電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定

要約

電量呼吸法は、小さな生物の代謝率を測定するのに理想的です。本研究においてショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に適応させた場合、測定された_O2消費量は、以前の研究によって野生型D.melanogasterについて報告された範囲内であった。CASK変異体によるハエ当たりの_O2消費量は、より小さく、活性が低く、野生型よりも有意に低かった。

要約

電量マイクロレスピロメトリーは、安定した環境を維持しながら、小さな生物の_O2消費量を測定するための簡単で安価な方法です。電量マイクロレスピロメーターは、O₂が消費され、生物によって生成された_CO2が吸収媒体によって除去される気密チャンバーで構成されています。 得られた圧力低下は電解O2生成を誘発し、生成に使用された電荷量を記録することにより、生成した_O2の量を測定する。本研究では、この方法を小グループで試験したショウジョウバエのメラノガスターに適合させ、装置の感度と環境条件を高い安定性のために最適化しました。この装置で野生型ハエが消費する_O2の量は、以前の研究によって測定された量と一致しています。CASK変異体による質量特異的_O2消費は、より小さく、活性が低いことが知られており、コンジェニックコントロールと変わらなかった。しかし、CASK変異体のサイズが小さいため、ハエ当たりの_O2消費量が大幅に減少しました。したがって、マイクロレスピロメーターは、D. melanogasterの_O2消費量を測定することができ、遺伝子型間のわずかな違いを区別することができ、代謝率を測定するための汎用性の高いツールを追加します。

概要

代謝率を測定する能力は、環境的文脈における生物を完全に理解するために重要です。例えば、寿命¹における食事の役割、代謝における食事の役割²、低酸素ストレスの閾値³を理解するためには、代謝率を測定する必要があります。

代謝^率の測定には、2つの一般的なアプローチがあります4。直接熱量測定は、熱産生を測定することにより、エネルギー消費量を直接測定します。間接熱量測定は、他の手段、多くの場合、O₂ 消費量(V_O2)、_CO2 生産、またはその両方の呼吸測定を介してエネルギー生産を測定します。直接熱量測定は、 ショウジョウバエのmelanogaster⁵を含む小さな外温動物に適用されていますが、スピロメトリーは技術的により単純で、より一般的に使用されています。

野生型および変異体D. melanogasterの代謝率を測定するために、いくつかの形態のスピロメトリーが成功裏に使用され、体温⁶、社会環境3、食事^3,7、および神経発達障害⁸の代謝効果に関する洞察が得られました。これらは 2 つのクラスに分類され、コストと複雑さが大きく異なります。マノメトリーは最も単純で最も安価な^9,10であり、ハエはCO₂吸収剤を含み、薄いキャピラリーを介して液体リザーバーに接続されている密閉チャンバーに入れられます。O₂が消費され、_CO2が吸収されると、チャンバー内の圧力が低下し、流体がキャピラリーに引き込まれます。したがって、キャピラリーの流体で満たされた体積は_{VOに比例します}2。毛細血管内の流体によって加えられる力を補正する、より精巧なバージョンもD. melanogaster¹で使用されています。マノメトリーには、シンプルで安価であるという利点がありますが、圧力に敏感であるため、一定の環境条件が必要です。また、消費されたO2は置換されないため、チャンバー内のO2(_PO2)の分圧は徐々に低下する。

ガス分析を用いた呼吸法は、D. melanogasterにも定期的に使用されています。この場合、ガスは、ハエを含む密閉チャンバーから一定の間隔でサンプリングされ、赤外線分析装置^に送られる2,6,11。このタイプの装置には、市販されており、環境条件の影響を受けにくく、サンプリング中にガスがリフレッシュされるため、P_O2が安定しているという利点があります。ただし、機器は高価で操作が複雑になる可能性があります。

最近開発された電量マイクロレスピロメータ¹²は、既存のシステムに代わる安価で高感度かつ安定した代替手段を提供する。実際には、生物はO₂を消費する気密チャンバーに入れられ、呼気された_CO2は吸収性材料によって除去され、チャンバー圧力の正味の低下をもたらします。内圧が予め設定された閾値(ON閾値)まで低下すると、電解_O2発生器に電流が流れ、圧力を第2の閾値(OFF閾値)に戻して電気分解を停止する。O2発生器を横切る電荷移動は、チャンバを再加圧するのに必要なO2の量に正比例し、したがって、生物⁴によって消費される_O2を測定するために使用することができる。この方法は感度が高く、VO₂を正確に測定し、_{O 2}の定期的な交換により、数時間または数日間、P_O2をほぼ一定のレベルに維持できます。

この研究で使用された電量マイクロレスピロメーターは、マルチモーダル(圧力、温度、湿度)電子センサーを採用しています。センサは、圧力のわずかな変化を検出し、低圧閾値に達するとO2生成を作動させるマイクロコントローラによって動作する₁₂。この装置は既製の部品から組み立てられ、さまざまなチャンバーや実験環境で使用でき、カブトムシテネブリオモリターの体重と温度の影響を調べるのに成功しています。本研究では、マイクロレスピロメーターは、T. molitor の質量の約 1% を有する D. melanogaster の_{O 2} 消費量を測定するように適合されています。O2生成を活性化する閾値を小さくすることで装置の感度を高め、温度管理された水槽で実験を行い、チャンバー内の湿度を100%近くに維持することで環境安定性を高めました。

膜関連グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ファミリーの一部であるCASK(カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ)タンパク質は、さまざまな多タンパク質複合体の分子足場であり、KASKの変異はヒトおよびD. melanogasterの神経発達障害と関連している^13,14。生存可能なD.メラノガスター変異体であるCASK^Δ18は、ドーパミン作動性ニューロンの活性を阻害し15、コンジェニックコントロールと比較して活性レベルを50%以上低下させる^14,16。KASK変異体の活性レベルの低下と代謝調節におけるカテコールアミンの役割¹⁷のために、我々はそれらの標準代謝率、したがってO₂消費量が対照と比較して劇的に減少すると仮定した。

O₂ 消費量は、CASK^Δ18 およびそれらの野生型同族体 w(ex33) で測定されました。ハエのグループをスピロメトリーチャンバーに入れ、O 2消費量を測定し、O₂消費量を計算し、質量比ベースとハエあたりベースの両方で発現させた。この装置は、野生型ハエのV O2を記録し、これは以前の研究と一致しており、野生型ハエとKASK変異ハエのハエあたりの_O2消費量を区別することができました。

プロトコル

1.ハエの飼育と収集

1. 標準的な ショウジョウバ エの餌が入った狭いバイアルでハエを25°Cに維持します。
   注:各遺伝子型のサンプルサイズは、少なくとも9回の反復で構成され、それぞれが15〜25匹のハエを含む単一の呼吸計チャンバーで構成され、以下に説明するように設定する必要があります。
2. 2〜3日ごとにハエを移します。
3. CO2でハエを麻酔し、各遺伝子型の15〜25人の男性のグループを収集し、各グループを新鮮な酵母のない食品バイアルに入れます。
   注:男性は、生殖状態による変動を減らすために使用されました。この方法は男女ともに適用されます。
4. ハエを25°Cで少なくとも24時間回復させます。
   注:実験時までに、ハエは1〜4日齢になっているはずです。ステップ1.3で説明した収集頻度は、ハエの年齢範囲を狭めるために設定できます。

2.呼吸計チャンバーのセットアップと組み立て

1. ウォーターバスをオンにして、実験に必要な温度に設定します。
   注:以下の実験は、50 mLのシュレンクチューブをチャンバーとして使用して25°Cで行いました。コンポーネントは、 図1A、1B、および1Cに示すように組み立てます。
2. チャンバーとセンサープラグのすりガラスの接合部を徹底的に清掃するには、70%エタノールを実験室用ワイプ(接合部に直接スプレーするのではなく)にスプレーし、センサープラグからほこりや古いグリースを拭き取ります(図1A)。新しい実験室用ワイプでエタノールを拭き取ります。
3. 精製水に浸した1cmの綿ロールをチャンバーの底に置き、湿度を安定させます。
   1. 十分な水(~0.5 mL)を加えて、ロール綿の底に小さなプールを作ります。
4. チャンバーの接合部にこぼれた水を拭き取ります。
5. 漏斗を使用して、ラベル付きのポリプロピレンチューブにハエを移します。
   1. チューブを綿ロールで塞ぎます。
      注:チューブは、長さ5.5 cmにトリミングされた5 mLのポリプロピレン製試験管で構成されており、実験チャンバーと空気を自由に交換できるようにホットナイフで穴が開いています。CO2麻酔は代謝異常を引き起こすことが知られているため、ハエは麻酔なしで移送され、ハエを失わないように細心の注意を払う必要があります。
6. ハエの入った換気チューブを各呼吸計チャンバー(濡れた綿の上)に1本追加します。
7. ソーダライムカートリッジ(チューブあたり4〜5ペレット)を充填し、チャンバー内のハエを含むチューブの上部に置きます。
   注:ソーダライムカートリッジは、電動ドリルで4〜5回穴あけされた800μLの遠心分離管で構成されています。
8. O₂ 発生器に飽和硫酸銅(CuSO₄)溶液を通気孔のレベルより下に充填します
   注:O₂ 発電機は、ねじ山の下に4つの穴が開けられたスクリューキャップ遠心分離管で構成されています。白金(Pt)電極と銅(Cu)電極を2ピンコネクタにはんだ付けし、キャップに開けた穴に挿入し、エポキシで貼り付けます。CuSO₄ の電気分解は、実験生物によって消費されるO₂ を生成する。CuSO₄ は無脊椎動物に有毒であり、こぼれや漏れを避け、すぐにクリーンアップします。
9. 充填された_O2 ジェネレーターをセンサープラグの2ピンコネクタに接続します。
   注意: 銅カソードはコントローラの負出力に接続し、白金アノードをプラス線に接続する必要があります。接続が逆になっていると、実験が失敗します。
10. センサープラグのすりガラスジョイントの反対側に、透明なシリコングリースを2つ小さなたたきます。
11. プラグをチャンバーに挿入し、プラグ(またはチャンバー)を適度な圧力で回転させて、ジョイントにグリースを広げます。
    1. 余分なグリースをラボ用ワイプで拭き取ります。
12. プラスチック製のケッククランプをジョイントにスナップして、チャンバーにプラグを固定します。組み立てられたチャンバーは 図1Cのようになります。
13. その日の実験に使用したチャンバーの数について、上記の手順を繰り返します。
    メモ: 記録できるチャンバーの数は、使用可能なチャンバー、コントローラー、およびコンピューターへのUSB入力の数によって制限されます。本実験では、通常、7つのチャンバーを並列に実行しました。ミュータントなどの実験的なハエは、適切な対照と一致させる必要があります。ハエのいないチャンバーを同じように設定し、環境変動のコントロールとして各実験に含める必要があります。異なる処理(変異型、野生型、飛行禁止)を含むチャンバーは、実験間でローテーションする必要があります。
14. 組み立てたチャンバーを、活栓を開いた状態でウォーターバスのラックに入れます(図1E)。
    注:概日変動を避けるために、ここで説明するすべての実験では、午前9時30分から9時50分の間にチャンバーを浴槽に入れました。
15. 活栓は開いたままにします(ハンドルを活栓と平行に保ちます)。
    注意: 活栓に水が入らないように注意してください。
16. 栓を開いた状態でチャンバーを約30分間平衡化させます。
    注意: チャンバーが平衡化されている間に、電子機器を接続し、以下の説明に従ってデータ取得を設定します。

3.コントローラーとコンピューターのセットアップ

1. O₂ 発電機に電流を供給するスイッチがオフの位置にあることを確認してください(コネクタから離れています。 図1D)。
2. 各コントローラボックスを使用可能なユニバーサルシリアルバス(USB)ポートに接続します。
   注:他の場所で説明されているコントローラーユニットの構築とプログラミング¹².
3. 6芯ケーブルを使用して、コントローラーを呼吸計チャンバーに接続します。
4. コントローラの有機発光ダイオード(OLED)ディスプレイ(図1D)に環境パラメータが表示されていることを確認します。
5. コントローラーのスイッチを使用して、_O2 発電機を短時間オンにします(図1D)。
   1. 電流値がゼロから35〜55mAに増加すると、コントローラーとチャンバーは実験の準備が整います。
6. コントローラがどのCOMポートを使用しているかを確認します。次の手順に従います。
   1. Microsoft Windowsの [スタート ]アイコンをクリックします。
   2. [設定]アイコンをクリックします。
   3. [Bluetoothとデバイス]をクリックします。
   4. コントローラとそのCOMポートがデバイスのリストに表示されていることを確認します。
7. デスクトップでPuTTYを開き、以下で説明するように、呼吸計の各チャンネルのログファイルを設定します。
   注:PuTTYは、COMポートを介してコンピュータにデータを転送するために使用される無料のセキュアシェルおよびTelnetクライアントです。
   1. [Serial line](シリアルライン)ボックスにポート番号を入力して、コントローラのCOMポートを選択します(図2A)。
   2. 「 ログ」をクリックします。
   3. 「セッションログ」で「印刷可能な出力」を選択します(図2B)。
   4. 「ログ・ファイル名」で、「 参照」をクリックします。
   5. 選択したフォルダに、説明情報(日付、種、COMポート番号など)を含むファイル名を作成します。
   6. 「 保存」をクリックします。
   7. 「 開く」をクリックします。ウィンドウが開き、カンマ区切りのデータが記録されます(図2C)。
   8. 実験に使用している他のすべてのコントローラーについても同じ手順を繰り返します。各COMポートへの入力は、個別のウィンドウとして表示されます(図2D)。

4. 実験の実行

1. チャンバーが30分間平衡状態になったら、活栓を閉じて密閉します。
2. 浴槽と浴室を発泡スチロールの箱で覆い、安定した環境を維持します。
3. さらに1時間平衡化します。
4. コントローラーボックスのスイッチを使用して、各チャンバーの_O2 発生器に電流を流します。
5. O₂ 発生器が作動したら、圧力が事前に設定されたOFF圧力まで上昇することを確認します。
   注:この一連の実験では、大気圧をわずかに上回る1017hPaを「OFF」圧力として使用しました。周囲圧力に戻ると、チャンバーからガスが漏れていることを示します。さらに、周囲気圧に関係なく、実験全体で同じ圧力を使用できます。「オン」の圧力は1016hPaであり、_O2 発生器が作動する前に圧力が1hPa下がるだけで済むことを意味した。これにより、ショウジョウバエの_O2 消費量を測定するのに十分な感度が得られました。チャンバーが「OFF」設定に加圧されると、電流はゼロに低下します。
6. 実験を3時間以上実行します。
   注:高温でV_O2 を高くすると、実験時間を短縮できます。機器が機能していることを確認するために時々監視しますが、温度安定性に影響を与える可能性のあるチャンバーの近くで過度の活動を避けてください。

5. 仕上げ実験

1. すべてのコントローラーの_O2 ジェネレーターをオフにします。
   注意: チャンバーが開いている間に_O2 ジェネレーターを運転しないように、最初に実行してください。
2. 活栓を開いてチャンバーのシールを解除します。
3. PuTTYウィンドウをさらに5〜15分間開いたままにして、最終的なベースラインを提供します。
4. 各コントローラーの PuTTY ウィンドウを閉じ、録画を終了します。
   注:すべての実験は午後4時50分から5時10分の間に終了しました。
5. センサーをケーブルから外します。
6. チャンバーをドライラックに移動します。
7. センサープラグをチャンバーから一度に1つずつ取り外します。
8. O₂ ジェネレーターを外し、チューブラックに置きます。
9. センサープラグからグリースを拭き取り、ラックに保管します。
10. チャンバージョイントからグリースを取り除き、ハエとソーダライムでチューブを取り外します。
11. CO2で各チューブに麻酔をかけ、ウェイトボートを叩き_、 マイクロ天びんで重さを量ります。
    1. 各チューブの重量とハエの数を記録します。
12. ハエを捨てるか、追加の手順のために取っておきます。
13. カートリッジからソーダライムを廃棄物容器に捨てます。
14. O₂発生器を開き、CuSO4溶液を廃液容器に廃棄します。
    1. 電極とチューブを精製水ですすいでください。
    2. チューブラックを置いて乾燥させます。

6. 電荷移動データの解析

1. データをコンマ区切りのテキストとしてスプレッドシートにインポートし、各レコードが個別のワークシートで構成されます。
2. O₂ 発生器の各パルスの現在および時間データを記録します。チャンバーを加圧した後の最初のパルスから開始し、各電流パルスの開始時刻と終了時刻を(行番号として)記録します。これは、電流がゼロ(通常は約45〜50mA)を超え、ゼロを超える最後の行まで行ったときの行番号です。
3. ワークシートに表を作成して、次のデータを記録します。
   1. パルス中の平均電流振幅:= AVERAGE([パルスの最初の行]:[パルスの最後の行])、各パルス(現在の列から)。
   2. パルス幅: ([パルスの最終行] - [パルスの最初の行[-1行]])/1000 (ミリ秒単位の時間列から)。
   3. 合計実験時間:[最後のパルスの開始時の時間] - [チャンバー加圧後の最初のパルスの終了時の時間](分列の時間から)。
4. 次に、各パルス(平均電流X時間)の電荷移動(Q)を計算します
5. すべてのパルスの電荷を合計して、総電荷量(Q_tot)を計算します。

7._O2 消費量の分析

1. すべてのデータに対して新しいスプレッドシートを設定し、各チャンバーについて以下を入力または計算します。
   1. Q_tot (合計料金)
   2. ほくろ(= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL O₂ (= モル × 22413 mL/mol)
   4. 合計時間(上記のデータ分析から)
   5. mLの^min-1 (=_mlO2 ÷合計時間)
   6. グラム単位の重量(麻酔をかけ、実験後に測定したハエの重量を量る)
   7. mL min-1 g-1 (= mL ^min-1 ÷ 重量 (グラム単位)
   8. mL/h/g(上記×60)
   9. mg/fly (= ハエの重量÷ハエの数)
   10. μL fly-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ ハエの数)。
2. 各治療のデータを表にする(遺伝子型など)
3. 分散分析、t検定、またはMann-Whitneyのu検定 ¹³を使用して処理を比較します。

結果

呼吸計コントローラの圧力と電流の出力は、1つの実験における1つのチャンバーについて図3Aに示されています。最初の長電流パルスは、チャンバーを周囲圧力(約992hPa)から事前に設定されたOFFしきい値の1017hPaまで加圧しました。ハエがO2を消費し、_CO2が吸収されると、圧力はゆっくりと低下し、ON閾値の1016hPaに達すると、_O2発生器を通る電流が活性化さ?...

ディスカッション

上記の手順は、電子電量マイクロレスピロメーターを使用したD.メラノガスターにおける_O2消費量の測定を示しています。野生型D.melanogasterにおける_O2消費の結果のデータは^{、他の研究者}によって報告されたものよりやや低いものの、多様な方法(表1)を用いた以前のほとんどの出版物に記載されている範囲内であった^3,6

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers