מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

Summary

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O₂ שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O₂ לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

Abstract

מיקרו-רספירומטריה קולומטרית היא שיטה פשוטה וזולה למדידת צריכת O₂ של אורגניזמים קטנים תוך שמירה על סביבה יציבה. מיקרו-רספירומטר קולומטרי מורכב מתא אטום שבו O 2 נצרך וה- CO₂ המיוצר על ידי האורגניזם מוסר על ידי מדיום סופג. ירידת הלחץ כתוצאה מכך מפעילה ייצור אלקטרוליטי O 2, וכמות O₂ המיוצרת נמדדת על ידי רישום כמות המטען המשמש ליצירתו. במחקר הנוכחי הותאמה השיטה לדרוזופילה מלנוגסטר שנבדקה בקבוצות קטנות, כאשר רגישות המכשיר ותנאי הסביבה מותאמים ליציבות גבוהה. כמות O₂ הנצרכת על ידי זבובי בר במנגנון זה עקבית עם זו שנמדדה על ידי מחקרים קודמים. צריכת O₂ ספציפית למסה על ידי מוטנטים של TASK, שהם קטנים יותר וידועים כפחות פעילים, לא הייתה שונה מקבוצת ביקורת קונגנית. עם זאת, הגודל הקטן של מוטנטים CASK הביא לירידה משמעותית בצריכת O₂ על בסיס זבוב. לכן, המיקרו-רספירומטר מסוגל למדוד את צריכת O₂ ב-D. melanogaster, יכול להבחין בהבדלים צנועים בין גנוטיפים, ומוסיף כלי רב-תכליתי למדידת קצב חילוף החומרים.

Introduction

היכולת למדוד קצב חילוף חומרים חיונית להבנה מלאה של אורגניזם בהקשר הסביבתי שלו. לדוגמה, יש צורך למדוד את קצב חילוף החומרים כדי להבין את תפקידו בתוחלת החיים¹, את תפקיד הדיאטה בחילוף החומרים², או את הסף ללחץ היפוקסי³.

ישנן שתי גישות כלליות למדידת קצב חילוף החומרים⁴. קלורימטריה ישירה מודדת את הוצאת האנרגיה ישירות על ידי מדידת ייצור חום. קלורימטריה עקיפה מודדת את ייצור האנרגיה באמצעים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מדידה ספירומטרית של צריכת O 2 (V_O2), ייצור CO₂ או שניהם. למרות שקלורימטריה ישירה יושמה על אקטורמות קטנות, כולל Drosophila melanogaster⁵, רספירומטריה היא פשוטה יותר מבחינה טכנית ונפוצה יותר.

מספר צורות של רספירומטריה שימשו בהצלחה למדידת קצב חילוף החומרים בטבע ובמוטציה D. melanogaster וסיפקו תובנה לגבי ההשפעות המטבוליות של טמפרטורה⁶, סביבה חברתית 3, תזונה ^{3,7 והפרעות} נוירו-התפתחותיות⁸. אלה נופלים לשני סוגים, אשר משתנים במידה ניכרת בעלות ובמורכבות. מנומטריה היא^ה-9,10 הפשוטה והזולה ביותר^, שבה הזבובים מוכנסים לתא אטום המכיל סופג_CO2 ומחובר באמצעות נימים דקים למאגר נוזלים. כאשר O 2 נצרך ו- CO₂ נספג, הלחץ בחדר יורד ונוזל נשאב לתוך הנימים. הנפח המלא בנוזל של הנימים הוא אפוא פרופורציונלי ל- V_O2. גרסאות משוכללות יותר, המפצות על הכוח המופעל על ידי הנוזל בנימים, שימשו גם על D. melanogaster¹. למנומטריה יש את היתרונות של היותה פשוטה וזולה, אך מכיוון שהיא רגישה ללחץ, דורשת תנאי סביבה קבועים. יתר על כן, מכיוון שנצרך O 2 אינו מוחלף, הלחץ החלקי של O₂ (P_O2) יורד בהדרגה בתוך החדרים.

רספירומטריה באמצעות ניתוח גז משמשת באופן קבוע גם עבור D. melanogaster. במקרה זה, גזים נדגמים במרווחי זמן קבועים מחדרים אטומים המכילים זבובים ונשלחים לאנלייזר אינפרא אדום ^2,6,11. לסוג זה של מכשיר יש את היתרונות שהוא זמין מסחרית, הוא פחות רגיש לתנאי הסביבה, וגזים מתחדשים במהלך הדגימה כך ש- P_O2 נשאר יציב. עם זאת, הציוד יכול להיות יקר ומורכב לתפעול.

מיקרו-רספירומטר^{קולומטרי 12} שפותח לאחרונה מספק חלופה זולה, רגישה ויציבה למערכות קיימות. בפועל, אורגניזם ממוקם לתוך תא אטום שבו הוא צורך O 2 ואת CO₂ נשוף מוסר על ידי חומר סופג, וכתוצאה מכך ירידה נטו בלחץ החדר. כאשר הלחץ הפנימי יורד לסף מוגדר מראש (ON-threshold), הזרם מועבר דרך מחולל אלקטרוליטי O₂, ומחזיר את הלחץ לסף שני (OFF-threshold) העוצר אלקטרוליזה. העברת מטען על פני מחולל O 2 עומדת ביחס ישר לכמות O 2 הנדרשת ללחץ מחדש על התא ולכן ניתן להשתמש בה כדי למדוד את O₂ הנצרך על ידי האורגניזם⁴. השיטה רגישה מאוד, מודדת V O2 במדויק, וההחלפה הקבועה של O₂ יכולה לשמור על P_O2 ברמה כמעט קבועה במשך שעות או ימים.

המיקרו-רספירומטר הקולומטרי המשמש במחקר זה משתמש בחיישן אלקטרוני רב-מודאלי (לחץ, טמפרטורה ולחות). החיישן מופעל על ידי מיקרו-בקר המזהה שינויים קטנים בלחץ ומפעיל דור_{O 2} כאשר מגיעים לסף לחץ נמוך¹². מכשיר זה מורכב מחלקי המדף, ניתן להשתמש בו עם מגוון רחב של תאים וסביבות ניסוי, ושימש בהצלחה לבחינת ההשפעות של מסת הגוף והטמפרטורה על החיפושית Tenebrio molitor. במחקר הנוכחי, המיקרו-רספירומטר הותאם למדידת צריכת O₂ ב- D. melanogaster, שיש לו כ -1% מהמסה של T. molitor. רגישות המנגנון הוגברה על ידי הפחתת הסף להפעלת דור_{O 2} , והיציבות הסביבתית שופרה על ידי ביצוע ניסויים באמבט מים מבוקר טמפרטורה ועל ידי שמירה על לחות בתוך התאים ברמה של 100% או קרוב לכך.

חלבון CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), חלק ממשפחת הקינאזות הגואנילטות הקשורות לקרום (MAGUK), הוא פיגום מולקולרי בקומפלקסים רב-חלבוניים שונים, ומוטציות ב-CASK קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות בבני אדם וב-D. melanogaster^13,14. מוטציה בת קיימא של D. melanogaster, CASK^Δ18, משבשת את הפעילות של נוירונים דופמינרגיים 15 ומפחיתה את רמות הפעילות ביותר מ-50% בהשוואה לבקרות קונגניות^14,16. בגלל רמות הפעילות הנמוכות יותר של מוטציות CASK ותפקידם של קטכולאמינים בוויסות חילוף החומרים¹⁷ שיערנו שקצב חילוף החומרים הסטנדרטי שלהם, ולכן צריכת O₂, יופחתו באופן דרמטי בהשוואה לבקרות.

צריכת O₂ נמדדה ב-CASK^Δ18 ובקונגנרים הפראיים שלהם, w(ex33). קבוצות של זבובים הוכנסו לתאי רספירומטריה, צריכת O 2 נמדדה, צריכת O₂ חושבה והתבטאה הן על בסיס מסה ספציפית והן על בסיס זבוב. המנגנון תיעד V_O2 בזבובי בר שהיה עקבי עם מחקרים קודמים, והוא יכול היה להבדיל בין צריכת O₂ לכל זבוב של זבובי בר לבין צריכת מוטציות CASK לכל זבוב.

Protocol

1. גידול ואיסוף זבובים

1. יש לשמור על זבובים בטמפרטורה של 25°C בבקבוקונים צרים המכילים מזון דרוזופילה סטנדרטי.
   הערה: גודל הדגימה עבור כל גנוטיפ צריך לכלול לפחות תשעה עותקים משוכפלים, שכל אחד מהם מורכב מתא רספירומטר יחיד המכיל 15-25 זבובים, המוגדרים כמתואר להלן.
2. מעבירים את הזבובים כל 2-3 ימים.
3. מרדימים זבובים עם_CO2, אוספים קבוצות של 15-25 זכרים מכל גנוטיפ, ומניחים כל קבוצה בבקבוקוני מזון טריים ללא שמרים.
   הערה: זכרים שימשו כדי להפחית את השונות עקב מצב הרבייה. השיטה חלה על שני המינים.
4. אפשרו לזבובים להתאושש ב-25°C למשך 24 שעות לפחות.
   הערה: בזמן הניסוי, הזבובים צריכים להיות בני 1-4 ימים. ניתן להגדיר את תדירות האוספים המתוארת בשלב 1.3 כך שתצמצם את טווח הגילאים של הזבובים.

2. התקנה והרכבה של תא רספירומטר

1. הפעל את אמבט המים והגדר אותו לטמפרטורה הרצויה לניסוי.
   הערה: הניסויים להלן נערכו ב 25 ° C באמצעות 50 מ"ל צינורות Schlenk כמו תאים. יש להרכיב רכיבים כפי שמוצג באיורים 1A, 1B ו-1C.
2. נקו היטב את חיבורי הזכוכית הטחונים של התאים ותקעי החיישנים על-ידי ריסוס אתנול 70% על מגבון מעבדה (לא ישירות על המפרק) וניגוב אבק ושומן ישן מתקע החיישן (איור 1A). נגבו אתנול עם מגבון מעבדה טרי.
3. הניחו חתיכת גליל כותנה ספוג במים מטוהרים בקוטר 1 ס"מ לתחתית התא כדי לייצב את הלחות.
   1. מוסיפים מספיק מים (~ 0.5 מ"ל) כדי ליצור בריכה קטנה בתחתית גליל הכותנה.
4. נגבו את כל המים שנשפכו על מפרק החדר.
5. העבירו את הזבובים לצינורות פוליפרופילן מסומנים באמצעות משפך.
   1. חבר את הצינור עם גליל כותנה.
      הערה: הצינורות מורכבים ממבחנה מפוליפרופילן בנפח 5 מ"ל, גזוז לאורך 5.5 ס"מ ומחורר בסכין חמה כדי לאפשר חילופי אוויר חופשיים עם תא הניסוי. הרדמה CO₂ ידועה כגורמת להפרעות מטבוליות, ולכן זבובים מועברים ללא הרדמה הדורשת טיפול רב יותר כדי למנוע את אובדן הזבובים.
6. הוסיפו צינור מאוורר אחד עם זבובים לכל תא רספירומטר (על גבי כותנה רטובה).
7. מלאו את מחסניות הסודה ליים (4-5 כדורים לכל צינור) והניחו אותן על החלק העליון של הצינור המכיל זבובים בתוך התא.
   הערה: מחסניות סודה ליים מורכבות מצינורות צנטריפוגות של 800 מיקרוליטר המחוררים 4-5 פעמים באמצעות מקדחה חשמלית.
8. מלא גנרטורים O₂ בתמיסת נחושת גופרתית רוויה (CuSO₄) מתחת לרמה של חורי אוורור
   הערה: O₂ גנרטורים מורכבים מצינורות צנטריפוגות עם מכסה בורג עם 4 חורים שנקדחו מתחת לחוטים. אלקטרודות פלטינה (Pt) ונחושת (Cu) מולחמות למחבר בעל שני פינים, מוכנסות לחורים שנקדחו במכסה ומודבקות באפוקסי. אלקטרוליזה של CuSO₄ מייצרת את O₂ הנצרך על ידי האורגניזם הניסיוני. CuSO₄ רעיל לחסרי חוליות, יש להימנע מנזילות או דליפה ולנקות מיד.
9. חבר את מחולל O₂ המלא למחבר שני פינים בתקע החיישן.
   הערה: קתודה נחושת חייב להתחבר עם הפלט השלילי של הבקר ואת אנודת פלטינה לחוט חיובי. קשרים הפוכים יגרמו לכישלון הניסוי.
10. הניחו שתי טפיחות קטנות של שומן סיליקון שקוף משני הצדדים של מפרק הזכוכית הטחונה של תקע החיישן.
11. הכנס את התקע לתא וסובב את התקע (או התא) בלחץ מתון כדי לפזר את השומן במפרק.
    1. נגבו את עודפי השומן במגבון מעבדה.
12. הצמד פלסטיק Keck מהדק על המפרקים כדי לאבטח תקעים בתאים. התא המורכב צריך להיראות כמו איור 1C.
13. חזור על השלבים לעיל עבור מספר התאים המשמשים לניסוי היום.
    הערה: מספר התאים שניתן להקליט מוגבל על-ידי מספר החדרים, הבקרים וכניסות ה-USB הזמינים למחשב. בניסויים הנוכחיים, שבעה תאים הופעלו בדרך כלל במקביל. זבובי ניסוי כגון מוטנטים צריכים להיות מותאמים לבקרות מתאימות. תא הבנוי באופן זהה אך ללא זבובים צריך להיכלל בכל ניסוי כבקרה לשונות סביבתית. תאים המכילים טיפולים שונים (מוטנטיים, wildtype, no-fly) צריכים להיות מסובבים בין ניסויים.
14. הכניסו תאים מורכבים למתלה באמבט המים עם סטופקוקים פתוחים (איור 1E).
    הערה: כדי למנוע שינויים צירקדיים, תאים הוכנסו לאמבטיה בין השעות 9:30 ל-9:50 בבוקר עבור כל הניסויים המתוארים כאן.
15. השאירו סטופקוקים פתוחים (השאירו את הידית מקבילה לסטופקוק).
    הערה: היזהר לא לאפשר למים להיכנס לסטופקוקים.
16. אפשרו לתאים להתאזן עם סטופקוקים פתוחים למשך כ-30 דקות.
    הערה: כאשר התא מאוזן יתר על המידה, חבר את האלקטרוניקה והגדר רכישת נתונים כמתואר להלן.

3. הגדרת בקרים ומחשב

1. ודא שהמתגים המספקים זרם לגנרטורים O₂ נמצאים במצב OFF (הרחק מהמחבר; איור 1D).
2. חבר כל קופסת בקר ליציאת אפיק טורי אוניברסלי (USB) זמינה.
   הערה: בנייה ותכנות של יחידות בקר המתוארות במקום אחר¹².
3. חבר בקרים לתאי ספירומטר באמצעות כבלים בעלי 6 מוליכים.
4. בדקו שצגי הדיודה פולטת האור האורגני (OLED) של הבקרים (איור 1D) מציגים פרמטרים סביבתיים.
5. הפעילו לזמן קצר גנרטורים O₂ באמצעות המתג של הבקר (איור 1D).
   1. אם הערך הנוכחי עולה מאפס ל בין 35 ל 55 mA, הבקר והתא מוכנים לניסויים.
6. קבע אילו יציאות COM נמצאות בשימוש על-ידי הבקרים, כמתואר להלן.,
   1. לחץ על סמל התחל ב- Microsoft Windows.
   2. לחץ על סמל הגדרות .
   3. לחץ על Bluetooth והתקנים.
   4. ודא שהבקרים ויציאות ה-COM שלהם מופיעים ברשימת ההתקנים.
7. פתח את PuTTY בשולחן העבודה והגדר קובץ יומן עבור כל ערוץ של ה- respirometer כמתואר להלן.
   הערה: PuTTY הוא לקוח מעטפת מאובטחת ו- Telnet ללא תשלום המשמש להעברת נתונים למחשב באמצעות יציאות COM.
   1. בחר יציאת COM עבור בקר על-ידי הקלדת מספר היציאה בתיבה "קו טורי" (איור 2A).
   2. לחץ על Logging.
   3. בחר פלט להדפסה ב"רישום הפעלות" (איור 2B).
   4. תחת שם קובץ יומן רישום, לחץ על עיון.
   5. בתיקייה של הבחירה, צור שם קובץ המכיל מידע תיאורי (לדוגמה, תאריך, מין, מספר יציאת COM).
   6. לחץ על שמור.
   7. לחץ על פתח. ייפתח חלון המציג רישום נתונים המופרדים באמצעות פסיקים (איור 2C).
   8. חזור על הפעולה עבור כל הבקרים האחרים הנמצאים בשימוש עבור הניסוי. הקלט לכל יציאת COM יופיע כחלון נפרד (איור 2D).

4. הרצת ניסויים

1. לאחר שהתאים התאזן למשך 30 דקות, אטמו אותם על ידי סגירת סטופקוקים.
2. כסו את האמבטיה והתאים בקופסת קצף פוליסטירן כדי לשמור על סביבה יציבה.
3. אפשר לאזן עוד שעה.
4. הפעל את הזרם לגנרטור O₂ של כל תא באמצעות המתג בתיבת הבקר.
5. לאחר הפעלת הגנרטורים O₂ , ודא שהלחץ עולה ללחץ OFF מוגדר מראש.
   הערה: 1017 hPa, שהוא מעט מעל הלחץ האטמוספרי, שימש כלחץ "OFF" בסדרת ניסויים זו. חזרה ללחץ הסביבה תצביע על דליפה של גז מהתאים. יתר על כן, הוא מאפשר להשתמש באותו לחץ על פני ניסויים ללא קשר ללחץ ברומטרי הסביבה. לחץ "ON" היה 1016 hPa, כלומר הלחץ היה צריך לרדת רק 1 hPa לפני שהגנרטור O₂ הופעל. זה סיפק רגישות מספקת למדידת צריכת O₂ בדרוזופילה. ברגע שתא נלחץ להגדרת "OFF", הזרם אמור לרדת לאפס.
6. תן לניסוי לרוץ במשך 3 שעות או יותר.
   הערה: V_O2 גבוה יותר בטמפרטורות גבוהות יכול לאפשר זמני ניסוי קצרים יותר. יש לפקח מדי פעם כדי לוודא שהציוד מתפקד, אך להימנע מפעילות מוגזמת בקרבת התאים שעלולה להשפיע על יציבות הטמפרטורה.

5. ניסוי גמר

1. כבה גנרטורים O₂ בכל הבקרים.
   הערה: בצע תחילה כדי להימנע מהפעלת גנרטורים O₂ כאשר התאים פתוחים.
2. פתח את הסטופקוק כדי לפתוח את החדרים.
3. השאירו את חלונות PuTTY פתוחים למשך 5-15 דקות נוספות כדי לספק קו בסיס סופי.
4. סגור את חלון PuTTY עבור כל בקר, סיום הקלטות.
   הערה: כל הניסויים הסתיימו בין 16:50 ל-17:10.
5. נתק חיישנים מכבלים.
6. העבירו את התאים למתלה יבש.
7. הסר את תקעי החיישנים אחד בכל פעם מהחדרים.
8. נתק את הגנרטורים O₂ והנח אותם במדף הצינורות.
9. נגבו את השומן מתקע החיישן והשאירו אותו בארון התקשורת.
10. נקו שומן ממפרקי התא והסירו צינורות עם זבובים וסודה ליים.
11. מרדימים זבובים בכל צינור עם_CO2, מקישים על סירת משקולות ושוקלים על מיקרו-איזון.
    1. רשום את המשקל ומספר הזבובים עבור כל צינור.
12. השליכו זבובים או הניחו אותם בצד להליכים נוספים.
13. יש להשליך סודה ליים מהמחסניות למיכל הפסולת.
14. פתח את הגנרטור O₂ והשלך את פתרון CuSO₄ למיכל הפסולת.
    1. יש לשטוף אלקטרודות וצינורית במים מטוהרים.
    2. הניחו את מתלי הצינור לייבוש.

6. ניתוח נתוני העברת חיובים

1. יבא נתונים כטקסט מופרד באמצעות פסיקים לגיליון אלקטרוני, כאשר כל רשומה מהווה גליון עבודה נפרד.
2. רשום את נתוני הזרם והזמן עבור כל פעימה של מחולל O₂ . החל מהפעימה הראשונה לאחר הפעלת לחץ על התא, רשום את שעת ההתחלה ושעת הסיום (כמספרי שורות) של כל פעימת זרם. זהו מספר השורה כאשר הזרם עולה מעל אפס (בדרך כלל לכ- 45-50 mA) לשורה האחרונה שהיא מעל אפס.
3. צור טבלה בגליון העבודה כדי לתעד את הנתונים הבאים:
   1. משרעת הזרם הממוצעת במהלך הדופק: = AVERAGE([שורה ראשונה של פולס]:[שורה אחרונה של פולס]) עבור כל פולס (מהעמודה הנוכחית).
   2. משך פעימה: ([שורה אחרונה של דופק] - [שורה ראשונה של פולס[-שורה אחת]])/1000 עבור כל פולס (מהזמן בעמודה אלפיות השנייה).
   3. זמן ניסוי כולל: [זמן בתחילת הפעימה האחרונה] - [זמן בסוף הפעימה הראשונה לאחר לחץ התא] (מטור הזמן בדקות).
4. לאחר מכן חשב העברת מטען (Q) עבור כל פעימה (משך זרם X ממוצע)
5. סכם את החיוב מכל הפעימות כדי לחשב את החיוב הכולל (Q_tot).

7. ניתוח של צריכת O₂

1. הגדר גיליון אלקטרוני חדש עבור כל הנתונים והזן או חשב את הפרטים הבאים עבור כל תא:
   1. Q_tot (חיוב כולל)
   2. שומות (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. מ"ל O₂ (= שומות × 22413 מ"ל/מול)
   4. סה"כ זמן (מתוך ניתוח הנתונים לעיל)
   5. mL ^min-1 (= ml O₂ ÷ זמן כולל)
   6. משקל בגרמים (זבובים מורדמים ונשקלים שנמדדו לאחר הניסוי)
   7. mL min-1 ^g-1 (= mL ^min-1 ÷ משקל בגרמים)
   8. mL/h/g (הנ"ל × 60)
   9. מ"ג/זבוב (= משקל הזבובים ÷ מספר הזבובים)
   10. μL fly-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ מספר הזבובים).
2. טבול נתונים עבור כל טיפול (גנוטיפ, למשל)
3. השווה טיפולים באמצעות ANOVA, t-test או Mann-Whitney u-test ¹³.

תוצאות

הלחץ ותפוקות הזרם של בקר הרספירומטר מוצגים עבור תא אחד בניסוי אחד באיור 3A. פעימת הזרם הארוך הראשונה לחצה על התא מלחץ הסביבה (כ-992 hPa) לסף OFF שנקבע מראש של 1017 hPa. כאשר הזבובים שצרכו O 2 ו-CO 2 נספגו, הלחץ ירד לאט עד שהגיע לסף ON של 1016 hPa, אשר הפעיל זרם דרך מחולל O₂. בדוגמ...

Discussion

ההליך לעיל מדגים מדידה של צריכת O₂ ב- D. Melanogaster באמצעות מיקרו-רספירומטר קולומטרי אלקטרוני. הנתונים שהתקבלו עבור צריכת O₂ במלנוגסטר מסוג D פראי היו בטווח שתואר ברוב הפרסומים הקודמים בשיטות מגוונות (טבלה 1), אם כי נמוכים במקצת מאלה שדווחו על ידי אחרים ^3,6

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers