Arricchimento di mRNA e preparazione della libreria bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile da seguire per condurre la purificazione dell'RNA poli(A), la conversione del bisolfito e la preparazione della libreria utilizzando apparecchiature standardizzate per un campione biologico di interesse.

Abstract

Le modificazioni post-trascrizionali dell'RNA in vari tipi di trascritti di RNA sono associate a diverse regolazioni dell'RNA nelle cellule eucariotiche. È stato dimostrato che le modificazioni aberranti dell'RNA 5-metilcitosina e l'espressione disregolata delle metiltransferasi dell'RNA sono associate a varie malattie, compresi i tumori. Il sequenziamento del bisolfito a livello di trascrittoma è stato sviluppato per caratterizzare le posizioni e i livelli quantitativi di metilazione della citosina nell'RNA convertito in bisolfito alla risoluzione della coppia di basi. In questo documento, questo protocollo presenta in dettaglio le procedure di due cicli di purificazione del poli(A) RNA, tre cicli di reazione del bisolfito e la preparazione della libreria per consentire la mappatura a livello di trascrittoma dei siti di modificazione dell'mRNA 5-metilcitosina. La valutazione della quantità e della qualità dell'RNA dopo la reazione principale è essenziale per monitorare l'integrità dell'RNA ed è un passaggio fondamentale per garantire librerie di sequenziamento di alta qualità. Idealmente, le procedure possono essere completate entro tre giorni. Con questo protocollo, l'utilizzo di RNA totale di alta qualità come input può praticamente costruire robuste librerie di bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione dal campione di interesse.

Introduzione

Tra oltre 150 tipi di modificazioni post-trascrizionali¹, la modificazione della 5-metilcitosina (m⁵C) è stata identificata in vari tipi di RNA, tra cui l'RNA ribosomiale, l'RNA di trasferimento, l'RNA messaggero, il micro RNA, l'RNA lungo non codificante, l'RNA del vault, l'RNA enhancer e i piccoli RNA specifici del corpo cajal². L'RNA m 5 C è associato a diversi meccanismi biologici e patologici come la regolazione dello sviluppo delle radici delle piante³, l'espressione genica virale⁴ e la progressione del cancro⁵. Lo scopo d....

Protocollo

1. Purificazione dell'RNA di poli(A)

NOTA: Utilizzare l'RNA totale trattato con DNasi I ed esaminare la qualità e l'integrità dell'RNA totale mediante valutazione dell'elettroforesi capillare o su gel convenzionale prima di procedere alla purificazione dell'RNA poli(A). I ricercatori dovrebbero essere in grado di identificare le bande ribosomiali dell'rRNA 28S e 18S nel campo ad alto peso molecolare e la banda dell'rRNA 5,8S nel campo a basso peso molecolare senza bande di striscio significative nell'elettroferogramma. Le fasi di purificazione seguono essenzialmente le istruzioni del produttore con piccole modifiche indicate ....

Discussione

In questo protocollo, è stata ottenuta una pipeline dettagliata di arricchimento di poli(A), conversione di bisolfito e preparazione della libreria utilizzando componenti standardizzati. Ulteriori analisi di sequenziamento hanno fornito l'identificazione dell'mRNA 5-metilcitosina nei campioni di interesse.

Il passaggio critico è la qualità del materiale di partenza, l'RNA totale, poiché la degradazione dell'RNA avrebbe un impatto sul tasso di recupero della purificazione dell'RNA poli(A). .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection