Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Özet

Kulometrik respirometri, küçük organizmaların metabolik hızını ölçmek için idealdir. Bu çalışmada Drosophila melanogaster için uyarlandığında, ölçülen_O2 tüketimi, önceki çalışmalarda vahşi tip D. melanogaster için bildirilen aralık içindeydi. Daha küçük ve daha az aktif olan CASK mutantları tarafından sinek başına_O2 tüketimi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktü.

Özet

Kulometrik mikrorespirometri, istikrarlı bir ortamı korurken küçük organizmaların_O2 tüketimini ölçmek için basit ve ucuz bir yöntemdir. Bir kulometrik mikrorespirometre,_O2'nin tüketildiği ve organizma tarafından üretilen CO_2'nin emici bir ortam tarafından uzaklaştırıldığı hava geçirmez bir odadan oluşur. Ortaya çıkan basınç düşüşü elektrolitik O2 üretimini tetikler ve üretilen_O2 miktarı, onu üretmek için kullanılan yük miktarı kaydedilerek ölçülür. Bu çalışmada yöntem, aparatın hassasiyeti ve yüksek stabilite için optimize edilmiş çevresel koşullar ile küçük gruplar halinde test edilen Drosophila melanogaster'e uyarlanmıştır. Bu aparattaki yabani tip sinekler tarafından tüketilen O₂ miktarı, önceki çalışmalarla ölçülenle tutarlıdır. Daha küçük ve daha az aktif olduğu bilinen CASK mutantları tarafından kütleye özgü_O2 tüketimi, konjenik kontrollerden farklı değildi. Bununla birlikte, CASK mutantlarının küçük boyutu, uçuş başına_O2 tüketiminde önemli bir azalmaya neden oldu. Bu nedenle, mikrorespirometre D. melanogaster'de _O2 tüketimini ölçebilir, genotipler arasındaki mütevazı farklılıkları ayırt edebilir ve metabolik hızları ölçmek için çok yönlü bir araç ekler.

Giriş

Metabolik hızı ölçme yeteneği, bir organizmanın çevresel bağlamında tam olarak anlaşılması için çok önemlidir. Örneğin, yaşam süresi^1'deki rolünü, diyetin metabolizmadaki^{rolünü 2} veya hipoksik stres eşiğini³ anlamak için metabolik hızı ölçmek gerekir.

Metabolizma hızını ölçmek için iki genel yaklaşım vardır⁴. Doğrudan kalorimetri, ısı üretimini ölçerek doğrudan enerji harcamasını ölçer. Dolaylı kalorimetri, enerji üretimini başka yollarla, genellikle O 2 tüketiminin (V_O2), CO₂ üretiminin veya her ikisinin respirometrik ölçümü yoluyla ölçer. Drosophila melanogaster⁵ dahil olmak üzere küçük ektotermlere doğrudan kalorimetri uygulanmış olsa da, respirometri teknik olarak daha basittir ve daha yaygın olarak kullanılır.

Yabani tip ve mutant D. melanogaster'de metabolik hızı ölçmek için çeşitli respirometri formları başarıyla kullanılmış ve sıcaklık⁶, sosyal çevre 3, diyet ^{3,7 ve} nörogelişimsel bozuklukların⁸ metabolik etkileri hakkında fikir vermiştir. Bunlar, maliyet ve karmaşıklık açısından önemli ölçüde farklılık gösteren iki sınıfa ayrılır. Manometri, sineklerin bir CO₂ emici içeren ve ince bir kılcal damar yoluyla bir sıvı rezervuarına bağlanan kapalı bir odaya yerleştirildiği en basit ve en ucuz ^9,10'dur. O 2 tüketildikçe ve CO₂ emildikçe, odadaki basınç azalır ve sıvı kılcal damara çekilir. Kılcal damarın sıvı dolu hacmi bu nedenle V_O2 ile orantılıdır. Kılcal damardaki sıvının uyguladığı kuvveti telafi eden daha ayrıntılı versiyonlar da D. melanogaster 1'de kullanılmıştır. Manometri, basit ve ucuz olma avantajlarına sahiptir, ancak basınca duyarlı olduğu için sabit çevre koşulları gerektirir. Ayrıca, tüketilen O2 yerine konmadığı için, O2'nin (P_O2) kısmi basıncı odaların içinde kademeli olarak azalır.

Gaz analizi kullanan respirometri de D. melanogaster için düzenli olarak kullanılmaktadır. Bu durumda, gazlar sinek içeren kapalı odalardan düzenli aralıklarla örneklenir ve bir kızılötesi analizöre^{gönderilir 2,6,11}. Bu tip aparatlar, ticari olarak temin edilebilmesi, çevresel koşullara daha az duyarlı olması ve numune alma sırasında gazların yenilenmesi ve böylece P_O2'nin stabil kalması gibi avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, ekipmanın çalıştırılması pahalı ve karmaşık olabilir.

Yakın zamanda geliştirilen bir kulometrik mikrorespirometre¹², mevcut sistemlere ucuz, hassas ve istikrarlı bir alternatif sunar. Uygulamada, bir organizma_O2 tükettiği hava geçirmez bir odaya yerleştirilir ve solunan CO₂ emici bir malzeme tarafından uzaklaştırılır, bu da oda basıncında net bir azalmaya neden olur. İç basınç önceden ayarlanmış bir eşiğe (AÇIK eşik) düştüğünde, akım bir elektrolitik_O2 jeneratöründen geçirilir ve basıncı elektrolizi durduran ikinci bir eşiğe (OFF-eşik) döndürür. O₂ jeneratörü boyunca yük transferi, odayı yeniden basınçlandırmak için gereken O2 miktarı ile doğru orantılıdır ve bu nedenle organizma⁴ tarafından tüketilen_O2'yi ölçmek için kullanılabilir. Yöntem oldukça hassastır, V O2'yi hassas bir şekilde ölçer ve O2'nin düzenli olarak değiştirilmesi, P_O2'yi saatler veya günler boyunca neredeyse sabit bir seviyede tutabilir.

Bu çalışmada kullanılan kulometrik mikrorespirometre, çok modlu (basınç, sıcaklık ve nem) bir elektronik sensör kullanır. Sensör, basınçtaki küçük değişiklikleri algılayan ve düşük basınç eşiğine¹² ulaşıldığında_O2 üretimini etkinleştiren bir mikrodenetleyici tarafından çalıştırılır. Bu aparat raf parçalarından monte edilir, çok çeşitli odalar ve deney ortamları ile kullanılabilir ve vücut kütlesi ve sıcaklığının Tenebrio molitor böceği üzerindeki etkilerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışmada, mikrorespirometre, T. molitor kütlesinin yaklaşık% 1'ine sahip olan D. melanogaster'de _O2 tüketimini ölçmek için uyarlanmıştır. O2 üretimini aktive etme eşiği düşürülerek aparatın hassasiyeti arttırılmıştır ve sıcaklık kontrollü bir su banyosunda deneyler yapılarak ve odaların içindeki nem% 100 veya buna yakın tutularak çevresel stabilite arttırılmıştır.

Membranla ilişkili guanilat kinazlar (MAGUK) ailesinin bir parçası olan CASK (Calmodulin'e bağımlı Serin Protein Kinaz) proteini, farklı çoklu protein komplekslerinde moleküler bir iskeledir ve CASK'deki mutasyonlar, insanlarda ve D. melanogaster'de nörogelişimsel bozukluklarla ilişkilidir ^13,14. Canlı bir D. melanogaster mutantı, CASK^Δ18, dopaminerjik nöronların 15 aktivitesini bozar ve konjenik kontrollere kıyasla aktivite seviyelerini %50'den fazla azaltır^14,16. CASK mutantlarının azalmış aktivite seviyeleri ve katekolaminlerin metabolizmayı düzenlemedeki rolü¹⁷ nedeniyle, standart metabolik hızlarının ve dolayısıyla_O2 tüketiminin kontrollere kıyasla önemli ölçüde azalacağını varsaydık.

_O2 tüketimi CASK^Δ18 ve bunların vahşi tip türdeşleri w(ex33) cinsinden ölçülmüştür. Sinek grupları respirometri odalarına yerleştirildi, O 2 tüketimi ölçüldü, O₂ tüketimi hesaplandı ve hem kütleye özgü hem de sinek başına ifade edildi. Cihaz, önceki çalışmalarla tutarlı olan vahşi tip sineklerde V O2 kaydetti ve vahşi tip ve CASK mutant sineklerinin sinek başına_O2 tüketimini ayırt edebildi.

Protokol

1. Sinek yetiştirme ve toplama

1. Sinekleri 25 °C'de standart Drosophila gıdası içeren dar şişelerde muhafaza edin.
   NOT: Her genotip için numune büyüklüğü, her biri aşağıda açıklandığı gibi kurulmuş 15-25 sinek içeren tek bir respirometre odasından oluşan en az dokuz kopyadan oluşmalıdır.
2. Sinekleri 2-3 günde bir aktarın.
3. CO₂ ile sinekleri uyuşturun, her genotipten 15-25 erkekten oluşan grupları toplayın ve her grubu taze, mayasız gıda şişelerine yerleştirin.
   NOT: Üreme durumuna bağlı değişkenliği azaltmak için erkekler kullanılmıştır. Yöntem her iki cinsiyet için de geçerlidir.
4. Sineklerin 25 °C'de en az 24 saat iyileşmesine izin verin.
   NOT: Deney sırasında sinekler 1-4 günlük olmalıdır. Adım 1.3'te açıklanan toplama sıklığı, sineklerin yaş aralığını daraltmak için ayarlanabilir.

2. Respirometre odasının kurulumu ve montajı

1. Su banyosunu açın ve deney için istenen sıcaklığa ayarlayın.
   NOT: Aşağıdaki deneyler 25 °C'de 50 mL Schlenk tüpleri kullanılarak oda olarak gerçekleştirilmiştir. Bileşenler, Şekil 1A, 1B ve 1C'de gösterildiği gibi monte edilmelidir.
2. Bir laboratuvar bezine (doğrudan eklemin üzerine değil) %70 etanol püskürterek ve sensör tapasındaki tozu ve eski gresi silerek odaların ve sensör tapalarının buzlu cam bağlantılarını iyice temizleyin (Şekil 1A). Etanolü yeni bir laboratuvar mendiliyle silin.
3. Nemi stabilize etmek için haznenin dibine arıtılmış suya batırılmış 1 cm'lik pamuk rulosu yerleştirin.
   1. Pamuk rulosunun dibinde küçük bir havuz oluşturacak kadar su (~0,5 mL) ekleyin.
4. Haznenin eklemine dökülen suyu silin.
5. Sinekleri bir huni kullanarak etiketli polipropilen tüplere aktarın.
   1. Tüpü pamuklu bir rulo ile takın.
      NOT: Tüpler, 5,5 cm uzunluğa kadar kesilmiş ve deney odası ile serbest hava değişimine izin vermek için sıcak bir bıçakla delinmiş 5 mL'lik bir polipropilen test tüpünden oluşur. CO₂ anestezisinin metabolik anormalliklere neden olduğu bilinmektedir, bu nedenle sinekler anestezi olmadan transfer edilir ve bu da sinekleri kaybetmemek için daha fazla özen gerektirir.
6. Her respirometre odasına (ıslak pamuğun üstüne) sinekli bir havalandırmalı tüp ekleyin.
7. Soda kireç kartuşlarını (tüp başına 4-5 topak) doldurun ve haznenin içindeki sinekleri içeren tüpün üstüne yerleştirin.
   NOT: Soda kireç kartuşları, elektrikli matkapla 4-5 kez delinmiş 800 μL santrifüj tüplerinden oluşur.
8. O₂ jeneratörlerini havalandırma delikleri seviyesinin altında doymuş bakır sülfat (CuS04) çözeltisi ile doldurun
   NOT: O₂ jeneratörleri, dişlerin altına 4 delik açılmış vidalı kapaklı santrifüj tüplerinden oluşur. Platin (Pt) ve Bakır (Cu) elektrotlar iki pimli konektöre lehimlenir, kapakta açılan deliklere yerleştirilir ve epoksi ile yapıştırılır. _CuS04'ün elektrolizi, deney organizması tarafından tüketilen_O2'yi üretir. _CuS04 omurgasızlar için toksiktir, dökülmeleri veya sızıntıları önleyin ve hemen temizleyin.
9. Doldurulmuş O₂ jeneratörünü sensör fişindeki iki pimli konektöre bağlayın.
   NOT: Bakır katot, kontrolörün negatif çıkışı ve platin anot ile pozitif kabloya bağlanmalıdır. Ters bağlantılar, denemenin başarısız olmasına neden olur.
10. Sensör tapasının buzlu cam bağlantısının karşı taraflarına iki küçük damla şeffaf silikon gres yerleştirin.
11. Tapayı hazneye yerleştirin ve mafsaldaki gresi yaymak için tapayı (veya hazneyi) orta basınçla döndürün.
    1. Fazla gresi bir laboratuvar bezi ile silin.
12. Haznelerdeki tapaları sabitlemek için plastik Keck kelepçelerini eklemlere takın. Monte edilen oda Şekil 1C'deki gibi görünmelidir.
13. Günün deneyi için kullanılan oda sayısı için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Kaydedilebilecek oda sayısı, bilgisayardaki kullanılabilir odacıkların, denetleyicilerin ve USB girişlerinin sayısıyla sınırlıdır. Mevcut deneyler için, yedi oda normalde paralel olarak çalıştırıldı. Mutantlar gibi deneysel sinekler uygun kontrollerle eşleştirilmelidir. Aynı şekilde kurulmuş ancak sinekler olmadan kurulmuş bir oda, çevresel varyasyon için bir kontrol olarak her deneye dahil edilmelidir. Farklı tedaviler (mutant, vahşi tip, sinek) içeren odalar deneyler arasında döndürülmelidir.
14. Monte edilmiş odaları, musluklar açıkken su banyosundaki bir rafa yerleştirin (Şekil 1E).
    NOT: Sirkadiyen varyasyonu önlemek için, burada açıklanan tüm deneyler için banyoya 9:30 ile 9:50 saatleri arasında odalar yerleştirildi.
15. Muslukları açık bırakın (Kolu musluklara paralel tutun).
    NOT: Musluklara su girmemesine dikkat edin.
16. Musluklar açıkken odaların yaklaşık 30 dakika dengelenmesine izin verin.
    NOT: Hazne dengelenirken, elektronik aksamı bağlayın ve aşağıda açıklandığı gibi veri toplamayı ayarlayın.

3. Denetleyicileri ve bilgisayarı kurma

1. O₂ jeneratörlerine akım sağlayan anahtarların KAPALI konumda olduğundan emin olun (konektörden uzakta; Şekil 1D).
2. Her denetleyici kutusunu kullanılabilir bir Evrensel seri veri yolu (USB) bağlantı noktasına takın.
   NOT: Başka bir yerde açıklanan kontrol ünitelerinin yapımı ve programlanması¹².
3. 6 iletkenli kablolar kullanarak kontrolörleri respirometre odalarına bağlayın.
4. Denetleyicilerin organik ışık yayan diyot (OLED) ekranlarının (Şekil 1D) çevresel parametreleri gösterip göstermediğini kontrol edin.
5. Kontrolör üzerindeki anahtarı kullanarak O₂ jeneratörlerini kısaca açın (Şekil 1D).
   1. Akım değeri sıfırdan 35 ila 55 mA arasına yükselirse, kontrolör ve oda deneylere hazırdır.
6. Aşağıda açıklandığı gibi, denetleyiciler tarafından hangi COM bağlantı noktalarının kullanıldığını belirleyin.,
   1. Microsoft Windows'ta Başlat simgesine tıklayın.
   2. Ayarlar simgesine tıklayın.
   3. Bluetooth ve Cihazlar'ı tıklayın.
   4. Denetleyicilerin ve COM bağlantı noktalarının aygıt listesinde göründüğünden emin olun.
7. Masaüstünde PuTTY'yi açın ve aşağıda açıklandığı gibi respirometrenin her kanalı için bir günlük dosyası oluşturun.
   NOT: PuTTY, COM bağlantı noktaları aracılığıyla bilgisayara veri aktarmak için kullanılan ücretsiz bir güvenli kabuk ve telnet istemcisidir.
   1. "Seri hat" kutusuna bağlantı noktasının numarasını yazarak bir denetleyici için COM bağlantı noktasını seçin (Şekil 2A).
   2. Günlüğe kaydetme'ye tıklayın.
   3. "Oturum günlüğü"nde Yazdırılabilir Çıktı'yı seçin (Şekil 2B).
   4. Günlük Dosyası Adı altında, Gözat'ı tıklatın.
   5. Tercih edilen klasörde, açıklayıcı bilgiler içeren bir dosya adı oluşturun (örneğin, tarih, tür, COM bağlantı noktası numarası).
   6. Kaydet'i tıklayın.
   7. Aç'a tıklayın. Günlüğe kaydedilen virgülle ayrılmış verileri gösteren bir pencere açılacaktır (Şekil 2C).
   8. Deneme için kullanılan diğer tüm denetleyiciler için tekrarlayın. Her COM bağlantı noktasına giriş ayrı bir pencere olarak görünecektir (Şekil 2D).

4. Deneyleri çalıştırma

1. Hazneler 30 dakika dengelendikten sonra, muslukları kapatarak kapatın.
2. Sabit bir ortam sağlamak için banyoyu ve odaları polistiren köpük kutu ile örtün.
3. Bir saat daha dengelenmesine izin verin.
4. Kontrol kutusundaki anahtarı kullanarak her odanın O₂ jeneratörüne giden akımı açın.
5. O₂ jeneratörleri etkinleştirildiğinde, basıncın önceden ayarlanmış KAPALI basınca yükseldiğinden emin olun.
   NOT: Bu deney serisinde "KAPALI" basınç olarak atmosfer basıncının biraz üzerinde olan 1017 hPa kullanılmıştır. Ortam basıncına dönüş, odalardan gaz sızıntısını gösterecektir. Ayrıca, ortam barometrik basıncından bağımsız olarak deneylerde aynı basıncın kullanılmasına izin verir. "AÇIK" basınç 1016 hPa idi, yani O₂ jeneratörü etkinleştirilmeden önce basıncın yalnızca 1 hPa düşmesi gerekiyordu. Bu, Drosophila'da_O2 tüketimini ölçmek için yeterli hassasiyet sağladı. Bir oda "KAPALI" ayarına basınçlandırıldığında, akım sıfıra düşmelidir.
6. Denemenin 3 saat veya daha uzun süre çalışmasına izin verin.
   NOT: Yüksek sıcaklıklarda daha yüksek V_O2 , daha kısa deney sürelerine izin verebilir. Ekipmanın çalıştığından emin olmak için ara sıra izleyin, ancak odaların yakınında sıcaklık kararlılığını etkileyebilecek aşırı aktiviteden kaçının.

5. Bitirme deneyi

1. Tüm kontrolörlerde O₂ jeneratörlerini kapatın.
   NOT: Önce odalar açıkken O₂ jeneratörlerini çalıştırmaktan kaçının.
2. Odaların mührünü açmak için muslukları açın.
3. Son bir taban çizgisi sağlamak için PuTTY pencerelerini 5-15 dakika daha açık bırakın.
4. Her denetleyici için PuTTY penceresini kapatın ve kayıtları sonlandırın.
   NOT: Tüm deneyler 16:50 ile 17:10 arasında sona erdi.
5. Sensörleri kablolardan ayırın.
6. Odaları kuru rafa taşıyın.
7. Sensör fişlerini bölmelerden birer birer çıkarın.
8. O₂ jeneratörlerini ayırın ve tüp rafına yerleştirin.
9. Sensör tapasındaki gresi silin ve rafta saklayın.
10. Hazne bağlantılarındaki gresi temizleyin ve sinek ve soda kireçli tüpleri çıkarın.
11. Anestezi, CO 2 ile her tüpte sinekler_, bir ağırlık teknesine dokunun ve bir mikro terazide tartın.
    1. Her tüp için sineklerin ağırlığını ve sayısını kaydedin.
12. Sinekleri atın veya ek prosedürler için bir kenara koyun.
13. Kartuşlardaki soda kirecini atık kabına boşaltın.
14. O₂ jeneratörünü açın ve CuS04 çözeltisini atık kabına atın.
    1. Elektrotları ve tüpü arıtılmış suyla durulayın.
    2. Kurutma için tüp raflarını yerleştirin.

6. Yük transfer verilerinin analizi

1. Verileri, her kayıt ayrı bir çalışma sayfası içerecek şekilde bir elektronik tabloya virgülle ayrılmış metin olarak içe aktarın.
2. O₂ jeneratörünün her darbesi için akım ve zaman verilerini kaydedin. Hazne basınçlandırıldıktan sonraki ilk darbeden başlayarak, her akım darbesinin başlangıç ve bitiş zamanını (sıra numaraları olarak) kaydedin. Bu, akım sıfırın üzerine çıktığında (genellikle yaklaşık 45-50 mA'ya) sıfırın üzerindeki son satıra kadar olan satır numarasıdır.
3. Aşağıdaki verileri kaydetmek için çalışma sayfasında bir tablo oluşturun:
   1. Darbe sırasındaki ortalama akım genliği: = ORTALAMA([ilk darbe satırı]:[son darbe satırı]) her darbe için (mevcut sütundan).
   2. Darbe süresi: ([Son darbe satırı] - [ilk darbe satırı[-bir satır]])/her darbe için 1000 (milisaniye cinsinden süre sütunundan).
   3. Toplam deney süresi: [son darbenin başlangıcındaki süre] - [hazne basınçlandırıldıktan sonra ilk darbenin sonundaki süre] (dakika cinsinden süre sütunundan).
4. Ardından her darbe için yük transferini (Q) hesaplayın (ortalama akım X süresi)
5. Toplam Yükü (Q_tot) hesaplamak için tüm darbelerden gelen yükü toplayın.

7._O2 tüketiminin analizi

1. Tüm veriler için yeni bir elektronik tablo oluşturun ve her oda için aşağıdakileri girin veya hesaplayın:
   1. Q_tot (toplam ücret)
   2. Benler (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL O₂ (= mol × 22413 mL / mol)
   4. Toplam süre (yukarıdaki veri analizinden)
   5. mL ^min-1 (= ml_{O2 ÷} toplam süre)
   6. Gram cinsinden ağırlık (deneyden sonra ölçülen sinekler uyuşturulur ve tartılır)
   7. mL min-1 g-1 (= mL ^min-1 gram cinsinden ÷ ağırlığı)
   8. mL/h/g (yukarıdaki × 60)
   9. mg/sinek (= sineklerin ağırlığı ÷ sinek sayısı)
   10. μL sinek-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ sinek sayısı).
2. Her tedavi için verileri tablo haline getirin (örn. genotip)
3. ANOVA, t-testi veya Mann-Whitney u-testi ¹³ kullanarak tedavileri karşılaştırın.

Sonuçlar

Respirometre kontrolörünün basınç ve akım çıkışları, Şekil 3A'da bir deneyde bir oda için gösterilmiştir. İlk, uzun akım darbesi, odayı ortam basıncından (yaklaşık 992 hPa) önceden ayarlanmış 1017 hPa'lık KAPALI eşiğine kadar basınçlandırdı. Sinekler O 2 ve CO 2 tükettikçe, basınç 1016 hPa'lık AÇIK eşiğine ulaşana kadar yavaşça azaldı ve bu da O₂ jeneratörü aracılığıyla akımı etkinleştirdi. Gösterilen örn...

Tartışmalar

Yukarıdaki prosedür, elektronik bir kulometrik mikrorespirometre kullanılarak D. Melanogaster'de O2 tüketiminin ölçümünü göstermektedir. Yabani tip D. melanogaster'de _O2 tüketimi için elde edilen veriler, diğerleri tarafından bildirilenden biraz daha düşük olmasına rağmen, çeşitli yöntemler kullanılarak önceki yayınların çoğunda açıklanan aralıklar içindeydi (Tablo 1) ^3,6.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers