5 dakika havayla kurutun.
      NOT: Boncukları fazla kurutmayın; Renk koyu kahverengi olmalıdır.
    8. Numuneyi manyetik raftan çıkarın ve DNA'yı ayrıştırmak için boncuklara 22 μL 0.1x TE tamponu ekleyin. En az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    9. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve 5 dakika veya çözelti oda sıcaklığında berraklaşana kadar bekletin.
    10. 20 μL süpernatanı yeni bir 8 şeritli tüpe aktarın.
    11. Kütüphane miktarının ve kalitesinin kalite değerlendirmesi için 2,2 μL'yi 8 şeritli tüplere aktarın.
      NOT: Kütüphanenin miktarı qPCR ile de tespit edilebilir ( Materyal Tablosuna bakınız).
    12. bsRNA-seq kitaplığı örneğini -20 °C'de saklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu rapordaki prosedürler izlenerekhücre hatları 19'dan bir dizi bsRNA-seq kütüphanesi oluşturulmuştur (Şekil 1). Hücre hattı numuneleri üzerinde gerçekleştirilen DNaz işlemi ile birlikte toplam RNA saflaştırmasından ve jel elektroforezi ve UV-Vis spektrofotometrisi (A260/A280) ile kalite kontrolünden sonra, RNA numunesi poli(A) RNA zenginleştirmesine geçebilir. Çift saflaştırmanın ribozomal RNA'nın çoğunluğunu çıkarıp ç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolde, standartlaştırılmış bileşenler kullanılarak ayrıntılı bir poli(A) zenginleştirme, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlama hattı elde edildi. Daha ileri dizileme analizi, ilgilenilen örneklerde mRNA 5-metilsitozinin tanımlanmasını sağladı.

Kritik adım, başlangıç materyalinin kalitesidir - toplam RNA - çünkü RNA'nın bozunması poli (A) RNA saflaştırmasının geri kazanım oranını etkileyecektir. Poli(A) RNA saflaştırma adımını gerçekle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi tarafından desteklenmiştir. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer SystemAgilent, Santa Clara, CARNA quality detection
AMpure XP beadsBeckman CoulterA63881purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kitAgilent, Santa Clara, CA5067-4626DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kitAgilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rackDiagenode, Denville, NJB04000001assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rackDiagenode, Denville, NJB04000003assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kitThermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
EthanolJ.T.Baker64-17-5
EZ RNA methylation kitZymo, Irvine, CAR5002bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNAPromega, Madison, WI, USAL4561spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification KitsRoche, SwitzerlandKK4824library quantification
Nanodrop spectrophotometerThermo Fisher Scientific, Waltham, MATotal RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)New England Biolabs, Ipswich, MAE7335Slibrary preparation
NEBNext Ultra figure-materials-1690 Directional RNA Library Prep Kit for IlluminaNew England Biolabs, Ipswich, MAE7760Slibrary preparation
Nuclease-free WaterThermo Fisher ScientificAM9932
P2 pipetmanThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Qubit 2.0 fluorometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MARNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852RNA quantity detection

Referanslar

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102(2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1(2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40(2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606(2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

MRNA Zenginle tirmeBis lfit mRNA K t phanesi Haz rlamaYeni Nesil DizilemeRNA Transkripsiyon Sonras ModifikasyonlarRNA Reg lasyonukaryotik H crelerRNA 5 metilsitozin ModifikasyonlarRNA MetiltransferazlarHastal klarKanserlerTranskriptom ap nda Bis lfit DizilemeSitozin Metilasyon SeviyeleriPoli A RNA Safla t rmaBis lfit ReaksiyonuK t phane Haz rlamaMRNA 5 metilsitozin Modifikasyon B lgeleriRNA Miktar ve Kalite De erlendirmesiRNA B t nl zlemeY ksek Kalite S ralama Kitapl klar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır