차세대 염기서열분석을 위한 mRNA 및 Bisulfite-mRNA 라이브러리 준비 농축

요약

이 프로토콜은 관심 생물학적 샘플에 대해 표준화된 장비를 사용하여 poly(A) RNA 정제, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비를 수행하기 위한 따라하기 쉬운 워크플로우를 제공합니다.

초록

다양한 유형의 RNA 전사체에서 RNA 전사 후 변형은 진핵 세포의 다양한 RNA 조절과 관련이 있습니다. 비정상적인 RNA 5-메틸시토신 변형과 RNA 메틸전이효소의 조절 장애 발현은 암을 포함한 다양한 질병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능에서 중아황산염 변환 RNA의 위치와 정량적 사이토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 이 프로토콜은 mRNA 5-메틸시토신 변형 부위의 전사체 전체 매핑을 허용하기 위해 2라운드의 폴리(A) RNA 정제, 3주기의 중아황산염 반응 및 라이브러리 준비 절차를 자세히 제시합니다. 주요 반응 후 RNA의 양과 질을 평가하는 것은 RNA 무결성을 모니터링하는 데 필수적이며 고품질 염기서열분석 라이브러리를 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 이상적으로는 3일 이내에 절차를 완료할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고품질 total RNA를 입력으로 사용하면 관심 샘플에서 차세대 염기서열분석을 위한 강력한 bisulfite-mRNA 라이브러리를 실질적으로 구축할 수 있습니다.

서문

150가지 이상의 전사 후 변형(post-transcriptional modifications)¹ 중 5-메틸시토신(^m5C) 변형은 리보솜 RNA, 전달 RNA, 메신저 RNA, 마이크로 RNA, 긴 비코딩 RNA, 금고 RNA, 인핸서 RNA, 작은 카잘체 특이적 RNA를 포함한 다양한 유형의 RNA에서 확인되었습니다². RNA m 5 C는 식물 뿌리 발달 조절³, 바이러스 유전자 발현⁴ 및 암 진행⁵과 같은 다양한 생물학적 및 병리학적 메커니즘과 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 다양한 발달 단계 또는 질병 환경에서 생물학적 샘플의 전사체 전체 mRNA m^5C변형 프로파일을 특성화하기 위한 간소화된 파이프라인을 제공하는 것입니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능 6,7,8,9에서 중아황산염 변환 RNA의 위치 및 정량적 시토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다.....

프로토콜

1. Poly(A) RNA 정제

참고: 폴리(A) RNA 정제를 진행하기 전에 DNase I으로 처리된 total RNA를 사용하고 모세관 또는 기존 겔 전기영동 평가를 통해 전체 RNA 품질 및 무결성을 검사합니다. 조사관은 고분자량 분야에서 28S 및 18S rRNA 리보솜 밴드를 식별하고 저분자량 필드에서 5.8S rRNA 밴드를 식별하여 전기 페로그램에서 중요한 도말 밴드를 식별할 수 있어야 합니다. 정제 단계는 기본적으로 특정 단계에 표시된 약간의 수정과 함께 제조업체의 지침을 따릅니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 도구와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 준비
   1. 시약, 세척 완충액, 올리고(dT) 비드 및 용해 완충액을 실온에서 30분 동안 예열한 후 다음 절차를 수행합니다.
   2. 폴리(A)-농축 RNA의 분리를 위해 적절한 양의 RNA를 뉴클레아제가 없는 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮겨 10-20μg의 고품질 total RNA 분취액을 출발 물질로 준비합니다. 70°C 의 열 블록에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에서 2 분 동안 유지합니다.....

토론

이 프로토콜에서는 표준화된 구성 요소를 활용하여 폴리(A) 농축, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비의 상세한 파이프라인을 달성했습니다. 추가 염기서열분석 분석을 통해 관심 샘플에서 mRNA 5-methylcytosine을 식별할 수 있었습니다.

중요한 단계는 RNA의 분해가 poly(A) RNA 정제의 회수율에 영향을 미치기 때문에 출발 물질-총 RNA의 품질입니다. poly(A) RNA 정제 단계를 수행하기 전?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection