Medición del consumo de O2 en Drosophila melanogaster mediante microrrespirometría coulométrica

Resumen

La respirometría coulométrica es ideal para medir la tasa metabólica de pequeños organismos. Cuando se adaptó para Drosophila melanogaster en el presente estudio, el consumo de O₂ medido estuvo dentro del rango reportado para D. melanogaster de tipo salvaje en estudios previos. El consumo de_O2 por mosca por parte de los mutantes CASK, que son más pequeños y menos activos, fue significativamente menor que el de los mutantes salvajes .

Resumen

La microrrespirometría coulométrica es un método sencillo y económico para medir el consumo de_O2 de organismos pequeños mientras se mantiene un entorno estable. Un microrrespirómetro culombométrico consiste en una cámara hermética en la que se consume_O2 y el CO₂ producido por el organismo se elimina mediante un medio absorbente. La disminución de presión resultante desencadena la producción electrolítica de_O2 , y la cantidad de_O2 producida se mide registrando la cantidad de carga utilizada para generarla. En el presente estudio, el método se ha adaptado a Drosophila melanogaster probado en pequeños grupos, con la sensibilidad del aparato y las condiciones ambientales optimizadas para una alta estabilidad. La cantidad de_O2 consumida por las moscas silvestres en este aparato es consistente con la medida por estudios previos. El consumo de O₂ específico de masa por parte de los mutantes CAST , que son más pequeños y se sabe que son menos activos, no fue diferente de los controles congénitos. Sin embargo, el pequeño tamaño de los mutantes CASK resultó en una reducción significativa en el consumo de O₂ por mosca. Por lo tanto, el microrrespirómetro es capaz de medir el consumo de_O2 en D. melanogaster, puede distinguir diferencias modestas entre genotipos y agrega una herramienta versátil para medir las tasas metabólicas.

Introducción

La capacidad de medir la tasa metabólica es crucial para una comprensión completa de un organismo en su contexto ambiental. Por ejemplo, es necesario medir la tasa metabólica para comprender su papel en la esperanza de vida¹, el papel de la dieta en el metabolismo² o el umbral de estrés hipóxico³.

Existen dos enfoques generales para medir la tasa metabólica⁴. La calorimetría directa mide directamente el gasto energético midiendo la producción de calor. La calorimetría indirecta mide la producción de energía a través de otros medios, a menudo a través de la medición respirométrica del consumo de O2 (V_O2), la producción de_CO2 o ambos. Aunque la calorimetría directa se ha aplicado a ectotermos pequeños, incluida Drosophila melanogaster⁵, la respirometría es técnicamente más simple y se usa con mayor frecuencia.

Varias formas de respirometría se han utilizado con éxito para medir la tasa metabólica en D. melanogaster salvaje y mutante y han proporcionado información sobre los efectos metabólicos de la temperatura⁶, el entorno social 3, la dieta ^{3,7 y los} trastornos del neurodesarrollo⁸. Estos se dividen en dos clases, que varían considerablemente en costo y complejidad. La manometría es la más simple y menos costosa ^9,10, en la que las moscas se colocan en una cámara sellada que contiene un absorbente de_CO2 y que está conectada a través de un capilar delgado a un depósito de fluido. A medida que se consume_O2 y se absorbe CO₂, la presión en la cámara disminuye y el líquido se introduce en el capilar. Por lo tanto, el volumen lleno de líquido del capilar es proporcional al V_O2. En D. melanogaster¹ también se han utilizado versiones más elaboradas, que compensan la fuerza ejercida por el fluido en el capilar. La manometría tiene la ventaja de ser simple y económica, pero, debido a que es sensible a la presión, requiere condiciones ambientales constantes. Además, debido a que el O 2 consumido no se reemplaza, la presión parcial de O₂ (P_O2) disminuye gradualmente dentro de las cámaras.

La respirometría mediante análisis de gases también se utiliza regularmente para D. melanogaster. En este caso, los gases se muestrean a intervalos regulares de cámaras selladas que contienen moscas y se envían a un analizador infrarrojo 2,6,11. Este tipo de aparato tiene la ventaja de que está disponible comercialmente, es menos sensible a las condiciones ambientales y los gases se renuevan durante el muestreo para que el P_O2 permanezca estable. Sin embargo, el equipo puede ser costoso y complejo de operar.

Un microrrespirómetro coulométrico¹² desarrollado recientemente proporciona una alternativa económica, sensible y estable a los sistemas existentes. En la práctica, un organismo se coloca en una cámara hermética donde consume_O2 y el CO₂ exhalado es eliminado por un material absorbente, lo que resulta en una disminución neta de la presión de la cámara. Cuando la presión interna disminuye a un umbral preestablecido (umbral ON), la corriente pasa a través de un generador electrolítico de_O2, devolviendo la presión a un segundo umbral (umbral OFF) deteniendo la electrólisis. La transferencia de carga a través del generador de O2 es directamente proporcional a la cantidad de_O2 requerida para volver a presurizar la cámara y, por lo tanto, se puede utilizar para medir el O₂ consumido por el organismo⁴. El método es altamente sensible, mide el O2 con precisión y el reemplazo regular del O2 puede mantener el_O2 en un nivel casi constante durante horas o días.

El microrrespirómetro coulométrico utilizado en este estudio emplea un sensor electrónico multimodal (presión, temperatura y humedad). El sensor es operado por un microcontrolador que detecta pequeños cambios en la presión y activa la generación de O₂ cuando se alcanza un umbral de baja presión¹². Este aparato se ensambla a partir de piezas listas para usar, se puede utilizar con una amplia variedad de cámaras y entornos experimentales, y se ha empleado con éxito para examinar los efectos de la masa corporal y la temperatura en el escarabajo Tenebrio molitor. En el presente estudio, el microrrespirómetro se ha adaptado para medir el consumo de_O2 en D. melanogaster, que tiene aproximadamente el 1% de la masa de T. molitor. La sensibilidad del aparato se ha incrementado mediante la reducción del umbral para activar la generación de_O2 , y la estabilidad ambiental se ha mejorado mediante la realización de experimentos en un baño de agua a temperatura controlada y manteniendo la humedad dentro de las cámaras en o cerca del 100%.

La proteína CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), que forma parte de la familia de guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUK), es un andamiaje molecular en diferentes complejos multiproteicos, y las mutaciones en CASK se asocian con trastornos del neurodesarrollo en humanos y en D. melanogaster^13,14. Un mutante viable de D. melanogaster, CASK^Δ18, interrumpe la actividad de las neuronas dopaminérgicas 15 y reduce los niveles de actividad en más del 50% en comparación con los controles congénitos^14,16. Debido a los niveles reducidos de actividad de los mutantes CASK y al papel de las catecolaminas en la regulación del metabolismo¹⁷, planteamos la hipótesis de que su tasa metabólica estándar, y por lo tanto el consumo de_O2, se reduciría drásticamente en comparación con los controles.

El consumo de O₂ se midió en CASK^Δ18 y sus congéneres de tipo salvaje, w(ex33). Se colocaron grupos de moscas en cámaras de respirometría, se midió el consumo de O2, se calculó el consumo de_O2 y se expresó tanto en masa específica como por mosca. El aparato registró V_O2 en moscas de tipo salvaje que era consistente con estudios previos, y pudo diferenciar entre el consumo de O₂ por mosca de las moscas mutantes de tipo salvaje y CAST.

Protocolo

1. Cría y recolección de moscas

1. Mantener las moscas a 25 °C en viales estrechos que contengan alimento estándar para Drosophila .
   NOTA: El tamaño de la muestra para cada genotipo debe comprender al menos nueve réplicas, cada una de las cuales consta de una sola cámara de respirómetro que contiene de 15 a 25 moscas, configurada como se describe a continuación.
2. Transfiere las moscas cada 2-3 días.
3. Anestesiar moscas con CO₂, recolectar grupos de 15 a 25 machos de cada genotipo y colocar cada grupo en viales de alimentos frescos y sin levadura.
   NOTA: Se utilizaron machos para reducir la variabilidad debida al estado reproductivo. El método se aplica a ambos sexos.
4. Deje que las moscas se recuperen a 25 °C durante al menos 24 h.
   NOTA: En el momento del experimento, las moscas deben tener de 1 a 4 días de edad. La frecuencia de las colectas descritas en el paso 1.3 se puede establecer para reducir el rango de edad de las moscas.

2. Configuración y montaje de la cámara del respirómetro

1. Encienda el baño de agua y ajústelo a la temperatura deseada para el experimento.
   NOTA: Los siguientes experimentos se realizaron a 25 °C utilizando tubos Schlenk de 50 ml como cámaras. Los componentes deben ensamblarse como se muestra en las Figuras 1A, 1B y 1C.
2. Limpie a fondo las juntas de vidrio esmerilado de las cámaras y los tapones de los sensores rociando etanol al 70% en una toallita de laboratorio (no directamente sobre la junta) y limpiando el polvo y la grasa vieja del tapón del sensor (Figura 1A). Limpie el etanol con una toallita de laboratorio nueva.
3. Coloque un trozo de rollo de algodón empapado en agua purificada de 1 cm en el fondo de la cámara para estabilizar la humedad.
   1. Agregue suficiente agua (~ 0.5 ml) para formar un pequeño charco en la parte inferior del rollo de algodón.
4. Limpie el agua que se haya derramado sobre la junta de la cámara.
5. Transfiera las moscas a tubos de polipropileno etiquetados con un embudo.
   1. Tape el tubo con un rollo de algodón.
      NOTA: Los tubos consisten en un tubo de ensayo de polipropileno de 5 mL, recortado a 5,5 cm de longitud y perforado con un cuchillo caliente para permitir el libre intercambio de aire con la cámara experimental. Se sabe que la anestesia con CO₂ causa anomalías metabólicas, por lo que las moscas se transfieren sin anestesia, lo que requiere más cuidado para evitar perder las moscas.
6. Agregue un tubo ventilado con moscas en cada cámara del respirómetro (encima del algodón húmedo).
7. Llene los cartuchos de cal sodada (4-5 gránulos por tubo) y colóquelos en la parte superior del tubo que contiene moscas dentro de la cámara.
   NOTA: Los cartuchos de cal sodada consisten en tubos de centrífuga de 800 μL perforados 4-5 veces con un taladro eléctrico.
8. Llene los generadores de O₂ con una solución de sulfato de cobre saturado (CuSO₄) por debajo del nivel de los orificios de ventilación
   NOTA: Los generadores de O₂ consisten en tubos de centrífuga con tapón de rosca con 4 orificios perforados debajo de las roscas. Los electrodos de platino (Pt) y cobre (Cu) se sueldan a un conector de dos pines, se insertan en orificios perforados en la tapa y se fijan con epoxi. La electrólisis del_CuSO4 genera el_O2 consumido por el organismo experimental. El CuSO₄ es tóxico para los invertebrados, evite derrames o fugas y limpie inmediatamente.
9. Conecte el generador de O₂ lleno al conector de dos clavijas en el enchufe del sensor.
   NOTA: El cátodo de cobre debe conectarse con la salida negativa del controlador y el ánodo de platino al cable positivo. Las conexiones invertidas provocarán el error del experimento.
10. Coloque dos pequeñas gotas de grasa de silicona transparente en lados opuestos de la junta de vidrio esmerilado del enchufe del sensor.
11. Inserte el tapón en la cámara y gírelo (o cámara) con una presión moderada para esparcir la grasa en la junta.
    1. Limpie el exceso de grasa con una toallita de laboratorio.
12. Coloque las abrazaderas Keck de plástico en las juntas para asegurar los tapones en las cámaras. La cámara ensamblada debe verse como la Figura 1C.
13. Repita los pasos anteriores para el número de cámaras utilizadas para el experimento del día.
    NOTA: El número de cámaras que se pueden grabar está limitado por el número de cámaras, controladores y entradas USB disponibles en el ordenador. Para los experimentos actuales, normalmente se utilizaron siete cámaras en paralelo. Las moscas experimentales, como las mutantes, deben ser emparejadas con controles apropiados. En cada experimento debe incluirse una cámara configurada de forma idéntica pero sin moscas como control de la variación ambiental. Las cámaras que contienen diferentes tratamientos (mutante, salvaje, no-fly) deben rotarse entre experimentos.
14. Coloque las cámaras ensambladas en una rejilla en el baño de agua con las llaves de paso abiertas (Figura 1E).
    NOTA: Para evitar la variación circadiana, se colocaron cámaras en el baño entre las 9:30 y las 9:50 am para todos los experimentos descritos aquí.
15. Deje las llaves de paso abiertas (mantenga la manija paralela a la llave de paso).
    NOTA: Tenga cuidado de no permitir que entre agua en las llaves de paso.
16. Deje que las cámaras se equilibren con las llaves de paso abiertas durante unos 30 minutos.
    NOTA: Mientras la cámara está equilibrada, conecte los componentes electrónicos y configure la adquisición de datos como se describe a continuación.

3. Configuración de los controladores y la computadora

1. Asegúrese de que los interruptores que suministran corriente a los generadores de O₂ estén en la posición OFF (lejos del conector; Figura 1D).
2. Conecte cada caja de controladora a un puerto de bus serie universal (USB) disponible.
   NOTA: Construcción y programación de las unidades controladoras descritas en otra parte¹².
3. Conecte los controladores a las cámaras del respirómetro mediante cables de 6 conductores.
4. Compruebe que las pantallas de diodos emisores de luz orgánicos (OLED) de los controladores (Figura 1D) muestren parámetros ambientales.
5. Encienda brevemente los generadores de O₂ usando el interruptor del controlador (Figura 1D).
   1. Si el valor de corriente aumenta de cero a entre 35 y 55 mA, el controlador y la cámara están listos para los experimentos.
6. Determine qué puertos COM están siendo utilizados por los controladores, como se describe a continuación.
   1. Haga clic en el icono Inicio en Microsoft Windows.
   2. Haga clic en el icono Configuración .
   3. Haz clic en Bluetooth y dispositivos.
   4. Asegúrese de que los controladores y sus puertos COM aparezcan en la lista de dispositivos.
7. Abra PuTTY en el escritorio y configure un archivo de registro para cada canal del respirómetro como se describe a continuación.
   NOTA: PuTTY es un shell seguro gratuito y un cliente telnet que se utiliza para transferir datos a la computadora a través de puertos COM.
   1. Seleccione el puerto COM para un controlador escribiendo el número del puerto en el cuadro "Línea serie" (Figura 2A).
   2. Haga clic en Registro.
   3. Seleccione Salida imprimible en "Registro de sesión" (Figura 2B).
   4. En Nombre del archivo de registro, haga clic en Examinar.
   5. En la carpeta de la elección, cree un nombre de archivo que contenga información descriptiva (por ejemplo, fecha, especie, número de puerto COM).
   6. Haga clic en Guardar.
   7. Haga clic en Abrir. Se abrirá una ventana que muestra los datos delimitados por comas que se están registrando (Figura 2C).
   8. Repita el procedimiento para todos los demás controladores que se utilicen para el experimento. La entrada a cada puerto COM aparecerá como una ventana separada (Figura 2D).

4. Realización de experimentos

1. Una vez que las cámaras se hayan equilibrado durante 30 minutos, séllelas cerrando las llaves de paso.
2. Cubra el baño y las cámaras con una caja de espuma de poliestireno para mantener un ambiente estable.
3. Deje que se equilibre durante una hora más.
4. Encienda la corriente del generador de O₂ de cada cámara usando el interruptor en la caja del controlador.
5. Una vez activados los generadores de_O2 , asegúrese de que la presión aumente a la presión de apagado preestablecida.
   NOTA: 1017 hPa, que está ligeramente por encima de la presión atmosférica, se utilizó como presión "OFF" en esta serie de experimentos. El retorno a la presión ambiente indicará una fuga de gas de las cámaras. Además, permite utilizar la misma presión en todos los experimentos, independientemente de la presión barométrica ambiental. La presión de "encendido" era de 1016 hPa, lo que significa que la presión solo necesitaba caer 1 hPa antes de que se activara el generador de_O2 . Esto proporcionó una sensibilidad adecuada para medir el consumo de_O2 en Drosophila. Una vez que una cámara está presurizada a la configuración "OFF", la corriente debe caer a cero.
6. Deje que el experimento se ejecute durante 3 o más h.
   NOTA: Un_V-O2 más alto a temperaturas elevadas puede permitir tiempos de experimento más cortos. Monitoree ocasionalmente para asegurarse de que el equipo esté funcionando, pero evite la actividad excesiva cerca de las cámaras que pueda afectar la estabilidad de la temperatura.

5. Experimento de acabado

1. Apague los generadores de O₂ en todos los controladores.
   NOTA: Haga primero para evitar hacer funcionar los generadores de O₂ mientras las cámaras están abiertas.
2. Abra las llaves de paso para abrir las cámaras.
3. Deje las ventanas de PuTTY abiertas durante otros 5-15 minutos para proporcionar una línea de base final.
4. Cierre la ventana PuTTY de cada controlador, finalizando las grabaciones.
   NOTA: Todos los experimentos terminaron entre las 4:50 y las 5:10 pm.
5. Desconecte los sensores de los cables.
6. Mueva las cámaras a la rejilla seca.
7. Retire los tapones de los sensores de uno en uno de las cámaras.
8. Desconecte los generadores de O₂ y colóquelos en la rejilla de tubos.
9. Limpie la grasa del tapón del sensor y guárdelo en la rejilla.
10. Limpie la grasa de las juntas de la cámara y retire los tubos con moscas y cal sódica.
11. Anesthetize vuela en cada tubo con CO_2, golpea un bote de pesas y pesa en una microbalanza.
    1. Registre el peso y el número de moscas de cada tubo.
12. Deseche las moscas o déjelas a un lado para procedimientos adicionales.
13. Vierta la cal sodada de los cartuchos en el contenedor de desechos.
14. Abra el generador de O₂ y deseche la solución de CuSO₄ en el contenedor de residuos.
    1. Enjuague los electrodos y el tubo con agua purificada.
    2. Coloque las rejillas de tubos para que se sequen.

6. Análisis de los datos de transferencia de carga

1. Importe datos como texto delimitado por comas en una hoja de cálculo, y cada registro comprende una hoja de cálculo independiente.
2. Registre los datos de corriente y tiempo para cada pulso del generador de O₂ . Comenzando con el primer pulso después de que la cámara fue presurizada, registre la hora de inicio y la hora de finalización (como números de fila) de cada pulso actual. Ese es el número de fila cuando la corriente va por encima de cero (generalmente a unos 45-50 mA) a la última fila que está por encima de cero.
3. Haga una tabla en la hoja de trabajo para registrar los siguientes datos:
   1. La amplitud de corriente promedio durante el impulso: = PROMEDIO([primera fila de impulso]:[última fila de impulso]) para cada pulso (de la columna de corriente).
   2. Duración del pulso: ([Última fila de pulsos] - [primera fila de pulsos[-una fila]])/1000 para cada pulso (desde la columna de tiempo en milisegundos).
   3. Tiempo total del experimento: [tiempo al inicio del último pulso] - [tiempo al final del primer pulso después de la cámara presurizada] (a partir de la columna de tiempo en minutos).
4. A continuación, calcule la transferencia de carga (Q) para cada pulso (corriente media X duración)
5. Suma la carga de todos los pulsos para calcular la carga total (Q_tot).

7. Análisis del consumo de_O2

1. Configure una nueva hoja de cálculo para todos los datos e ingrese o calcule lo siguiente para cada cámara:
   1. Q_tot (carga total)
   2. Moles (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL O₂ (= moles × 22413 mL/mol)
   4. Tiempo total (a partir del análisis de datos anterior)
   5. mL ^min-1 (= ml O₂ ÷ tiempo total)
   6. Peso en gramos (moscas anestesiadas y pesadas medidas después del experimento)
   7. mL min-1 g-1 (= mL ^min-1 ÷ peso en gramos)
   8. mL/h/g (la anterior × 60)
   9. mg/mosca (= peso de las moscas ÷ número de moscas)
   10. μL mosca-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ número de moscas).
2. Tabular los datos de cada tratamiento (genotipo, p. ej.)
3. Compare los tratamientos con ANOVA, prueba t o prueba U de Mann-Whitney ¹³.

Resultados

Las salidas de presión y corriente del controlador del respirómetro se muestran para una cámara en un experimento en la Figura 3A. El primer pulso de corriente larga presurizó la cámara desde la presión ambiente (aproximadamente 992 hPa) hasta el umbral de apagado preestablecido de 1017 hPa. A medida que las moscas consumían O2 y se absorbía_CO2, la presión disminuía lentamente hasta alcanzar el umbral de ON de 1016 hPa, que activaba la corriente a través del generador d...

Discusión

El procedimiento anterior demuestra la medición del consumo de_O2 en D. melanogaster utilizando un microrespirómetro coulométrico electrónico. Los datos resultantes para el consumo de_O2 en D. melanogaster de tipo silvestre estuvieron dentro de los rangos descritos en la mayoría de las publicaciones previas utilizando diversos métodos (Tabla 1), aunque algo más bajos que los reportados por otros ^3,6.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers