قياس استهلاك O2 في ذبابة الفاكهة الميلانية باستخدام قياس التنفس المجهري بقياس الكولوم

Summary

قياس التنفس بقياس الكولوم مثالي لقياس معدل الأيض للكائنات الحية الدقيقة. عند تكييفه مع ذبابة الفاكهة الميلانية في الدراسة الحالية ، كان استهلاك O₂ المقاس ضمن النطاق الذي تم الإبلاغ عنه للنوع البري D. melanogaster من خلال الدراسات السابقة. كان استهلاك O₂ لكل ذبابة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر حجما وأقل نشاطا ، أقل بكثير من النوع البري.

Abstract

قياس التنفس الدقيق للكولوم هو طريقة مباشرة وغير مكلفة لقياس استهلاك O₂ للكائنات الحية الصغيرة مع الحفاظ على بيئة مستقرة. يتكون مقياس التنفس المجهري الكولوم من غرفة محكمة الإغلاق يتم فيها استهلاك O 2 ويتم إزالة CO₂ الذي ينتجه الكائن الحي بواسطة وسيط ماص. يؤدي انخفاض الضغط الناتج إلى إنتاج O 2 كهربائيا ، ويتم قياس كمية O₂ المنتجة عن طريق تسجيل كمية الشحنة المستخدمة لتوليدها. في هذه الدراسة ، تم تكييف الطريقة مع ذبابة الفاكهة الميلانية التي تم اختبارها في مجموعات صغيرة ، مع حساسية الجهاز والظروف البيئية المحسنة لتحقيق ثبات عالي. تتوافق كمية O₂ التي يستهلكها الذباب البري في هذا الجهاز مع تلك التي تم قياسها بواسطة الدراسات السابقة. لم يكن استهلاك O₂ الخاص بالكتلة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر ومعروفة بأنها أقل نشاطا ، مختلفا عن الضوابط المتجانسة. ومع ذلك ، أدى صغر حجم طفرات CASK إلى انخفاض كبير في استهلاك O₂ على أساس كل ذبابة. لذلك ، فإن مقياس التنفس الدقيق قادر على قياس استهلاك O₂ في D. melanogaster ، ويمكنه التمييز بين الاختلافات المتواضعة بين الأنماط الجينية ، ويضيف أداة متعددة الاستخدامات لقياس معدلات الأيض.

Introduction

القدرة على قياس معدل الأيض أمر بالغ الأهمية لفهم كامل للكائن الحي في سياقه البيئي. على سبيل المثال ، من الضروري قياس معدل الأيض من أجل فهم دوره في العمر¹ ، أو دور النظام الغذائي في التمثيل الغذائي² ، أو عتبة الإجهاد نقص الأكسجين³.

هناك طريقتان عامتان لقياس معدل الأيض⁴. يقيس القياس الحراري المباشر إنفاق الطاقة مباشرة عن طريق قياس إنتاج الحرارة. يقيس القياس الحراري غير المباشر إنتاج الطاقة من خلال وسائل أخرى ، غالبا عن طريق القياس التنفسي لاستهلاك O₂ (V_O2) أو إنتاج CO₂ أو كليهما. على الرغم من تطبيق القياس الحراري ال....

Protocol

1. تربية الذباب والجمع

1. الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية في قوارير ضيقة تحتوي على طعام ذبابة الفاكهة القياسية.
   ملاحظة: يجب أن يشتمل حجم العينة لكل نمط وراثي على تسع نسخ متماثلة على الأقل ، تتكون كل منها من غرفة قياس تنفس واحدة تحتوي على 15-25 ذبابة ، تم إعدادها على النحو المبين أدناه.
2. نقل الذباب كل 2-3 أيام.
3. تخدير الذباب باستخدام CO₂ ، وجمع مجموعات من 15-25 ذكرا من كل نمط وراثي ، ووضع كل مجموعة في قوارير طعام طازجة غير مخبوزة.
   ملاحظة: تم استخدام الذكور لتقليل التباين بسبب الحالة الإنجابية. تنطبق الطريقة على كلا الجنسين.
4. اسمح للذباب بالتعافي عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.

النتائج

يتم عرض الضغط ومخرجات التيار لوحدة التحكم في مقياس التنفس لغرفة واحدة في تجربة واحدة في الشكل 3 أ. ضغطت النبضة الأولى الطويلة الحالية على الغرفة من الضغط المحيط (حوالي 992 هيكتوباسكال) إلى عتبة إيقاف التشغيل المحددة مسبقا البالغة 1017 هيكتوباسكال. عندما استهلك الذباب O 2 وتم ام?.......

Discussion

يوضح الإجراء أعلاه قياس استهلاك O₂ في D. Melanogaster باستخدام مقياس التنفس المجهري الكولومتري الإلكتروني. كانت البيانات الناتجة عن استهلاك O₂ في D. melanogaster من النوع البري ضمن النطاقات الموصوفة في معظم المنشورات السابقة باستخدام طرق متنوعة (الجدول 1) على الرغم من أنها .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers