Enriquecimiento de la biblioteca de ARNm y bisulfito-ARNm para la secuenciación de nueva generación

Resumen

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo fácil de seguir para llevar a cabo la purificación del ARN poli(A), la conversión de bisulfito y la preparación de bibliotecas utilizando equipos estandarizados para una muestra biológica de interés.

Resumen

Las modificaciones postranscripcionales del ARN en varios tipos de transcripciones de ARN se asocian con una regulación diversa del ARN en las células eucariotas. Se ha demostrado que las modificaciones aberrantes del ARN 5-metilcitosina y la expresión desregulada de las metiltransferasas de ARN están asociadas con diversas enfermedades, incluidos los cánceres. Se desarrolló la secuenciación de bisulfito en todo el transcriptoma para caracterizar las posiciones y los niveles cuantitativos de metilación de citosina en el ARN convertido en bisulfito a la resolución de pares de bases. En este documento, este protocolo presenta los procedimientos de dos rondas de purificación de ARN poli(A), tres ciclos de reacción de bisulfito y la preparación de la biblioteca en detalle para permitir el mapeo de todo el transcriptoma de los sitios de modificación del ARNm 5-metilcitosina. La evaluación de la cantidad y calidad del ARN después de la reacción principal es esencial para controlar la integridad del ARN y es un paso crítico para garantizar bibliotecas de secuenciación de alta calidad. Lo ideal es que los procedimientos se puedan completar en tres días. Con este protocolo, el uso de ARN total de alta calidad como entrada puede crear bibliotecas robustas de bisulfito-ARNm para la secuenciación de próxima generación a partir de la muestra de interés.

Introducción

Entre los más de 150 tipos de modificaciones postranscripcionales¹, se ha identificado la modificación de la 5-metilcitosina (m⁵C) en varios tipos de ARN, incluidos el ARN ribosómico, el ARN de transferencia, el ARN mensajero, el micro ARN, el ARN largo no codificante, el ARN de bóveda, el ARN potenciador y los ARN pequeños específicos del cuerpo^{cajal 2}. El ARN m 5 C se asocia con diversos mecanismos biológicos y patológicos, como la regulación del desarrollo radicular de las plantas³, la expresión génica viral⁴ y la progresión del cáncer⁵.

Protocolo

1. Purificación de ARN poli(A)

NOTA: Utilice el ARN total tratado con DNasa I y examine la calidad e integridad del ARN total mediante la evaluación de electroforesis en gel capilar o convencional antes de proceder a la purificación del ARN poli(A). Los investigadores deberían ser capaces de identificar las bandas ribosómicas de ARNr 28S y 18S en el campo de alto peso molecular y la banda de ARNr 5,8S en el campo de bajo peso molecular sin ninguna banda de frotis significativa en el electroferograma. Los pasos de purificación siguen esencialmente las instrucciones del fabricante con pequeñas modificaciones indicadas en los pa....

Discusión

En este protocolo, se logró una línea detallada de enriquecimiento de poli(A), conversión de bisulfito y preparación de bibliotecas mediante la utilización de componentes estandarizados. Un análisis de secuenciación adicional proporcionó la identificación de ARNm 5-metilcitosina en muestras de interés.

El paso crítico es la calidad del material de partida (ARN total), ya que la degradación del ARN afectaría la tasa de recuperación de la purificación del ARN poli(A). La muestra d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection