mRNA和亚硫酸氢盐-mRNA文库的富集制备用于二代测序

摘要

该协议提供了一种易于遵循的工作流程，可使用标准化设备对感兴趣的生物样品进行poly（A）RNA纯化、亚硫酸氢盐转化和文库制备。

摘要

各种类型的 RNA 转录本中的 RNA 转录后修饰与真核细胞中的多种 RNA 调控有关。异常的 RNA 5-甲基胞嘧啶修饰和 RNA 甲基转移酶的失调表达已被证明与包括癌症在内的多种疾病有关。开发了全转录组亚硫酸氢盐测序，以表征亚硫酸氢盐转化的 RNA 在碱基对分辨率下的位置和定量胞嘧啶甲基化水平。在此，该协议详细介绍了两轮poly（A）RNA纯化，三个亚硫酸氢盐反应循环和文库制备的程序，以允许mRNA 5-甲基胞嘧啶修饰位点的转录组范围定位。主反应后RNA数量和质量的评估对于监测RNA完整性至关重要，也是确保高质量测序文库的关键步骤。理想情况下，这些程序可以在三天内完成。通过该方案，使用高质量的总RNA作为输入，实际上可以建立强大的亚硫酸氢盐-mRNA文库，用于从目标样品进行二代测序。

引言

在 150 多种转录后修饰¹ 中，已在各种类型的 RNA 中鉴定出 5-甲基胞嘧啶 （m⁵C） 修饰，包括核糖体 RNA、转移 RNA、信使 RNA、micro RNA、长链非编码 RNA、vault RNA、增强子 RNA 和小 cajal 体特异性 RNA²。RNA m 5 C 与多种生物学和病理机制有关，例如调节植物根系发育³、病毒基因表达⁴ 和癌症进展⁵。该协议的目的是提供简化的管道，以表征处于不同发育阶段或疾病环境中的生物样品的转录组范围的mRNA m⁵C修饰谱。开发了全转录组亚硫酸氢盐测序来表征亚硫酸氢盐转化 RNA 中碱基对分辨率^{为 6}、^7、8、9 的位置和定量胞嘧啶甲基化水平。这在研究 m⁵C 与参与细胞生物调控机制的基因表达和 RNA 命运的关联时特别有用。在哺乳动物细胞中，有两种已知的 m 5 C 读取器：ALYREF 可以识别细胞核的....

研究方案

1. Poly（A） RNA纯化

注：在进行poly（A） RNA纯化之前，使用用DNase I处理的总RNA，并通过毛细管或常规凝胶电泳评估检查总RNA的质量和完整性。研究人员应该能够识别高分子量场中的 28S 和 18S rRNA 核糖体条带以及低分子量场中的 5.8S rRNA 带，而电泳图中没有任何明显的拖尾带。纯化步骤基本上遵循制造商的说明，并在特定步骤中进行了细微的修改。有关本协议中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 制备
   1. 在进行以下程序之前，在室温下预热试剂、洗涤缓冲液、oligo（dT）珠子和裂解缓冲液30分钟。
   2. 为了分离富集poly（A）的RNA，通过将足量的RNA转移到无核酸酶的1.5mL微量离心管中，制备10-20μg高质量总RNA的等分试样作为起始原料。在 70°C 的加热块中孵育5分钟，然后在冰上保持2 分钟。
      注：作为起始材料的总RNA的量应根据所需的mRNA量和所用细胞的性质进行适当调整。根据经验，富集poly（A）的RNA可能占总RNA丰度的1-5%。10 μg 高质量总 RNA 的等分试样应提供 100-500 ng 范围内的高质量富集 poly（A） RNA，用于下游亚硫酸氢盐转化。
   3. 同时，完全重悬oligo....

讨论

在该协议中，通过使用标准化组件实现了聚（A）富集，亚硫酸氢盐转化和文库制备的详细流程。进一步的测序分析提供了目标样品中mRNA 5-甲基胞嘧啶的鉴定。

关键步骤是起始材料（总RNA）的质量，因为RNA的降解会影响poly（A） RNA纯化的回收率。在进行poly（A） RNA纯化步骤之前，应小心处理样品并避免RNase污染。该过程的另一个关键部分是文库制备中的PCR循环次数。循环数的?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection